人类肠道中大约有100万亿个微生物，它们共同组成了一个复杂的群落，其中拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)是最丰富的微生物群[1]。众所周知，肠道菌群不仅影响食物的消化吸收和能量供应，还调节宿主的生理代谢和疾病反应[2-3]。宿主生理代谢受基因和肠道菌群的共同调节。日常饮食可以通过改变肠道菌群的组成、代谢物及代谢功能来影响宿主对大多数慢性病的易感性[4-5]。
多糖由10多个单糖分子通过糖苷键组成，可以从多种天然产物中提取[6]。研究表明，非淀粉多糖可显著改变肠道菌群的组成[4]。虽然非淀粉多糖不能在小肠中直接吸收和消化，但可被微生物转化为短链脂肪酸等具有生物活性的代谢物[7]。ZHAO等[8]发现海参中提取的多糖可促进高脂饮食喂养的小鼠体内乙酸、丁酸和戊酸含量的增加[8]。除了对人体组织的保护作用外，多糖及其代谢物还可以改变肠道微生物的组成，从而发挥益生元作用。然而，多糖种类的不同会对健康小鼠肠道菌群造成不同程度的影响。
普洱茶通常以云南大叶种晒青毛茶为原料，经渥堆发酵、干燥等工艺加工而成[9]，具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗突变、防癌等功能[10]。为更好地了解普洱茶相关生物活性物质，研究多集中在普洱茶中天然活性成分的活性及结构，如多糖、黄酮和多酚类化合物[11-12]。普洱茶多糖(Pu-erh tea polysaccharide，PEP)具有多种生物活性，如抗氧化[9]、抗衰老[11]、抗肥胖[13]及免疫调节作用[14]。目前，关于PEP对肠道菌群的调节研究还鲜见报道。
本研究采用16S rRNA高通量测序技术结合气相色谱鉴定技术对连续35 d接受PEP的健康小鼠粪便中的短链脂肪酸、肠道菌群多样性及组成进行综合分析。最后，利用基于标记基因序列来预测功能丰度(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states，PICRUSt2)软件预测肠道菌群的代谢功能，并确定与脂质代谢相关的微生物，初步探讨了PEP的益生效果。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
材料：普洱生茶，云南程健茶业有限公司；24只雄性无特定病原(specified pathogen free，SPF)级C57BL/6 J小鼠，上海斯莱克实验动物有限责任公司[许可证号：SCXK(粤)2020-0001]。
试剂：乙酸、丁酸、丙酸、戊酸(色谱纯)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；小鼠粪便DNA提取试剂盒，美国MP Biomedicals公司；Q5®高保真DNA聚合酶，英国NEB公司。
1.2 仪器与设备
9560气相色谱仪，美国Agilent公司；MiSeq高通量测序系统，美国Illumina公司。
1.3 实验方法
1.3.1 PEP提取
参考董亮等[15]的方法提取PEP。普洱茶叶经水提、丙酮沉淀、石油醚洗涤、超纯水透析、冷冻干燥得到PEP。PEP由鼠李糖(26.36%)、岩藻糖(5.69%)、阿拉伯糖(12.67%)、甘露糖(5.97%)、葡萄糖(40.77%)和半乳糖(8.54%)等6种单糖组成，分子质量为103 kDa。
1.3.2 动物实验
24只(20±2)g雄性SPF级C57BL/6 J小鼠置于温度20～22 ℃，相对湿度55%～65%的动物实验室中，所有小鼠经过1周的适应后进行实验。24只小鼠随机分为4组(每组6只)：1组为对照组(normal contrast，NC)，每日给予饲料及无菌水(1 mL/10 g体重)，连续35 d；剩下3组分别为低剂量PEP组(low dose PEP，PEP-L)、中剂量PEP组(medium dose PEP，PEP-M)和高剂量PEP组(high dose PEP，PEP-H)，分别每日给予100、200和300 mg/kg体重，连续35 d。每周检测小鼠的体重。最后1次灌胃后，所有小鼠禁食16 h。第2天，收集小鼠粪便，并存储于-80 ℃冰箱中，用于DNA提取。所有动物实验方案及操作均经芜湖职业技术学院动物实验中心伦理委员会批准。
1.3.3 粪便短链脂肪酸
采用气相色谱仪检测短链脂肪酸含量。100 mg小鼠粪便溶解于5 mL超纯水中，依次进行涡旋、超声和离心。保留上清液过0.22 μm水系滤膜后待用。色谱条件：DB-WAX石英毛细柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升温程序：初始温度50 ℃，保持3 min，随后以6 ℃/min升温到120 ℃，以10 ℃/min升温到220 ℃，保持5 min；载气(He)流量1.2 mL/min，分流比10∶1；进样量10 μL；进样口温度230 ℃；检测器温度230 ℃[16]。
1.3.4 粪便DNA提取与16S rRNA高通量测序
使用小鼠粪便DNA提取试剂盒提取粪便微生物DNA。使用NanoDrop 2000型超微量分光光度计测定其溶度和纯度。将合格的DNA委托广州基迪奥生物科技有限公司完成建库及MiSeq双端测序。使用引物338F和806R进行PCR扩增，扩增区域为16S rRNA扩增子的V3～V4区，测序引物为338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。
1.3.5 测序数据处理与统计学分析
微生物组生物信息学分析根据QIIME2(2020.2)流程进行，基于官方教程(https://docs.qiime2.org/2019.4/tutorials/)稍加修改。原始序列数据通过demux插件解复，采用cutadapt插件切除引物，使用DADA2插件对序列进行质量过滤、去噪、合并和去除嵌合体得到扩增序列变异体(amplified sequence variants，ASVs)[17]。通过Silva 138数据库对ASVs进行分类学注释，将不能注释到门水平的ASVs删除。基于ASVs得到分析结果，采用最小抽平的方法，利用diversity plug-in插件对样品进行多样性分析[17]。
基于ASVs的物种组成、主坐标分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)、非加权组平均聚类分析(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)、非度量多维尺度分析(non-metric multidimensional scaling，NMDS)及热图绘制均通过R软件实现。根据代表序列结果，利用PICRUSt2软件[18]对肠道菌群的基因功能进行预测。
所有箱线图均用Graphpad Prism软件绘制。采用SPSS软件进行配对样本t检验分析，P<0.05 时认为具有显著差异。
2 结果与讨论
2.1 PEP对体重的影响
动物实验设计如图1-a所示。所有的小鼠都进行相同的灌胃处理，只是补充不同剂量的PEP。因此，年轻小鼠体重的变化可以直接反映它们身体的异常。小鼠的体重变化如图1-b所示。经过1周环境适应后，所有小鼠的体重均有所不同，但各组间无显著差异(P>0.05)。在实验期间，各组小鼠的体重均呈持续上升趋势，但体重增加趋势在28 d后逐渐减缓，且NC组与其他实验组之间无显著差异(P>0.05)。说明每日食用不同剂量的PEP对小鼠没有明显副作用。
a-动物实验设计示意图；b-小鼠的体重变化
图1 动物实验设计和补充不同浓度PEP 对体重的影响
Fig.1 Animal experiment design and impact of supplementation of different concentration PEP on body weight
2.2 PEP对粪便中短链脂肪酸含量的影响
粪便中短链脂肪酸含量与肠道健康密切相关，图2反映了PEP对小鼠粪便中几种主要短链脂肪酸的影响。相比NC组，各剂量组均会增加粪便中乙酸的含量，但PEP-L组和PEP-M组的增加无显著差异(P>0.05)，而PEP-H组中乙酸含量是NC组的1.3倍(P<0.01)，含量(中位数)可达14.11 mmol/L(图2-a)。乙酸是肠道厌氧菌的代谢产物，主要参与葡萄糖代谢[19]。在连续灌胃PEP 35 d后，PEP-M组和PEP-H组均会显著增加粪便中丙酸和丁酸含量(P<0.05)，尤其是PEP-H组的丙酸和丁酸含量分别是NC组的1.9和2.9倍，丙酸和丁酸含量(中位数)分别可达2.19和2.99 mmol/L(图2-b和2-c)。丙酸可参与并影响胆固醇代谢[20]，而丁酸可为肠上皮细胞提供能量，从而影响免疫细胞的增殖，为宿主提供保护[4]。PEP对戊酸的影响呈现出与乙酸一致的趋势，只有PEP-H组会显著增加粪便中戊酸的含量(图2-d)。此外，相比NC组，PEP-M组和PEP-H组均会显著增加粪便中总短链脂肪酸含量(P<0.05)(图2-e)。上述结果表明，PEP对肠道的影响存在剂量依赖性，300 mg/kg体重的PEP补充35 d，小鼠粪便中4种主要短链脂肪酸的含量显著增加。因此，选择PEP-H组进行后续的肠道菌群分析。
a-乙酸含量；b-丙酸含量；c-丁酸含量；d-戊酸含量；e-总短链脂肪酸含量
图2 PEP对小鼠粪便中短链脂肪酸的影响(n=6)
Fig.2 The effect of PEP on short-chain fatty acids in mouse feces (n=6)
注：*P< 0.05，**P< 0.01(下同)
2.3 PEP对肠道菌群多样性的影响
2.3.1 α多样性
在本研究中，使用物种丰富度、物种多样性和物种均匀度来评估PEP对肠道菌群α多样性的影响，其中物种丰富度用Observed指数和Chao1指数表征，物种多样性用Shannon指数和PD指数表征，物种均匀度用Pielou指数表征。由表1可知，NC组和PEP-H组都具有较高的覆盖率(>0.97)，表明测序结果足以表征肠道菌群的多样性。与NC组相比，PEP-H组具有较高的Observed指数和Chao1指数(P<0.01)，说明PEP-H组具有更丰富的微生物群落。该结果与WU等[19]的研究结果相一致，其发现补充青钱柳多糖可显著增加小鼠肠道菌群的物种丰富度[19]。此外，PEP-H组Shannon指数极显著高于NC组(P<0.01),PD指数显著高于NC组(P<0.05)，而Shannon指数和PD指数对群落丰富度和稀有的ASVs更敏感[19]，说明35 d PEP-H补充会增加小鼠粪便的物种多样性。
表1 PEP对小鼠肠道菌群α多样性的影响
Table 1 The effect of PEP on α diversity of gut microbiota in mice
α多样性指数NCPEP-H覆盖率0.97±0.010.97±0.00Observed指数975.17±132.071 318±165.84∗∗Chao1指数1 134.64±268.431 573.93±376.72∗∗Shannon指数6.98±0.317.62±0.29∗∗PD指数12.74±1.8815.93±2.27∗Pielou指数0.68±0.040.74±0.02∗
注：同行*表示差异显著，**表示差异极显著
基于Pielou指数的物种均匀度分析表明，PEP-H能显著提高肠道菌群的均匀度(P<0.05)。上述结果表明，连续35 d补充300 mg/kg体重的PEP能够增加肠道菌群的α多样性。
2.3.2 β多样性
采用Bray Curtis距离算法和权重UniFrac距离算法将ASVs缩放至距离矩阵中。随后分别使用PCoA和UPGMA聚类分析比较NC组和PEP-H组小鼠粪便中微生物菌群的差异。NC组和PEP-H组粪便群落的PCoA第1主坐标和第2主坐标分别占总变异的53.82%和15.17%(图3-a)，且NC组和PEP-H组在PCoA 1轴上的距离较远，说明PEP-H组和NC组在PCoA 1轴上差异显著。UPGMA分析结果表明，NC组和PEP-H组中微生物群落分布在2个分支上(图3-b)，且组间差异大于组内差异，同样也说明NC组和PEP-H组中微生物群落组成差异显著。此外，在NMDS分析中也观察到类似的结果(图3-c)，与PCoA的结果相一致。这些结果表明，连续35 d补充300 mg/kg体重的PEP能够改变肠道菌群的β多样性。
a-基于权重UniFrac距离的主坐标分析；b-基于Bray Curtis距离的非加权组平均聚类分析；c-基于Bray Curtis距离的非度量多维尺度分析
图3 对照组和PEP-H组小鼠肠道菌群的β多样性(n=6)
Fig.3 The β diversity of gut microbiota in mouse feces between NC and PEP-H group (n=6)
2.4 PEP对肠道菌群物种组成的影响
在门水平上，肠道菌群包括厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门(Proteobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobiota)、放线菌门(Actinobacteriota)、Campilobacterota、Deferribacterota和Desulfobacterota(图4-a)。相比NC组，PEP-H组中拟杆菌门的丰度明显较低，而厚壁菌门、变形菌门、疣微菌门的丰度明显较高。PEP-H组中厚壁菌门与拟杆菌门的比值显著高于NC组(P<0.05)(图4-b)，说明PEP会改变小鼠肠道菌群的组成。这一发现与用植物多糖结合益生菌可增加肠道菌群中厚壁菌门相对丰度，并降低拟杆菌门相对丰度的结果是一致的[21]。在纲水平上，相比NC组，补充PEP可显著增加疣微菌纲(Verrucomicrobiae)和芽孢杆菌纲(Bacilli)的相对丰度，并显著降低拟杆菌纲(Bacteroidia)和弯曲杆菌纲(Campylobacteria)的相对丰度(P<0.05)(图4-c)。在目水平上，选取平均相对丰度最高的20个目进行比较，相比NC组，PEP-H组中丹毒丝菌目(Erysipelotrichales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)和双歧杆菌目(Bifidobacteriales)的相对丰度显著增加，而拟杆菌目(Bacteroidales)、弯曲杆菌目(Campylobacterales)、乳杆菌目(Lactobacillales)和肠杆菌目(Enterobacterales)的相对丰度显著降低(P<0.05)(图4-d)。在科水平上，也选取平均相对丰度最高的20个科进行比较，相比NC组，补充PEP-H组中阿克曼氏菌科(Akkermansiaceae)、丹毒丝菌科(Erysipelothrichaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、Clostridia_UCG_014、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)和理研菌科(Rikenellaceae)的相对丰度显著增加，同时显著降低Muribaculaceae和乳杆菌科(Lactobacillaceae)的相对丰度(P<0.05)(图4-e)。在属水平上，同样也选择平均相对丰度最高的20个属进行比较，与NC组相比，PEP-H组中双歧杆菌属(Bifidobacterium)、粪杆菌属(Faecalibaculum)、乳球菌属(Lactococcus)、拟普雷沃菌属(Alloprevotella)和阿克曼氏菌属(Akkermansia)的相对丰度显著增加，而乳杆菌属(Lactobacillus)和螺杆菌属(Helicobacter)的相对丰度显著降低(P<0.05)(图4-f)。先前的研究表明，喂食含有高直链淀粉的食物可增加小鼠肠道菌群中拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属、阿克曼氏菌属、乳球菌属和拟普雷沃菌属的相对丰度[22-23]。此外，高脂饮食会显著降低小鼠肠道菌群中拟普雷沃菌属的相对丰度[24]。综上可知，PEP-H的补充可改变小鼠肠道菌群的物种组成。
a-门水平上微生物群落的相对丰度；b-厚壁菌门与拟杆菌门的比率；c-纲水平上微生物群落的相对丰度；d-目水平上微生物群落的相对丰度； e-科水平上微生物群落的相对丰度；f-属水平微生物群落的热图分析
图4 对照组和PEP-H组中小鼠肠道菌群的分类组成(n=6)
Fig.4 The taxonomic composition of gut microbiota in mouse feces between NC group and PEP-H group (n=6)
2.5 标志性微生物的鉴定
为进一步确定NC组和PEP-H组的标志性微生物，在研究中进行了线性判别分析效应大小(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)分析和主成分分析(principal component analysis，PCA)。根据LEfSe结果可知，NC组和PEP-H组分别鉴定出7和8个来自不同属水平的标志性微生物(LDA>3.6, P<0.05)(图5-a)。乳杆菌属、Muribaculaceae、杜氏杆菌属(Dubosiella)和螺杆菌属等差异最大的前4个属在NC组中富集，而粪杆菌属、拟普雷沃菌属、阿克曼氏菌属和另枝菌属(Alistipes)等在PEP-H组中富集。根据图5-b可知，NC组和PEP-H组的标志性微生物来自不同的门。乳杆菌科、拟杆菌纲和弯曲杆菌纲是NC组中丰度最高的标志性微生物，而丹毒丝菌目、普雷沃氏菌科、理研菌科、放线菌纲(Actinobacteria)和疣微菌纲是PEP-H组中丰度最高的标志性微生物。普雷沃氏菌科被认为与短链脂肪酸的合成相关，短链脂肪酸的缺乏减弱了其对于肠道黏膜屏障的保护作用，可能导致肠源性内毒素水平增高[25]。在补充茯砖茶的肥胖小鼠中，观察到体重减轻与肠道菌群中乳杆菌属和链球菌属(Streptococcus)的相对丰度下降有关[26]。此外，菊粉可增加肥胖小鼠肠道菌群中阿克曼氏菌属的相对丰度，从而诱导小鼠的减肥[27]。进一步利用PCA在属水平上确定不同属对NC组和PEP-H组差异的贡献。NC组和PEP-H组在PC1轴(79.53%)上显示出明显分离(图5-c)，这与图3的结果是一致的。阿克曼氏菌属、双歧杆菌属、粪杆菌属和螺杆菌属是导致NC组和PEP-H组之间存在显著差异的最主要的属(图5-d)。蛋氨酸限制饮食会增加肥胖小鼠盲肠内容物中有益菌粪杆菌属的丰度及降低有害菌螺杆菌属的丰度，从而增加了盲肠中短链脂肪酸的含量[28]。
a-标志性微生物的LDA效应值柱状图；b-基于LEfSe分析的分类树图；c-主成分分析的样本二维排序图；d-主成分分析的物种载荷图
图5 对照组和PEP-H组中物种差异及差异物种分析(n=6)
Fig.5 Species difference and specific species analysis between NC and PEP-H group (n=6)
2.6 功能预测
将每个样本的16S rRNA测序获得的ASVs序列映射到KEGG通路中，预测在PEP调节下微生物组内代谢功能的变化。图6-a显示了NC组和PEP-H组肠道菌群映射到KEGG数据库中第2级功能通路的相对平均丰度。代谢、环境信息处理和遗传信息处理是肠道菌群最主要的代谢通路，尤其是代谢占整个功能途径相对丰度的51.77%。碳水化合物代谢、氨基酸代谢和能量代谢是最主要的代谢功能，分别占整个KEGG通路相对丰度的15.56%、9.38%和7.68%，而膜转运与复制和修复分别占整个KEGG通路相对丰度的10.23%和10.35%。采用LEfSe分析确定NC组和PEP-H组间具有差异的代谢通路(图6-b)。
a-对照组和PEP-H中代谢通路相对丰度的KEGG分析；b-基于LEfSe分析的代谢通路树图；2-第1级代谢通路； 3-第2级代谢通路；4-第3级代谢通路
图6 对照组和PEP-H组中小鼠肠道菌群代谢功能的预测(n=6)
Fig.6 The prediction of metabolic function within the microbiome in NC and PEP-H groups (n=6)
与NC组相比，PEP-H组在第1级代谢通路中代谢、环境信息处理和人类疾病通路下的相对丰度显著降低，而有机系统通路下的相对丰度显著增加。在第2级代谢通路中，相比NC组，PEP-H组会显著增加氨基酸代谢、能量代谢、其他次生代谢产物生物合成、辅助因子和维生素代谢、消化系统、内分泌系统及免疫系统通路下的相对丰度，而会显著降低脂质代谢与生物降解和代谢通路下的相对丰度。
基于相关性分析探究与脂质代谢通路相关的微生物(图7)。杜氏杆菌属、Escherichia-Shigella、乳杆菌属和Muribaculaceae与酮体的合成和降解、甘油磷脂代谢、亚麻酸代谢、初级胆汁酸代谢及次级胆汁酸代谢呈正相关(P<0.05)，而这些代谢通路则与拟普雷沃菌属呈负相关(P<0.05)。乳球菌属、另枝菌属和罗氏菌属(Roseburia)与亚麻酸代谢、初级胆汁酸代谢和次级胆汁酸代谢呈负相关(P<0.05)。此外，阿克曼氏菌属与不饱和脂肪酸生物合成及类固醇生物合成呈正相关(P<0.05)，与酮体的合成和降解呈负相关(P<0.05)；双歧杆菌属与甘油磷脂代谢和亚麻酸代谢呈负相关(P<0.05)。
图7 属水平微生物与脂质代谢通路的相关性分析
Fig.7 The correlation analysis between microbiota in genus level and lipid metabolism pathways
注：***P<0.001
3 结论
食用PEP 35 d后，小鼠粪便中短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸)含量呈剂量依赖性显著增加。PEP(300 mg/kg体重)可有效增加健康小鼠肠道菌群的多样性，调节某些特定细菌的丰度，促进双歧杆菌、阿克曼氏菌和粪杆菌等益生菌的生长。此外，PEP干预可能有利于肠道菌群的特定代谢功能，如氨基酸代谢、脂质代谢和其他次生代谢产物生物合成。阿克曼氏菌与不饱和脂肪酸生物合成及类固醇生物合成呈正相关，与酮体的合成和降解呈负相关。综上所述，PEP的早期干预有助于改善健康小鼠肠道菌群的组成和代谢功能。
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