酱油是我国传统的发酵调味品，与人们的生活息息相关。酱油发酵是多种微生物共同作用的过程，经过微生物及其酶系的长期作用，赋予了酱油良好的风味[1]。4-乙基愈创木酚(4-ethyl guaiacol, 4-EG)，分子式为C9H12O2，呈发酵香气，微带酚的气息，通常被描述为一种烟熏味和丁香味的物质，存在于日本酱油和中国传统高盐稀态酱油，其香气很受消费者欢迎[2]。4-EG风味阈值极低，其含量相差0.5 mg/L就很容易被感官识别，有文献认为，1～2 mg/L的4-EG便可明显改善酱油的风味品质[3]。因此，4-EG的含量与酱油的品质存在较为密切的关系。
4-EG可以通过化学合成，也可以从天然植物中提取，或者通过生物转化法制备，工业化生产主要是通过化学合成途径进行的[4]。由于人造食品的潜在危害，人们对天然食品的需求持续增长，但是从天然植物中提取4-EG的量非常有限，不能满足日益增长的消费需求[5-6]。而生物催化转化法具有反应条件温和、底物专一性好、工艺环境友好等优点，近年来发展迅速[7-8]。
近些年，有关生物催化转化方式的研究较多。董永胜等[9]发明了一种利用环状芽孢杆菌和酒香酵母菌株发酵产生4-EG的方法。王少磊等[10]从浓香型大曲中筛选到1株产4-EG的菌株。肖澎等[4, 11]探究了阿魏酸(ferulic acid，FA)转化为挥发性酚的途径，由FA转化生成4-EG的途径分为2步：首先FA在脱羧酶的作用下可转化为4-乙烯基愈创木酚(4-vinyl guaiacol，4-VG)，随后4-VG通过还原酶的作用转化为4-EG。SUN等[12]研究了以米糠为原料制备FA粗提液，并利用地衣芽孢杆菌发酵进一步产生4-VG的方法。然而在酱油酿造过程中，利用生物转化产生4-EG的研究目前报道较少，本研究主要对高盐稀态酱油酿造过程中能够产生4-EG的菌株进行筛选、鉴定，并探讨菌株的生长特性，以期为提高传统酱油产品中4-EG的含量奠定相关研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器设备
样品：菌种筛选原料由广东某食品有限公司提供；曲料和酱醪取自制曲车间和发酵缸。
试剂：FA、4-EG，麦克林生化科技有限公司；4-VG，上海阿拉丁试剂有限公司；细菌DNA试剂盒，广东环凯微生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯，广州丛源试剂有限公司。
仪器设备：LDZX-50KBS立式高压蒸汽灭菌锅、DNP-9082生化恒温培养箱，上海博迅医疗生物仪器有限公司；SW-CJ-1FD超净工作台，深圳市永盛旺实业有限公司；THZ-82恒温振荡培养箱，常州恩培仪器有限公司；KH20A台式高速离心机，上海析域仪器设备有限公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；U3000高效液相色谱仪，赛默飞科技有限公司；Agilent 7000C三重串联四级杆气质联用仪，安捷伦科技有限公司；IX73荧光倒置显微镜，奥林巴斯有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 培养基的配制
LB液体培养基：NaCl 0.5 g，酵母膏0.5 g，葡萄糖0.1 g，蛋白胨 1 g，溶于100 mL去离子水，自然pH，121 ℃灭菌20 min。
LB固体培养基：同LB液体培养基配制方法，再加入2%(质量分数)琼脂粉。
发酵培养基：FA 0.1 g，酵母膏1 g，KH2PO4 0.09 g，Na2HPO4 1 g，MgSO4 0.02 g，CaCl2 0.01 g，溶于100 mL蒸馏水，自然pH，121 ℃灭菌20 min。
1.2.2 菌株的分离
分别称取10 g发酵酱醪、发酵成曲，在无菌条件下研磨成粉末加入到250 mL三角瓶中，同时加少数玻璃珠和90 mL生理盐水，在30 ℃，160 r/min条件下振荡20 min制成10-1菌种悬浮液，再用无菌生理盐水将悬液梯度稀释至10-4～10-7。取0.1 mL浓度为10-4～10-7的菌种悬液涂布于LB平板上30 ℃倒置培养24～48 h [13]。
根据菌落的形态特征等挑取单菌落在LB平板上划线，30 ℃培养24 h，得到产4-EG菌株的单克隆。将纯化的菌株接种于LB培养基中，30 ℃、160 r/min振荡培养24 h，置于甘油-20 ℃保藏[14]。
1.2.3 4-EG产生菌株的筛选
从菌株斜面上挑取菌落接至LB液体培养基中，于30 ℃，160 r/min摇床培养24 h制成瓶种。将种子液以5%的接种量(体积分数)接种至发酵培养基，30 ℃、160 r/min振荡培养6 d[15]。
移取发酵液10 mL，加同等体积二氯甲烷，混匀静置5 min，8 000 r/min离心15 min，转移至分液漏斗，待分层后取下层清液，以上操作重复3次，合并萃取液，加5 g无水硫酸钠冷冻过夜除去水分，用韦氏蒸馏柱浓缩至5 mL(60 ℃保持微沸)，氮气吹扫浓缩至2 mL，过0.22 μm有机滤膜，用GC-MS/选择离子监测(selective ion monitoring, SIM)法进行检测分析。根据GC-MS检测结果选取目标菌株进行下一步分析鉴定[16]。
色谱条件：HP-5毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；恒流：1.0 mL/min；分流比15∶1；进样量1 μL；进样口温度250 ℃。升温程序：初温50 ℃，以8 ℃/min升温至100 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升温至170 ℃保持3 min，以15 ℃/min升温到235 ℃，保持4 min，总分析时间29.58 min[17]。
质谱条件：电子电离源，能量70 eV，离子源温度250 ℃，传输线温度240 ℃。定性采用全扫描模式，质量扫描范围m/z 50～500；定量采用SIM，4-EG的特征离子为：m/z 137/152/122[18]。
1.2.4 目标菌株发酵过程各种物质含量的测定
将初筛所得目标菌株活化培养成种子液，接种至发酵培养基，于30 ℃、160 r/min振荡培养12 d，每2 d 取10 mL样品过滤离心后保存至4 ℃冰箱，发酵结束用HPLC检测样品中FA、4-VG及4-EG的相对含量，探究菌株发酵过程中3种物质的含量变化[19]。
HPLC条件：Waters Atlantis®T3反相C18色谱柱 (5 μm×4.6 mm×250 mm)，流动相：A为甲醇，B为1%甲酸水；洗脱程序：0～15 min，100%～48% B；15～20 min，48% B；20～30 min，48%～30% B；30～35 min，30% B；流速为1 mL/min；进样量10 μL；柱温30 ℃；检测波长为0～18 min，320 nm；18～35 min，280 nm。
制定标准曲线：取标准品FA、4-VG、4-EG，溶于甲醇配制质量浓度为100 mg/L的混合标准溶液，依次稀释为：20、40、60、80、100 mg/L。用HPLC测定，甲醇为空白对照，以标准溶液质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标制定标准曲线，建立线性方程[20]。
1.2.5 菌株鉴定
1.2.5.1 形态特征观察
经过发酵实验筛选的目标菌株，将其菌悬液梯度稀释后涂布于LB平板培养基，置于35 ℃恒温箱培养24 h，观察菌体在固体平板上的形状、颜色、黏稠度、透明度等特征，提取单菌落进行革兰氏染色，在荧光倒置显微镜下观察菌体的显微形态[21]。
1.2.5.2 菌株生理生化鉴定
菌株的生理生化实验参考第九版《伯杰氏细菌鉴定手册》及东秀珠所著《常见细菌系统鉴定手册》，主要包括蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、木糖等糖氧化发酵实验，鸟氨酸、精氨酸、赖氨酸等氨基酸脱羧酶实验，过氧化氢酶、脲酶、柠檬酸盐利用、甲基红实验、V-P实验、吲哚实验、淀粉水解、明胶水解、酪素水解等[12]。
1.2.5.3 菌株分子生物学鉴定
用试剂盒提取菌株基因组，采用16S rDNA通用引物，以目标菌株DNA为模板进行PCR扩增。取5 μL PCR扩增产物用于琼脂糖凝胶电泳检测，将检测结果正确的样品送往广州艾基生物技术有限公司测定16S rDNA序列。
测序结果拼接后导入NCBI数据库进行同源性BLAST比对，然后下载比对相似度在99.8%以上的前10个菌种的DNA序列，并利用MEGA-X构建系统发育树，并进行1 000次bootstraps检验计算支持率[10]。
1.2.6 目标菌株生物学特性研究
1.2.6.1 形态特征观察
将目标菌株等量接种到装有10 mL培养基的试管中，分别在不同温度，转速为160 r/min的摇床培养24 h，温度分别为25、28、30、32、35、37、40、42 ℃，空白对照为LB液体培养基，用紫外分光光度计测定600 nm处OD值[13]。
1.2.6.2 生长曲线
将目标菌株等量接种到装有10 mL培养基的试管中，置于30 ℃、160 r/min的摇床振荡培养，分别培养2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 h，将标有相应时间的试管取出，立即放4 ℃冰箱保存，空白对照为LB液体培养基，用紫外分光光度计测定600 nm处OD值。
1.2.6.3 耐盐性
将目标菌株等量接种到不同NaCl浓度的LB液体培养基，在30 ℃、160 r/min振荡培养24 h，NaCl的质量分数分别为1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%、17%、19%，空白对照为LB液体培养基，用紫外分光光度计测定600 nm处OD值[13]。
1.2.7 统计分析
每个实验均设置3次平行，实验数据使用 Microsoft Office Excel 2010处理，实验结果用平均值±标准偏差的形式表示。
2 结果与讨论
2.1 4-EG产生菌株筛选
将菌种原料进行多次稀释涂布培养和划线分离，根据平板上菌落特征初步筛选分离获得10种菌株，根据分离时间顺序给菌株进行编号。将分离到的10株单菌接种到发酵培养基中，32 ℃、160 r/min振荡培养6 d，以4-EG含量为100 mg/L的标准溶液为对照，用GC-MS/SIM法检测发酵样品中的4-EG的含量，检测结果如表1所示。
表1 菌株筛选结果
Table 1 Results of strain screening
菌株编号峰面积/(mAU)4-EG含量/(mg·L-1)G0135 647.25±2 029.150.039±0.002 22G023 139 232.75±12 665.503.47±0.014 G031 609 405.85±8 137.451.78±0.009 G0410 407.18±1 486.740.014±0.002 G0521 324.45±693.100.024±0.000 78G06403 607.40±9 954.440.446±0.011 G07855 922.73±32 434.940.95±0.036 G0825 787 963.84±787 487.8428.49±0.87 G093 994.92±878.880.004±0.000 88G108 344.67±649.030.009±0.000 7
注：表中数值为平均值±标准偏差(n=3)。
由表1可知，菌株G02、G03、G08均可利用发酵培养基中的FA产生4-EG，其中菌株G08的产4-EG能力最强，该菌株发酵产物的4-EG含量可达28.49 mg/L，因此选取该菌株做下一步分析鉴定。
2.2 菌株G08发酵过程各种物质含量测定
2.2.1 标准曲线制作及线性关系考察
标准混合样品的液相色谱图如图1所示
1-FA(17.4 min)；2-4-VG(24.6 min)；3-4-EG(27.2 min)
图1 标准混合样品液相色谱图
Fig.1 Liquid chromatogram of mixed standards
以标准溶液中的物质质量浓度(mg/L)和HPLC标准色谱图峰面积分别为横纵坐标制定标准曲线。FA的回归方程：y=0.952 8x-2.922 1，R2=0.996 6；4-VG的回归方程：y=0.471 8x-0.236 8，R2=0.998 7；4-EG的回归方程：y=0.250 2x-0.463 5，R2=0.998 6。
2.2.2 菌株G08发酵过程物质含量变化
将菌株G08活化培养成种子液，接入发酵培养基中，30 ℃、160 r/min恒温发酵12 d，每2 d取10 mL样品过滤离心后保存至4 ℃冰箱，发酵结束后用HPLC检测不同发酵时段的样品中FA、4-VG及4-EG的相对含量，结果如图2所示。
在菌株G08发酵前期，FA的含量在迅速降低，而4-VG的含量在不断升高，由此表明这一阶段的生物转化反应以FA脱羧生成4-VG为主。从第4天开始FA的含量基本稳定在190 mg/L，与此同时4-VG的含量在第4天达到最高为178 mg/L，随后开始逐渐降低，到第8天稳定在65 mg/L，而4-EG的含量则缓慢升高，且由第8天开始含量增速明显加快，到第12天达到最高为62 mg/L，由此可估算4-EG的摩尔转化率为7.92%。
图2 G08发酵过程中物质含量变化
Fig.2 Changes of substance content during G08 fermentation
2.3 菌株G08的鉴定
2.3.1 形态特征鉴定
菌株G08经生理盐水稀释后涂布在LB平板上，35 ℃培养24 h，观察菌落形态，菌落幼期为乳白色，成熟期为淡黄色，不透明，形状规则，中央隆起，表面黏稠，边缘整齐(图3-a)；在液体培养基中菌体成团，菌液浑浊，可产生菌膜；在显微镜下观察显微形态，菌体为不规则短杆状，革兰氏染色呈阳性，产芽孢(图3-b)。
a-菌落形态；b-显微形态
图3 菌株G08的菌落形态和显微形态
Fig.3 Colony morphology and micromorphology of strain G08
2.3.2 菌株生理生化鉴定
菌株G08的生理生化特性试验结果如表2所示。该菌株可氧化发酵蔗糖、麦芽糖、葡萄糖，发酵过程中产酸但不产气，不能够利用木糖。依据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册(第九版)》的现有菌株特性进行比对，发现菌株G08的生理生化特性与芽孢杆菌属十分相似，可以初步判断为芽孢杆菌，还需通过分子生物学鉴定进一步验证。
表2菌株G08的生理生化特性
Table 2 Biochemical and physiological characters of strain G08
试验项目结果试验项目结果蔗糖 +明胶水解+葡萄糖 +过氧化氢酶+麦芽糖 +脲酶-木糖 -柠檬酸盐+鸟氨酸 -丙酸盐-精氨酸 +硝酸盐还原试验+赖氨酸 -吲哚试验-酪素水解+甲基红试验-淀粉水解+V-P试验+
注：“+”表示试验结果阳性，“-”表示试验结果阴性
2.3.3 菌株的分子生物学鉴定
以菌株G08基因组为模板进行PCR扩增，然后进行电泳试验，电泳检测结果如图4所示，扩增片段分子质量大约在1 200～1 500 bp，条带清晰明亮且不存在非特异性扩增，表示16S rDNA 扩增成功。将扩增产物回收纯化后进行测序，确定该片段的实际长度为1 368 bp。
图4 菌株G08的16S rDNA凝胶电泳图
Fig.4 Gel electrophoresis pattern of PCR amplified product of 16S rDNA from strain G08
将测序结果提交至NCBI 数据库用BLAST程序进行同源性比对，比对结果显示菌株G08与芽孢杆菌属的几个菌种的同源性均达到99.8%，可判定该菌株属于芽孢杆菌属。经多序列同源性分析，得到10个同源性大于99.8%的菌株，用MEGA-X软件构建系统发育树，获得菌株G08的系统发育地位，系统进化树如图5所示。结果表明菌株G08与Bacillus subtilis属于同一分支，综合该菌株的形态特征和生理生化特性，判断该菌株是芽孢杆菌属中的一个种，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，命名为Bacillus subtilis G08。
图5 菌株G08基于16S rDNA序列构建的系统发育树
Fig.5 Phylogenetic tree based on partial 16S rDNA sequences of strain G08
2.4 菌株G08的生物学特性
2.4.1 最适生长温度
由图6可知，菌株G08的最适生长温度为35 ℃，低于35 ℃时，随温度的升高，OD600值缓慢递增；当高于35 ℃时，随温度的升高，OD600值逐渐递减。
图6 菌株G08的最适生长温度
Fig.6 The optimum growing temperature for strain G08
2.4.2 生长曲线
由图7可知，在培养初期(0～10 h)菌株G08生长较为缓慢，为生长迟缓期；培养中期(10～16 h)生长速度明显加快，为对数增殖期；16 h后生长速度开始减缓，到18 h进入稳定期，OD600值基本不发生明显改变。
图7 菌株G08的生长曲线
Fig.7 The growth curve of strain G08
2.4.3 耐盐性
由图8 可知，当NaCl质量分数低于5%时，随着NaCl含量的升高，菌株G08的OD600值呈递增趋势，由此说明适量的NaCl有助于该菌株生长增殖；而NaCl质量分数高于5%时，菌株OD600值明显减小；NaCl质量分数在7%～9%时，菌株还能够正常生长；当NaCl质量分数高于9%时，菌株的生长明显受到抑制；NaCl质量分数高于11%时，菌株基本难以生长，由此可判断菌株G08对NaCl的耐受性为9%。
图8 菌株G08的耐盐性
Fig.8 The salt tolerance of strain G08
3 结论
本研究以FA为主要原料的培养基，以菌株发酵产物中4-EG的含量为参考标准，从传统中式酱油的酱醪、成曲中分离筛选到1株能够将FA转化4-EG的菌株G08，并探究了其转化过程中FA、4-VG及4-EG的含量变化。采用形态观察、生理生化鉴定、16S rDNA序列分析等方法判断该菌株属于枯草芽孢杆菌。该菌株在转化FA成为4-EG的能力上优于其他菌株，4-EG的摩尔转化率可达到7.92%。现已有文献报道一些耐盐酵母和芽孢杆菌有类似的转化能力，但如何将这类菌株与米曲霉、黑曲霉等酱油生产所用的常规菌种综合利用，有效开发麸皮、米糠、甜菜粕等农副产品中的阿魏酸，通过多菌种不同阶段连续发酵的方式提高酱油中4-EG的含量，需要结合生产实践进一步研究。
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