随着人们生活水平的提高，乳酸菌饮料受到了人们的关注。乳酸菌具有改善肠道菌群，降低胆固醇，增强人体免疫力的功效。乳酸菌发酵能改善食品的品质、风味。目前，市场上大多数乳酸菌饮料是以牛奶为基质，但随着乳糖不耐受人群的出现和素食主义者的增加，牛奶基质的乳酸菌饮料已不能满足市场需求。
乳酸菌发酵可以产生许多活性物质，其益生功能已经成为食品以及临床医学等领域研究的热点。微生物可以将原料经特定的代谢途径转化为易于人体吸收、利用的物质。微生物生长代谢过程中激活活性成分，从而产生新的功效，提高营养价值，促进机体的吸收和利用。玉米作为中国重要的粮食作物之一，主要用于淀粉的提取，玉米须、玉米皮很少被开发利用。随着科技的进步及产业化条件的成熟，玉米副产物的开发前景十分可观。玉米须和玉米皮有降血压、降血脂和降血糖等功效；玉米及其副产物发酵饮料作为玉米精深加工技术的一种应用，采用微生物发酵和饮料加工技术，保留了原料自身天然活性物质的同时，降低原料中淀粉、蛋白质、不溶性纤维等大分子物质，提高了饮料口感和稳定性，是玉米及其副产物研发的新方向。
为了解玉米及其副产物发酵饮料的主要代谢成分，代谢通路及物质积累的变化，本实验以2种乳酸菌为发酵剂混合发酵的玉米及其副产物饮料为研究对象，利用非靶向代谢组技术对饮料发酵前后小分子量物质变化进行了对比分析，将比较得到的显著性差异代谢物进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代谢通路富集分析。探究Lactobacillus paracasei L1和 Lactobacillus casei YQ336代谢特征及加工学原理，以期为玉米副产物发酵饮料加工工艺改良，滋味品质提升和功能性成分富集等方面研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
L.paracasei L1、L.casei YQ336于锦州医科大学食品科学与工程学院微生物实验室保存，该菌株已保藏到中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC4163)[1]。
玉米粒、鲜胡萝卜、玉米须、玉米皮等为原料，经煮制，打碎，过滤，调配和灭菌工艺处理得到发酵前玉米副产物饮料(B组)，在发酵前的玉米副产物饮料中接种L.paracasei L1和L.casei YQ336，37 ℃发酵15 h后得到玉米副产物发酵饮料(A组)。
Triple TOF 5600+质谱仪，美国AB SCIEX公司；Agilent 1290 Infinity LC超高压液相色谱仪(Agilent)，美国安捷伦公司；ACQUITY BEH C18 色谱柱 (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm) ，上海希言科学仪器有限公司；乙腈、乙酸铵、甲醇、氨水 均为色谱纯，美国BCL公司。
1.2 试验方法
1.2.1 样品信息
检测样本见表1。共2组待测样本，每组6个平行，同时制备了控制样本(quality control，QC)，用来平衡色谱-质谱系统及测定仪器状态，评价系统的稳定性[2]。
表1 样品信息
Table 1 Sample information
组别样品组别标记名1A(发酵后)A1、A2、A3、A4、A5、A62B(发酵前)B1、B2、B3、B4、B5、B6
1.2.2 代谢物提取
取样品于4 ℃解冻，冷冻干燥后加入200 μL预冷水和800 μL预冷的V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1混合溶液，混匀，-20 ℃孵育1 h沉淀蛋白，16 000×g、4 ℃ 离心20 min，取上清液。上清液在高速真空浓缩离心机挥干。质谱检测时加入100 μL的V(乙腈)∶V(水)=1∶1混合溶液进行复溶，16 000×g、4 ℃离心15 min，取上清液进样分析[3]。
1.2.3 色谱分离
将样品放在4 ℃进样器中自动进样，采用Agilent1 290 Infinity LC超高效液相色谱系统(ultra high performance liquid chromatography，UHPLC)，HILIC色谱柱对样品进行分离。进样量5 μL，柱温25 ℃，流速0.3 mL/min；梯度洗脱程序见表2[4]。
表2 梯度洗脱表
Table 2 Gradient elution table
时间/min色谱流动相A(水+25 mmol/L乙酸铵+25 mmol/L氨水)/%色谱流动相B(乙腈)/%0～0.55950.5～735657～960409～10604010～11.159511.1～16595
1.2.4 质谱采集
采用电喷雾电离对各个样品进行正负离子模式检测。样品经UHPLC分离再用Triple-TOF 5600质谱仪进行质谱分析。ESI源条件如下：离子源气体1，60 psi；离子源气体2，60 psi；气帘气压力，30 psi；源温度 600 ℃；m/z扫描范围：60～1 200 u；产物离子扫描m/z范围：25～1 000 u；扫描累积时间 0.15 s/光谱；产物离子扫描累积时间0.03 s/光谱。二级质谱采用依赖型扫描采集获得，并且采用高灵敏度模式，去簇电压±60 V(正负两种模式)，碰撞能量30 eV[5]。
1.3 统计分析
数据利用MSDIAL采集，再用程序XCMS进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。比对HMDB、MassBank 等公共数据库。根据提取的物质含量进行筛选鉴定。使用SIMCA-P 14.1处理数据，经Pareto scaling预处理后，进行主成分分析(principal component analysis，PCA)、偏最小二乘法判别分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)和正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)等多元统计分析[6]。
2 结果与分析
2.1 饮料发酵前后色谱图
所有饮料样本均在UHPLC-MS平台上分析,对QC样本正、负离子质谱总离子流图(total ion current，TIC)进行谱图叠加比较[7]，见图1和图2。结果表明，各色谱峰的响应强度和保留时间基本重叠，说明仪器误差较小，数据可靠。
图1 QC样品正离子模式总离子流色谱图
Fig.1 Total ion flow chromatogram of QC sample in positive ion mode
图2 QC样品负离子模式总离子流色谱图
Fig.2 Total ion flow chromatogram of QC sample in negative ion mode
2.2 饮料发酵前后代谢物PCA
通过MSDIAL软件提取代谢物离子峰[8]。将所有实验样本和QC样本提取得到的峰，经Pareto scaling处理后进行PCA，经7次循环交互验证得到PCA模型如图3所示，QC样本较紧密聚集，说明实验的重复性良好。
图3 主成分分析图
Fig.3 Principal component analysis
2.3 饮料发酵前后代谢物PLS-DA
将A组与B组数据处理后，得到PLS-DA得分图。如图4所示，饮料发酵前后的代谢产物明显分离，表明各组之间存在显著差异，全部样品组都位于置信区间内，建立比较组的PLS-DA模型，经7次循环交互验证得到的模型评价参数(R2Y，Q2), R2Y=0.999 和 Q2=0.96均接近 1，表明模型越稳定可靠。
图4 饮料发酵前后的PLS-DA模型得分图
Fig.4 PLS-DA model score diagram of beverage before and after fermentation
2.4 饮料发酵前后代谢物的OPLS-DA
将A组与B组数据处理后，得到OPLS-DA得分图。如图5所示，饮料发酵前后的代谢产物明显分离，表明各组之间存在显著差异，全部样品组都位于置信区间内，同时参数R2Y=0.999，Q2=0.939均接近1，说明模型稳定，数据可靠。结果显示，截距Q2=-0.173 <0，表明OPLS-DA模型不存在过拟合。
a-模型得分图；b-置换检验图
图5 饮料发酵前后OPLS-DA模型得分图和OPLS-DA置换检验图
Fig.5 Score diagram of OPLS-DA model and OPLS-DA replacement test diagram before and after beverage fermentation
2.5 饮料发酵前后的差异代谢物鉴定
根据OPLS-DA结果，变量影响投影(variable in-fluence on projection, VIP)值来衡量各代谢物的组间差异对各组样本分类判别的影响强度[9]。本实验中以VIP>1且P<0.05作为具有显著性差异代谢物筛选条件。对发酵前后的饮料进行比较，共检测出显著差异代谢物30类131种。主要包括氨基酸及其衍生物，有机酸及其衍生物，核苷酸，黄酮类，酯类等5类，分别占比为14.5%，18.3%，10.7%，9.9%，9.2%。
2.6 饮料发酵前后差异代谢丰度变化分析
以差异倍数(fold change, FC)>2或FC<0.5，且VIP>1，P< 0.05作为筛选标准，图6显示了比较A组和B组的火山图。图中红色点表示上调，绿色点表示下调。由图6可以看出其中58种代谢物显著上调，73种代谢物显著下调。
图6 饮料发酵前后的火山图
Fig.6 Volcano diagram of beverage before and after fermentation
2.7 主要差异代谢成分分析
比较发酵饮料前后样品中代谢成分的差异倍数变化，以FC>70和FC<0.014且VIP>1，P<0.05为指标，变化显著的代谢物共筛选出14种如表3所示，其中提高的代谢物有7种，主要包括萘酚类衍生物1种，核苷酸1种，苯丙酸1种，氨基酸及其衍生物2种，黄酮类2种。降低的有7种，主要包括烟酰胺类1种，抗生素1种，有机酸2种，核苷酸2种，磷酸酰肌醇类1种。
表3 饮料发酵前后差异代谢物
Table 3 Metabolites of beverage before and after fermentation
序号类别代谢物VIP值P值FC1萘酚类衍生物1-羟基-2-萘甲酸7.982 4P<0.0113 548.014 852磷酸酰基醇类磷酸酰基醇3.669 25P<0.010.000 115 5263烟酰胺类烟酰胺2.888 34P<0.010.012 256 3924黄酮类异戊烯3.072 16P<0.01326.590 312 35黄酮类(-)表儿茶素1.396 41P<0.01208.899 810 66氨基酸及其衍生物N-乙酰基-O-甲基酪氨酸1.703 04P<0.01138.387 833 97氨基酸及其衍生物邻琥珀酰高丝氨酸2.241 12P<0.0183.655 086 628苯丙酸对羟基苯乳酸6.473 8P<0.0175.494 920 379有机酸苹果酸8.925 44P<0.010.010 998 14810有机酸富马酸2.442 65P<0.010.005 809 40811核苷酸次黄嘌呤1.382 06P<0.0171.624 313 6912核苷酸腺嘌呤7.698 65P<0.010.006 861 73013核苷酸鸟嘌呤1.703 54P<0.010.006 655 22514抗生素盐酸嘌呤霉素1.432 26P<0.010.013 566 553
2.8 代谢通路分析
通路富集分析可获得63种差异代谢通路，其中27个通路存在显著差异(P<0.05)。其中排在前10的代谢通路见图7。差异代谢物数量富集最多的前5条通路分别是(1)缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的生物合成(valine, leucine and isoleucine biosynthesis)，主要包括甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢等23种代谢成分;(2)酪氨酸代谢(tyrosine metabolism)，主要包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，异喹啉生物碱生物合成等78种代谢成分；(3)双组分系统(two-component system)，主要包括光合作用，肽聚糖生物合成，氧化磷酸化等53种代谢成分；(4)嘌呤代谢(purine metabolism)，主要包括磷酸戊糖途径，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，硫胺素代谢，组氨酸代谢等95种代谢成分；(5)柠檬酸循环(citrate cycle)，主要包括氧化磷酸化，二羧酸代谢，脂肪酸生物合成等20种代谢成分。
图7 显著差异代谢物 KEGG富集图
Fig.7 Significant difference metabolite KEGG enrichment map
注：图中每个图形为一个KEGG通路，纵坐标文字表示通路的名称；横坐标表示富集率；图形越大表示差异代谢物的数目越多；颜色表示富集的显著性即P值，红色越深表示该通路越显著富集，右侧颜色梯度表示P值大小
3 讨论与结论
以2种乳酸菌为发酵剂混合发酵的玉米副产物饮料为研究对象，从发酵饮料中检测出518种代谢产物，差异代谢物131种占总代谢物的25%。主要包括氨基酸及其衍生物、有机酸及其衍生物、核苷酸、黄酮类和酯类等5类，分别占比为14.5%、18.3%、10.7%、9.9%、9.2%。氨基酸是构建细胞、修复组织的基础材料，是机体生长发育所必需的营养物质，也是调节代谢，增加抵抗力所需物质[10]，氨基酸缺乏会导致低血糖[11]。有机酸类似于抗生素具有杀菌和抑菌的特性[12]。核苷酸具有抗氧化作用，食物中缺乏核苷酸可损害肝脏、心脏、肠道和免疫系统[13]。黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗炎、降血糖、抗菌、抗病毒活性[14]以及良好的抗氧化活性[15]。酯类化合物具有抗氧化、抗癌、降低胆固醇、减肥、降血糖血脂等多种生理功能[16]。
饮料发酵后显著变化的主要有增加了13 548倍的1-羟基-2-萘甲酸，其具有抗病毒、降血压、抗癌等功效[17]；增加了326倍异戊烯，异戊烯有多抗病菌、降血压、抗真菌、抗氧化、抗艾滋病病毒、抗肿瘤等功效[18]；增加了208倍的表儿茶素，表儿茶素对心脑血管有防治作用，是金荞麦抗菌、消炎、镇咳的主要成分[19]，同时还有预防肿瘤和抗氧化作用[20]。
差异代谢物数量富集最多的前5条通路中，L-亮氨酸与L-异亮氨酸、L-缬氨酸均是必需氨基酸之一，也被称为支链氨基酸，能促进人体肌肉发育，增强肝脏免疫力，缓解疲劳，更容易降低肥胖者体重[21]。亮氨酸可对危重病人提供所需营养，也可调节哺乳动物骨骼肌蛋白质的代谢。还可加速体内脂肪氧化分解[22]。L-异亮氨酸能促进人体新陈代谢，补充人体必需营养物质。酪氨酸的代谢紊乱可引发多种遗传性疾病，如尿黑酸症[23]，缬氨酸可以治疗营养不良症[24]；对于大多数的原核生物和极少数的真核生物而言，双组分系统在适应环境等方面非常重要[25]。嘌呤代谢提供了大量重要生物合成所需的能量和辅助因子可作为癌细胞增殖的能量和底物[26]。嘌呤代谢异常能引发很多疾病如痛风、免疫系统疾病、血液疾病、肾脏疾病等[27]。柠檬酸循环是生物体内糖类、脂肪和蛋白质等能量营养物质氧化供能的共同途径，还是生物体内能量营养物质生物氧化“逐步释能”的关键环节[28]。
本研究建立了基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术的非靶向代谢组学方法[29]。对发酵前后代谢物进行初步鉴定比较，该方法具有良好的重复性和精密度。确定了乳酸菌能够促进玉米及其副产物发酵饮料次级代谢的合成和积累，为乳酸菌用于玉米及其副产物饮料的发展提供理论参考。
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