草莓果体柔软，表皮脆弱，在采摘和运输过程中极易造成机械损伤和生物病害，从而失去食用价值[1]。植物精油应用于果蔬采后保鲜，可以显著降低病害的发生，延长果蔬货架期[2-4]。丁香精油本身具有抑菌防腐的作用，但极易挥发，通过微胶囊技术对其包埋，可增加丁香精油的稳定性，并具有一定的缓释效果，既可以解决天然植物精油易挥发的问题，又能将其应用于果蔬保鲜。IGNAICO等[5]将大豆分离蛋白、蒙脱土和丁香精油做成膜，用于金枪鱼的冷藏保鲜；潘小军等[6]发现，0.1%的丁香精油对青霉菌的抑制作用达到100%，损伤接种试验处理4 d的柑橘无腐败现象。但是目前大部分文献报道的是将包合物在果蔬上涂膜保鲜，包合物直接与果蔬接触，植物精油残留的味道会影响消费者的感官体验。
本研究通过β-环糊精制备丁香精油微胶囊，β-环糊精无毒性、可大量生产，包埋精油后不仅可以掩盖精油的味道，同时还能防止精油的氧化[7]，做成粉剂后放入无纺布袋中用于草莓保鲜，利用其挥发性物质的抗菌作用，不需接触果蔬，可替代化学添加剂，有效保障果蔬质量及市场的供应。
1 材料与方法
1.1 实验材料
丁香精油(丁香酚含量为70%)，自制；β-环糊精，天津百世化工有限公司；吐温-80，湖北诺纳科技有限公司；无水乙醇(≥99.5%)，天津大茂化学试剂厂；马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)，上海博微生物科技有限公司；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、葡枝根霉、灰葡萄孢霉、黑曲霉，上海保藏生物技术中心；食品级无纺布袋(9 cm×7 cm)，保定企翔纺织品加工有限公司；PE保鲜袋，25 cm×35 cm，厚度15 μm，宁波新力包装材料有限公司；硕丰草莓，广州市白云区丹丹牛奶草莓园。
1.2 实验设备
Spectrum 100傅里叶变换红外光谱仪，美国PE公司；Mettler tga 2热重分析仪，瑞士梅特勒-托利多集团；Sigma 300扫描电子电镜，卡尔蔡司集团；LF-NMR, NM60纽迈低场核磁共振仪，苏州纽迈分析仪器股份有限公司；艾德堡果实硬度计，漳州市艾德堡食品有限公司；手持折光仪，力辰仪器科技有限公司；生化培养箱，上海叶拓科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 丁香精油抑菌实验
抑菌实验采用滤纸片抑菌法。吸取0.1 mL菌悬液于灭好菌并凝结的PDA上，涂布均匀。用灭菌镊子夹住浸泡在精油中的滤纸片，放在平板中央；细菌抑菌实验，需将平皿倒置放于37 ℃生化培养箱中培养18～24 h；真菌平皿正置放于28 ℃培养箱中培养3～5 d，用十字交叉法量取抑菌圈大小，取平均值，平行3次。
1.3.2 丁香精油微胶囊的制备
量取36 mL的去离子水，在磁力搅拌器上加热到50 ℃时加入6 g β-环糊精，搅拌，加入0.2 mL吐温-80，准备1 mL丁香精油，用无水乙醇将丁香精油按体积比1∶1稀释，用针管逐滴加入丁香精油后，密闭搅拌1.5 h，冷却，放入4 ℃冰箱沉淀24 h，抽滤，40 ℃干燥成粉状[8-9]。
1.3.3 丁香精油微胶囊的性能
1.3.3.1 包埋率
用无水乙醇配制梯度浓度的丁香精油乙醇溶液；用紫外分光光度计进行光谱扫描，确定特征吸收峰在202 nm，绘制丁香精油标准曲线，标准曲线方程为y=0.476 4x+0.130 4,R2=0.998 6。称取0.01 g丁香精油微胶囊粉末，与无水乙醇混合，离心，取上清液，测定其吸光度，按公式(1)计算包埋率：
包埋率
(1)
式中：精油总量为0.01 g丁香精油微胶囊中精油完全被环糊精包埋理论值。
1.3.3.2 扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)
将样品固定在导电胶上，喷金处理，加速电压为3 kV，扫描电镜观察。
1.3.3.3 傅里叶红外光谱
将样品与KBr混合压片后，采用傅里叶红外光谱进行测试，扫描范围4 000～500 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描次数为16。
1.3.3.4 热重测试
称取3～5 mg样品于小坩埚中，放入热重分析仪，热重测试温度50～600 ℃，升温速度10 ℃/min，氮气流速100 mL/h。
1.3.3.5 缓释能力测试
准确称取3份0.500 0 g丁香精油微胶囊粉末于称量瓶中，称取总质量，将称量瓶放入玻璃干燥器中，瓶口倾斜45°，并于28 ℃下放置，在0～10 d，每天测量丁香精油微胶囊粉末与称量瓶的总质量，计算丁香精油微胶囊缓释性能，按公式(2)计算缓释率:
缓释率
(2)
1.3.4 微胶囊对草莓保鲜品质的影响
模仿市场上草莓包装方式，分别称取2、4、6 g丁香精油微胶囊粉末(编号为丁2、丁4、丁6)以及4 g β-环糊精粉末(空白组)，分装于无纺布袋，为便于观测，分别装在含有8颗草莓的托盘中，用PE保鲜袋热封处理，体积约为500 cm3，放置在28 ℃恒温箱中保藏，分别在第1、3、5、6、7、8天进行指标测试，每组平行3次。
1.3.4.1 腐烂率测定
参照陈建中等[10]的方法。
1.3.4.2 硬度测定
用艾德堡硬度计测定草莓的硬度。探头直径5 mm，压距5 mm。取每个测量结果的最大值，重复3次，取平均值[11]。
1.3.4.3 失重率
参照姚军等[12]的方法。
1.3.4.4 核磁共振测定
将待测样品放入样品管中，并放入仪器样品池中进行测试，参数设置为：信号采集点数为539 990，主频率为21，重复采集次数为5 500，回波个数为18 000。
1.3.4.5 可溶性固形物测定
参照金思渊等[13]的方法。
1.4 数据处理
采用Origin Pro 2020进行做图， SPSS Statistics 25 进行数据统计分析。
2 结果与分析
2.1 丁香精油抑菌效果
草莓采后病害主要以灰霉病和炭疽病为主[14]，致病菌以灰葡萄孢霉和黑曲霉为代表，用丁香精油对常见细菌和草莓致病真菌进行抑菌实验，抑菌效果如图1所示，对黑曲霉的抑制效果最佳。
图1 丁香精油抑菌圈直径
Fig.1 Diameter of inhibition zone of clove essential oil
2.2 微胶囊性能表征
2.2.1 扫描电镜
通过计算丁香精油包埋率为60.5%。通过SEM观察β-环糊精与丁香精油微胶囊的形态可知，β-环糊精晶体本身呈菱形或棱柱形，结构厚实，表面平滑，整体性较强[16]。当丁香精油和β-环糊精制成微胶囊后，晶体结构发生变化，β-环糊精菱形晶形消失，微胶囊晶体结构相对β-环糊精变得蓬松，表面粗糙且附着颗粒，与CHEN 等[17]的研究结果相似。
a-β-环糊精；b-丁香精油微胶囊
图2 扫描电镜图
Fig.2 Scanning electron microscopy
2.2.2 红外光谱分析
β-环糊精最明显的峰在1 028.17和3 392.02 cm-1，分别代表—OH和—CO键，—C
C的吸收峰。丁香精油芳香族化合物部分CC伸缩，在1 513.14和1 637.65 cm-1处有尖锐的峰值[18]。环糊精/丁香精油微胶囊的光谱图中，既包含代表β-环糊精的特征吸收峰，又包含丁香精油的芳香族特征峰，但是由于微胶囊中丁香精油含量不多，特征峰受β-环糊精影响，拉伸振动强度有所减弱,红外光谱表明丁香精油微胶囊已经形成。
图3 β-环糊精、丁香精油、丁香精油微胶囊红外光谱图
Fig.3 FT-IR spectra of β-cyclodextrin, clove essential oil, clove essential oil microcapsule
2.2.3 热重分析
热重分析结果如图4所示。第一个失重区域小于100 ℃，β-环糊精和β-环糊精丁香精油包合物均失重，可能是β-环糊精以及丁香精油中的自由水以及易挥发的物质受热损失[19]，在100～300 ℃，β-环糊精失重缓慢，失重速度接近0，而β-环糊精丁香精油包合物失重较快但失重速度小于第一个失重区域，这可能是因为β-环糊精里的水分已经完全蒸发，随着精油持续挥发，丁香精油微胶囊在100～300 ℃这个温度区间出现失重现象；第二个失重区域是由于β-环糊精发生热分解引起的失重，β-环糊精的热分解反应在315.5 ℃开始，到350 ℃结束，之后两者不再受温度的影响而发生变化。
a-TG;b-DTG
图4 丁香精油微胶囊与环糊精的热重图
Fig.4 Clove essential oil microcapsule with cyclodextrin thermogravimetric images
2.2.4 缓释分析
图5为丁香精油微胶囊在28 ℃环境下进行的缓释实验结果，丁香精油微胶囊的缓释率随着时间的增加，缓释速度先增大后逐渐降低，这可能是由于前期丁香精油微胶囊中水分、附着在表面的丁香精油的挥发，导致缓释速度变大[20]，第4天后，缓释速度逐渐降低，这是已包埋的丁香精油缓慢释放，第11天，丁香精油微胶囊的缓释速度趋于平缓，缓释率约为25%，表明丁香精油微胶囊化确实降低了丁香精油的挥发，并有一定的缓释效果。
图5 丁香精油微胶囊缓释图
Fig.5 Sustained release image of clove essential oil microcapsule
2.3 微胶囊保鲜效果
2.3.1 腐烂率分析
与空白组相比，丁香精油微胶囊粉末对草莓的新鲜度有一定的保鲜效果。图6可以看出，所有组在贮藏1 d后都没有出现腐败现象，第3天后开始腐烂，草莓在空白组的情况下，只能贮藏5 d，之后腐烂加剧不可食用。草莓保存至第8天，空白组、丁2、丁4、丁6腐烂率分别为65%、37%、31%、41%，可见丁4的保鲜效果最佳，丁2效果相似，丁6保鲜效果一般但优于空白组。表1给出了第1、5、8天的表观照片，与腐烂率结果相一致，空白组在贮藏的第5～6天腐烂速度加快，在第7天达到了55%，实验组仅约为30%，表明丁香精油微胶囊通过抑制腐败菌的生长，在常温下延长草莓货架期2 d。
图6 草莓腐烂率的变化
Fig.6 Changes in rot rate of strawberry
表1 草莓贮藏期间形貌变化
Table 1 Morphology changes of strawberry during storage
组别Day 1Day 5Day 8空白丁2丁4丁6
2.3.2 硬度分析
果实硬度是指果实表皮及纤维组织在受压时所能承受的力，其大小与水果的果胶含量有关。果胶被果胶酶分解后，果实硬度会逐渐降低[21]。图7表明，4组草莓的硬度均逐渐降低，其中空白组降低得最快，保存至第8天时，硬度仅有0.743 kg/cm2，丁2、丁4、丁6组较空白组均有较好的硬度，其中丁4的硬度下降得最少，保存至第8天时，硬度有1.5 kg/cm2，较第1天(2.3 kg/cm2)硬度减少0.8 kg/cm2。
图7 草莓硬度的变化
Fig.7 Changes in hardness of strawberries
2.3.3 失重率
草莓果实水分含量高，在保鲜期间容易失水造成果实皱缩，由图8可以看出，草莓在贮藏期间，失重率逐渐增加，且空白组的失重率最高，增加的趋势最明显，特别是保鲜的第1～5天，这可能是因为草莓被霉菌侵染，草莓腐烂加剧，导致草莓新陈代谢加快，失重率增加。丁2、丁4、丁6三组均有较好的保鲜作用，第1～5天，3组的保鲜效果基本一致，第5～8天，丁6的保鲜效果差于丁2与丁4组，丁2与丁4组的效果十分接近，在第8天时，丁2与丁4组的失重率分别为15.8%与14.93%，失重率的明显增大，可能是因为在贮藏期间温度高，草莓的呼吸强度大所致。
图8 草莓失重率的变化
Fig.8 Changes in weight loss rate of strawberry
2.3.4 低场核磁共振分析
由图9可以看出，在0～5 d，随着草莓呼吸作用，自由水散失；在5～6 d，草莓逐渐软化，果实的果胶和纤维素被降解，此阶段自由水含量增加，不易流动水以及结合水减少，伪彩图表明空白组与丁6组的蓝色区域明显增加，表现为空白>丁2>丁6>丁4；7～8 d，草莓腐烂，果实内水分流失，3种水分均减少，丁4组较其他组变蓝时间更长，说明丁4能够更好地起到抑菌的作用，使草莓货架期延长2 d。结合草莓的腐烂率和失重率，处理组与空白组相比具有较好的保鲜效果。
图9 草莓核磁共振水分分布情况图和伪彩图
Fig.9 Nuclear magnetic resonance water distribution map and pseudocolor map of strawberry
2.3.5 可溶性固形物含量变化
草莓的可溶性固形物也是草莓的总糖量，其含量直接影响其风味，可溶性固形物在草莓保存时含量变化，会影响草莓的口感与品质[22]。由图10可见，处理组的可溶性固形物总体上变化不大，而空白组的可溶性固形物明显减少，空白组在第8天由11.8%减少至5%，丁2组由11.5%降为7.7%，丁4组由11.7%降为9.1%，丁6组由11.5%降为9%。
图10 草莓可溶性固形物含量的变化
Fig.10 Changes of soluble solids content in strawberry
3 结论
本文首先确定了丁香精油对常见细菌和草莓致腐菌的抑菌效果，然后选取β-环糊精作为壁材，包埋丁香精油，通过表征，证明微胶囊成功包埋，且具有较好的缓释效果。将微胶囊应用在草莓保鲜中，通过实验结果表明空白组腐烂率为65%，高于实验组，空白组和实验组的失重率较为接近，空白组由于腐败菌侵蚀严重，硬度下降程度远远高于实验组，核磁结果显示随保鲜时间的增加，空白组与实验组自由水逐渐增加，相比较下实验组保鲜效果优于空白组，可有效延长草莓货架期2 d，对草莓新型保鲜剂的开发具有一定的应用价值。
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