食品富含碳水化合物、蛋白质和脂肪等营养成分，在加工、流通及贮藏等环节极易滋生微生物并导致食品发生腐败变质，既影响食品的营养价值、外观质量及风味品质，还可能产生对人体健康有潜在危害的生物毒素。据相关数据统计，全球每年约有10亿例因食源性致病菌引起的疾病，特别是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[1]。传统热处理杀菌方式对食品热敏性营养成分、生物活性组分及色香味等可产生潜在不利影响，使食品失去原有新鲜度和(或)产生异味[2]，使用人工防腐保鲜剂常存在潜在“三致”危害，因此，在保留食品原有风味、新鲜度及保证安全前提下，使用安全高效和新颖的抑菌技术成为食品防腐保鲜及公共卫生安全领域重要的研究课题。抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)具有热稳定性好、抑菌活性高、特异性强、对哺乳动物细胞毒副作用少且不易产生耐药性等优势，可用于食品致病菌与腐败微生物的增殖抑制[3]，部分抗菌肽还兼具抗氧化等生物活性[4]，有望作为一种新型抑菌剂用于食品防腐保鲜及食源性致病菌抑制[5]。前期研究发现，金属抗菌肽SIF4在0.2×10-3 g/L(最低抑菌浓度)时可破坏S.aureus细胞膜完整性，表现较好抑菌活性[3]并具有较好抗氧化活性[4]，可通过抑制微生物增殖和防止食品组分氧化协同作用实现食品的防腐保鲜，但其在食品加工体系中的抗菌稳定性衍变机制尚不明确。本试验以S.aureus为指示菌，系统研究了金属抗菌肽SIF4在人工模拟食品乳化体系、增稠体系、加酶体系、高糖和高盐体系中抗菌活性变化，为其在食品防腐保鲜中的应用研究奠定良好理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
1.1.1 材料与试剂
金属抗菌肽SIF4由课题组制备；金黄色葡萄球菌ATCC25923，由菌种保藏中心获得；木瓜蛋白酶(papain)、菠萝蛋白酶(bromelain)、碱性蛋白酶(alkaline protease，AkP)、中性蛋白酶(neutral protease，NP)、酸性蛋白酶(acid protease，AcP)、复合风味蛋白酶(complex flavor protease，CFP)，东恒华道生物科技有限公司；胃蛋白酶(pepsin)、胰蛋白酶(trypsin)，庞博生物工程有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.1.2 仪器与设备
HERMLE Z323K冷冻离心机，德国Hermle公司；LDZX-40SAI立式蒸气灭菌锅，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；BBS-SSC超净工作台，济南腾览仪器有限公司；DH-360电热恒温培养箱，北京科伟永兴仪器有限公司；DK-98-11A型电热恒温水浴箱，天津市泰斯特仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 金属抗菌肽SIF4制备工艺
称取0.01 g花生肽亚铁加入至1 000 mL胃仿生消化液中，于(37±0.5) ℃、100 r/min仿生消化2 h，0.5 mol/L NaOH调pH至7.6终止胃仿生消化，用肠仿生消化液(37±0.5) ℃、50 r/min仿生十二指肠消化1 h，调pH至6.8并于(37±0.5) ℃、50 r/min继续仿生小肠消化2 h，收集仿生消化液冷冻干燥备用[6]。
1.2.2 抑菌稳定性评价(相对抑菌活性)
准确吸取0.1 mL S.aureus菌液(6×108CFU/mL)均匀涂布于牛肉膏蛋白胨培养基表面，将灭菌后的牛津杯置于培养皿中并加入供试品(0.2×10-3 g/L SIF4或模拟食品体系处理后的SIF4)0.1 mL。为使试液充分扩散至琼脂层，将培养皿4 ℃放置2 h后于37 ℃恒温静置培养24 h，用游标卡尺测定抑菌圈直径[3]。抑菌稳定性以相对抑菌活性进行评价。
1.2.3 模拟食品乳化体系
将2.0×10-3 g/L SIF4与10～50 g/L的硬脂酰乳酸钠(sodium stearyl lactate，SSL)、硬脂酰乳酸钙(calcium stearyl lactate，CSL)、双乙酰酒石酸单甘油酯(diacetyl tartaric acid esters of monoglycerids，DATEM)、蒸馏单甘酯(distilled monoglyceride，DMG)、脂肪酸蔗糖酯(sugar esters，SE)、聚甘油酯(polyglyceryl ester of fatty acid，PGFA)、月桂酸单甘油酯(glycerol Monolaurate，GML)、大豆磷脂(soybean lecithin，SL)和十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfonate，SDS)等乳化剂混匀(终质量浓度为0.2×10-3 g/L，下同)以构建模拟食品乳化体系，室温下放置5 h，测定模拟乳化体系处理前后抑菌圈平均直径，计算相对抑菌活性以评价抑菌稳定性。
1.2.4 模拟食品增稠体系
将2.0×10-3 g/L SIF4与1～5 g/L的明胶(gelatin)、羧甲基纤维素钠(carboxymethyl cellulose sodium，CMC-Na)、琼脂(agar)、阿拉伯胶(gum Arabic，GA)、海藻酸钠(sodium alginate，SA)、果胶(pectin)、黄原胶(xanthan gum，XG)、卡拉胶(carrageenan，CG)和海藻酸丙二醇酯(propylene glycol alginate，PGA)等增稠剂混匀以构建模拟食品增稠体系，室温下放置5 h， 测定模拟增稠体系处理前后抑菌圈平均直径，计算相对抑菌活性以评价抑菌稳定性。
1.2.5 模拟食品加酶体系
参考KIM等[7]和李心丹等[8]方法并稍做修改。将2.0×10-3 g/L SIF4与10～50 g/L的含蛋白酶悬液混匀以构建模拟食品加酶体系，调整模拟加酶体系温度与pH至该酶最适条件(表1)并保温2 h， 100 ℃灭酶5 min，调pH至7.0，测定模拟加酶体系处理前后抑菌圈平均直径，计算相对抑菌活性以评价抑菌稳定性。
表1 模拟食品加酶体系用酶最适条件
Table 1 The optimum conditions of enzymes used
酶种类最适温度/℃最适pH酶种类最适温度/℃最适pH木瓜蛋白酶50～557.0～8.0酸性蛋白酶30～402.5～3.5菠萝蛋白酶50～555.0～8.0复合风味蛋白酶50～555.0～9.0碱性蛋白酶40～559.0～11.0胃蛋白酶40～501.5～5.0中性蛋白酶40～556.5～7.5胰蛋白酶50～558.0～9.0
1.2.6 模拟食品高糖体系
将2.0×10-3 g/L SIF4与100～300 g/L的蔗糖溶液混匀以构建模拟食品高糖体系，室温下放置5 h，测定模拟高糖体系处理前后抑菌圈平均直径，计算相对抑菌活性以评价抑菌稳定性。
1.2.7 模拟食品高盐体系
将2.0×10-3 g/L SIF4与100～300 g/L的NaCl溶液混匀以构建模拟食品高盐体系，室温下放置5 h，测定模拟高盐体系处理前后抑菌圈平均直径，计算相对抑菌活性以评价抑菌稳定性。
1.2.8 试验数据处理
结果以平均值±标准偏差(n=3)表示，仅进行组间均数差异多重比较，采用SPSS Statistics 25.0进行单因素方差检验，方差齐性时采用最小显著性差异法，非齐性时使用塔姆黑尼T2方法[3]。
2 结果与分析
2.1 在模拟食品乳化体系中的抗菌活性稳定性
乳化剂是面包和蛋糕等食品加工中起稳定乳化、分散和润滑等作用的添加剂[9]，可与面粉中淀粉和蛋白质等形成复杂复合体并起到增强面筋、提高加工性能、改善面包组织和延长保鲜期等作用[10]。SIF4在模拟食品乳化体系中抗菌稳定性结果如图1所示。
图1 在模拟食品乳化体系中的稳定性
Fig.1 Antimicrobial stability in simulated emulsifying systems
注：图中相同字母者表示差异不显著(P>0.05)，不同表示差异显著(P<0.05)(下同)
由图1可看出，在硬脂酰乳酸钠、硬脂酰乳酸钙和双乙酰酒石酸单甘油酯等模拟食品乳化体系中，金属抗菌肽SIF4抑菌活性与对照组差异均不显著(P>0.05)， 但经大豆磷脂模拟食品乳化体系处理后，抑菌活性与对照组差异显著(P<0.05)，与C
NZLE等[11]和王美姿等[12]结论一致，可能是由于在疏水和静电作用下，乳化剂与蛋白肽类的结合影响抑菌活性[11]；在SDS模拟食品乳化体系中，试验组抑菌活性比对照组显著降低(P<0.05)，可能是因为SDS在溶液中可电离出十二烷基硫酸根离子和Na+，并使蛋白质氢键、疏水键打开，十二烷基硫酸根离子为疏水性较强烃链，可插入蛋白质分子内部或与疏水氨基酸形成强负电荷复合物并引起蛋白质构象改变。金属抗菌肽SIF4为阳离子抗菌肽[3]，可与SDS结合形成带负电荷复合物，且分子间静电荷斥力超过抗菌肽与细胞膜磷脂静电吸附力，阻止抗菌肽易位到细胞内膜[13]，降低其抗菌活性。在上述模拟食品乳化体系中，SIF4可保持较好抑菌活性，可用于面包和蛋糕等食品防腐保鲜。且具有较好脂质抗氧化活性[4]，可通过抑菌和防止食品脂质氧化协同效应实现面包和蛋糕等食品的防腐保鲜。
2.2 在模拟食品增稠体系中的抗菌活性稳定性
增稠剂是用于增加和改善果冻、软糖等冻胶类食品黏稠度和流态、色香味和稳定性并保持润滑适口感的添加剂[14]，SIF4在模拟食品增稠体系中的抗菌稳定性变化如图2所示。
由图2可看出，在以明胶、CMC-Na、琼脂、阿拉伯胶、海藻酸钠、果胶、黄原胶和卡拉胶等构建的模拟食品增稠体系中，SIF4抑菌活性与对照组均无显著差异(P>0.05)，可通过抑制果冻、调味糖浆和软糖等冻胶类食品中致病与腐败微生物增殖延长食品的保质期与货架期。
图2 在模拟食品增稠体系中的稳定性
Fig.2 Antimicrobial stability in simulated thickening system
2.3 在模拟食品加酶体系中的抗菌活性稳定性
在焙烤食品、酿造食品和肉类食品加工过程中常添加蛋白酶制剂来改善加工特性或食品风味[15]。蛋白酶制剂添加对抗菌肽抑菌活性影响多样，如抗菌肽K11在蛋白酶质量浓度达到9 g/L时抑菌活性基本不受影响[16]，而抗菌肽garviecin LG34在蛋白酶质量浓度为5 g/L时极易被水解而导致抗菌活性减弱或消失[17]。SIF4在模拟食品加酶体系中的抗菌稳定性变化如图3所示。
图3 在模拟食品加酶体系中的稳定性
Fig.3 Antimicrobial stability in simulated enzyme system
由图3可看出，SIF4在以木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶等供试蛋白酶构建的模拟食品加酶体系中抑菌活性与对照组无显著差异(P>0.05)，说明SIF4具有较好的蛋白酶耐受性，主要是缘于金属抗菌肽SIF4的配位螯合载体为低分子质量多肽[6]，与王美姿等[12]和杜芬等[18]报道相似。因此，SIF4可用于焙烤食品、酿造食品和肉类食品等常见含蛋白酶加工食品的防腐保鲜。
2.4 在模拟食品高糖体系中的抗菌活性稳定性
果脯和蜜饯等食品常通过提供高糖环境来抑制微生物生长而实现长时间保藏，但高糖食品仍有部分微生物可以生长，因此，对这些极端食品中应用的抗菌剂生物属性要求更高。SIF4在模拟食品高糖体系中抗菌稳定性结果如图4所示。
图4 在模拟食品高糖体系中的稳定性
Fig.4 Antimicrobial stability in simulated high sugar system
由图4可看出，SIF4在不同含糖量的模拟食品含糖体系中抑菌活性变化与对照组相比无显著性差异(P>0.05)，在300 g/L含糖量的模拟食品高糖体系中仍保持较高抑菌活性，说明模拟食品高糖体系对抑菌活性影响较少，SIF4可用于果脯、蜜饯及罐头等高糖食品的防腐保鲜。
2.5 在模拟食品高盐体系中的抗菌活性稳定性
豆瓣酱、泡菜、鱼(虾)酱、腌蛋、榨菜和腐乳等食品常通过高盐环境来延长保质期[19]，但高盐食品仍存在诸如葡萄球菌属等耐盐微生物生长的情况[20]，存在食源性致病微生物中毒的风险[21]。如谷羚毓[22]对腌蛋腐败盐水中耐盐菌和嗜盐菌多样性分析发现，12株耐盐腐败菌中有7株为葡萄球菌属，占比达到58.33%。SIF4在模拟食品高盐体系中抗菌稳定性如图5所示。由图5可看出，在模拟食品高盐体系中SIF4抑菌活性与对照组无显著差异(P>0.05)，在300 g/L含盐模拟体系中仍保持较高抑菌活性。
图5 在模拟食品高盐体系中的稳定性
Fig.5 Antimicrobial stability in simulated high salt system
耐盐腐败细菌细胞壁中没有肽聚糖，但富含酸性糖蛋白以形成负电荷区域吸引Na+形成离子键来稳定细胞壁结构[22]，厌氧条件下光照培养可在细胞膜上形成斑状紫膜(可占到细胞膜50%)，紫膜中有负电性磺化糖蛋白亚基[23]，因此，耐盐细菌表面呈负电荷。SIF4可与耐盐细菌表面的酸性糖蛋白及紫膜等负电荷基团结合，还可通过静电吸附与膜表面酸性磷脂结合，或通过疏水区域与细胞膜两性离子磷脂表面聚集并富集于膜表面[24]，或与负电荷细胞外膜脂多糖结合形成肽-脂复合物并形成跨膜通道破坏细胞膜完整性[25]，从而发挥良好抑菌活性，因此，可用于豆瓣酱和泡菜等高盐食品的防腐保鲜。
3 结论
食品受微生物污染后，其营养价值、风味及食品安全等均受到影响，抑制致病微生物或腐败微生物在食品中的增殖可实现食品的抗菌保鲜。研究发现，除大豆磷脂与SDS模拟食品乳化体系外，金属抗菌肽SIF4抑菌活性与对照组均无显著性差异(P>0.05)，SIF4作为一种新型食品抗菌剂，在不同模拟食品体系中均保持较好的抗菌稳定性，可用于需乳化加工食品、增稠食品、含酶加工食品、高糖及高盐食品等不同类别食品的抗菌保鲜，在食品防腐保鲜领域有很好的应用前景。
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