煮制加工对黑豆中多酚类代谢产物的影响

黑豆是豆科植物大豆属的黑色种子，又名黑大豆，在我国种植范围广、产量大[1]。研究表明黑色谷物的营养价值普遍高于其他同类浅色食品，相比其他杂粮全谷物豆类，黑豆中多酚类化合物含量高且种类丰富，富含的多酚与黄酮成分赋予了黑豆许多生理功能[2]。多酚类化合物对抗氧化、抗炎、抗癌、降血脂等慢性疾病起到了预防和调节的作用，具有良好的医用价值[3-6]。黑豆被称为“豆中之王”，常吃黑豆益于健康，日常人们多数将黑豆煮制加工成黑豆粥、黑豆饭、黑豆浆等进行食用，而黑豆中多酚类化合物内的酚羟基基团在高温条件下不稳定，热加工会对其功能性质和生物利用度产生影响[7]。研究发现，煮制处理后大豆总酚和总黄酮含量均低于未加工处理状态的大豆，且豆类种子经过常压煮制加工后，大概有26%～52%的多酚类化合物流失到豆汤中[8-9]。刘婷婷[10]研究发现黑大豆、黑小豆、红小豆、绿豆、红芸豆、紫花芸豆的总酚含量均在煮制后下降，乔丽华[11]的研究也同样证实了黑豆中多酚类化合物的含量受温度环境的影响产生了显著差异。尽管如此，目前针对黑豆多酚类化合物的研究仍集中在含量和抗氧化活性的变化上，关于黑豆在加工前后多酚类化合物的组成仍不清晰，这影响着黑豆的营养分析和功能评价。代谢组学技术依靠高通量、高灵敏度、检测范围广的特点可以对生物样品中的小分子代谢产物进行定性和定量分析，在营养科学和植物代谢研究方面被广泛应用[12-13]。

本研究对黑豆进行煮制加工，比较煮制前后总酚含量和总黄酮含量的变化，基于超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱(ultra performance liquid chromatography-quadrupole-electrostatic field orbitrap mass spectrometry，UHPLC-QE-MS)技术，应用非靶向代谢组学方法，检测煮制前后黑豆多酚类化合物的组成及含量，分析其差异性变化，为黑豆加工过程中化学物质表征和功能成分研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑豆产自黑龙江省，市售；没食子酸标准品、芦丁标准品，美国Sigma公司；DPPH、福林酚，上海源叶生物科技有限公司；甲醇(LC-MS级)、乙腈(LC-MS级)，CNW Technologies公司；乙酸铵(LC-MS级)，SIGMA-ALDRICH公司；乙酸(LC-MS级)，Fisher Chemical公司。

1.2 仪器与设备

MJ-10A高速万能粉碎机、MB-WFS4029美的电饭煲，美的生活电器制造有限公司；Vanquish超高效液相、Q Exactive HFX高分辨质谱、Heraeus Fresco17离心机，Thermo Fisher Scientific；BSA124S-CW天平，Sartorius；PS-60AL超声仪，深圳市雷德邦电子有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

黑豆洗净后于烘箱烘干，美的电饭煲中加入500 mL 去离子水，水沸腾后立即加入50 g黑豆，煮制40 min，将豆子取出沥干水分，放入烘箱烘干至恒重。加工后的黑豆与新鲜黑豆分别使用粉碎机研磨成豆粉；过80目筛；使用石油醚进行脱脂处理。完成后密封放入冰箱保存。

1.3.2 酚类提取物的制备

称取3 g黑豆粉，加入45 mL 70%(体积分数)乙醇，超声800 W提取30 min后离心(4 000 r/min)10 min，取上清液，沉淀按上述步骤再重复提取2次，合并3次上清液，40 ℃旋转蒸发，定容至10 mL备用。

1.3.3 黑豆活性成分的测定

根据Folin-Ciocalteu法稍作修改[14]绘制没食子酸标准曲线，所得线性回归方程：y=5.380 7x-0.007 5，回归系数R2=0.999 2。其中：y为吸光度；x为没食子酸标准液浓度，mg/mL。准确吸取1 mL样品溶液于25 mL的具塞试管中；分别加入福林酚试剂1 mL及质量分数为12%的碳酸钠溶液2 mL并定容至刻度线，室温25 ℃下避光反应2 h；在765 nm波长处测定样品的吸光度，并根据标准曲线和计算公式得出黑豆总酚的含量。总酚含量的计算如公式(1)所示：

式中:ρ为根据标准曲线算得提取液总酚质量浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；N为稀释倍数；M为称取的黑豆粉质量，g。

(2)总黄酮的测定

根据高丽威等[15]的方法稍作修改绘制芦丁标准曲线，所得线性回归方程：y=0.630 5x+0.000 9，回归系数R2=0.999 1。其中：y为吸光度；x为芦丁标准液质量浓度，mg/mL。准确吸取样品溶液2.0 mL放置于10 mL的容量瓶中；加3 mL体积分数为70%的乙醇溶液，再加入5%(质量分数)的亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀静置6 min；加入100 g/L的硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀静置6 min；加入40 g/L的氢氧化钠溶液4 mL，再用70%的乙醇定容至刻度，摇匀静置12 min；在510 nm 下测定吸光度，并根据标准曲线和计算公式得出黑豆总黄酮的含量。总黄酮含量的计算如公式(2)所示：

式中:ρ为根据标准曲线算得提取液总黄酮质量浓度，mg/mL； V为提取液体积，mL；N为稀释倍数；M为称取的黑豆粉质量，g。

1.4 UHPLC-QE-MS分析

移取100 μL样品至EP管中，加入400 μL提取液(甲醇，含同位素标记内标混合物)，涡旋混匀30 s，超声10 min(冰水浴)，-40 ℃静置1 h。然后将样品4 ℃，12 000 r/min离心15 min，取上清液于进样瓶中上机检测。

本研究使用Vanquish (Thermo Fisher Scientific)超高效液相色谱仪，通过Waters ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm×1.8 μm)液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱A相为水相，含5 mmol/L 乙酸铵和5 mmol/L乙酸，B相为乙腈。样品盘温度：4 ℃，进样体积：3 μL。Thermo Q Exactive HFX质谱仪条件为：质谱电压4.0 kV(正离子)、3.8 kV(负离子)；鞘气流速30 arb；辅助气流速10 arb；Full MS分辨率60 000；MS/MS分辨率7 500；离子传输管温度350 ℃。

1.5 数据处理

原始数据经ProteoWizard软件转成mzXML格式后，使用自主编写的R程序包(内核为XCMS)进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理，然后与BiotreeDB(V2.1)自建二级质谱数据库匹配进行物质注释，算法打分的Cutoff值设为0.3。

2 结果与分析

2.1 黑豆总酚和总黄酮含量变化

表1为煮制对黑豆总酚、总黄酮含量的影响。由表1可以看出，煮制加工使黑豆总酚和总黄酮含量发生明显下降，总酚含量下降59.06%，总黄酮含量下降64.74%。煮制加工导致了黑豆中多酚类化合物的流失与降解，这与乔丽华[11]的研究结果相符。由于水分的存在，通常也会加剧热处理的程度，加速多酚类物质的氧化损失。

2.2 代谢物定性结果

代谢物通过BiotreeDB数据库进行定性，代谢物定性结果如表2所示。新鲜黑豆(r)中共检测出89个多酚类化合物，煮制加工后的黑豆(p)中共检测出86个多酚类化合物。2组样品比较，同时存在的多酚类化合物有83个，新鲜黑豆独有多酚类化合物6个，煮制加工黑豆独有多酚类化合物3个。

由表2可知，2组样品共定性出92个多酚类化合物，包括53个黄酮类化合物，其中22个为异黄酮类化合物、8个酚酸类化合物、7个酚类化合物、8个木脂素类化合物、6个香豆素类化合物、5个苯丙素类化合物、3个花青素类化合物以及2个芪类化合物。豆异黄酮、木犀草素、黄豆苷元、染料木苷、芹菜素-7-葡萄糖苷等多酚类化合物的检出与XU等[16]和FENG等[17]的研究结果相吻合，并且朱怡霖等[18]的研究从横山老黑豆多酚类化合物中分离出原儿茶酸、没食子酸、染料木苷、大豆苷元等酚酸类化合物和异黄酮类化合物。这与本实验发现的黑豆中多酚类化合物的组成结果相似，但本实验更系统地定性出黑豆及煮制加工后黑豆的组成成分。从代谢物数量的方面来看，83个多酚类化合物共同存在于新鲜黑豆与煮制黑豆中，主要为黄酮类和酚类化合物，这些物质在热处理前后仍然存在，说明其对温度变化具有一定的稳定性。新鲜黑豆中独有的多酚类代谢物数量略高于加工后的黑豆，2组黑豆样品独有的多酚类代谢物主要集中在黄酮类、酚类以及木脂素类化合物上。值得一提的是新鲜黑豆中多酚类代谢物含有的表儿茶素和苯酚在经过常压煮制后完全消失，这种情况的发生可能与表儿茶素在热处理后易发生差向异构化作用或变旋作用有关[19]，此种黄酮物质具有诸多生理活性，如抗氧化、抗炎、保护神经、抑菌等作用。而苯酚作为结构最简单的酚类化合物最容易受到外界温度升高的刺激，增加其酚羟基的电离，使其更容易分解流失于水中。除此之外，在加工后的黑豆中检测到的咖啡醇也是新鲜黑豆中不含有的。由此说明，黑豆经常压煮制后，其多酚类代谢物的种类发生变化，而这种高变化也将影响着黑豆的生物活性和功能评价。

2.3 新鲜黑豆与煮制加工黑豆中酚类物质差异性分析

2.3.1 主成分分析(principal component analysis，PCA)

对样品进行主成分分析，判别新鲜黑豆与煮制加工黑豆各组样本之间和组内样本之间的变异度大小。图1为两样品的PCA得分图，R2X=0.942>0.5，说明拟合性较好，主成分1(PC1)的贡献率为 77.5%，主成分2(PC2)的贡献率为11.2%。此外，所有样本点都处在95%的置信区间内，且2组样本在二维图上表现出明显的分离趋势，同时煮制加工黑豆样本点的距离要大于新鲜黑豆。PCA结果表明，煮制对黑豆多酚类化合物具有显著影响。

2.3.2 正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal projections to latent structures- discriminant analysis，OPLS-DA)

PCA法虽然能够有效地提取主要信息，但是对于相关性较小的变量不敏感，而OPLS-DA可以使组间区分最大化，有利于寻找差异代谢物。图2为煮制前后黑豆的OPLS-DA得分图。

根据OPLS-DA模型对92种多酚类化合物数据进行分析，煮制加工黑豆样品分布在置信区间的左侧，新鲜黑豆样品分布在置信区间的右侧，2组样品的区分效果非常明显。分布形态上看，存在一定差异，r样本点离散程度要大于p样本点，这可能与煮制加工会促进黑豆多酚类化合物与自身蛋白质、多糖等物质的相互作用，导致其空间结构与组分含量的变化有关。OPLS-DA得到2个主成分，主成分1的贡献率为52%、主成分2的贡献率为12.2%，R2X=0.642， R2Y=1、Q2=0.978，其中 Q2>0.9 为出色的模型，相比于PCA模型效果更好。再次说明煮制加工对黑豆多酚类化合物具有显著的影响。

2.4 差异代谢物的筛选

以OPLS-DA模型主成分的 VIP>1 且t检验的P值<0.05为标准，筛选出黑豆在煮制前后的多酚类差异代谢物，结合数据库通过保留时间等条件与库中物质进行匹配，从而进行两黑豆样本差异代谢物的定性，定性结果如表3所示。

差异代谢物是指加工前后同时存在的，但是含量上存在显著差异的物质。高温热处理会导热不稳定的植物多酚类化合物发生降解或化学氧化形成醌类化合物[20]。煮制过程中由于水分的存在，通常会加剧热处理程度，加速多酚类物质的氧化损失。r与p代谢物对比，共筛选出47个多酚类差异代谢物，多数为黄酮类、异黄酮类及其衍生物、酚酸类化合物，还有少量的木脂素类、苯丙素类、花青素类化合物。由表2可知，在47个差异物质中，r黑豆样本中有31个多酚类代谢物的含量高于p，其中李属素、异鼠李素、木犀草素、香树素等黄酮类化合物含量显著下降，说明温度对黄酮类化合物的稳定性和生物活性具有一定影响，影响程度与化合物的结构有关，如羟基化程度和位置、取代基的存在[21]。没食子酸、原儿茶酸、丁香酸、高香草酸作为黑豆中常见的酚酸类物质在煮制后的损失同样较为严重，相比之下没食子酸受加工带来的影响最小，梁亚静[22]的研究得到了同样的结果。p样本中有16个多酚类代谢物的含量高于r，这些物质包含异黄酮类及其异黄酮的衍生物和花青素类化合物，在煮制加工过程中它们的含量得到了提升，倍性变化在1.05～7.41倍。

6″-O-Malonylwistin、6″-O-乙酰染料木苷、6″-O-乙酰大豆苷、6″-O-乙酰甘氨酸等异黄酮类化合物的相对含量呈上升趋势，表明热处理能够破坏黑豆黄酮类化合物与单糖或多糖部分之间的OH基团(O-糖苷)，降解一部分乙酰基葡萄糖苷型类黄酮使之成为游离态，导致某些异黄酮类化合物含量的升高[23]，其次，适当的热处理可使提取率较低的结合态酚类化合物半溶出，以提高其含量[24]。矢车菊素3-(4-乙酰葡萄糖苷)、氯化锦葵色素-3-β-葡糖苷等花青素类化合物的含量变化趋势并不一致，其原因可能是热处理过程使能够降解花青素类化合物的多酚氧化酶失去了活性，因此部分黑豆的花青素类化合物含量在受热过程中有所增加[25]。柚皮素、高良姜素、甘草苷、富马酸、Genistein 5-glucoside、二氢香豆素等多酚类化合物差异不显著，表明其热稳定性强于其他酚类化合物，其原因可能是此类化合物中含有苯环及碳碳双键等稳定的化学结构。其次，苯酚上的羟基与多糖上的氧原子间会形成氢键，这种相互作用可以形成葡聚糖凝胶，提高多酚类化合物的稳定性[26]。黑豆在加工后65.9%的多酚类差异代谢物含量发生了下降，这与其总酚含量和总黄酮含量的下降存在密切联系。综上所述，煮制加工作为豆类食品最常用的一种传统加工熟化方式，加工过程中部分多酚类化合物的含量呈现出显著性的差异，适当的热加工也可以提高黑豆食品的适口性和营养价值[27]。结果表明，煮制加工对黑豆中多酚类物质的含量具有显著影响。

2.5 差异代谢物的聚类分析

以上分析得到的差异代谢物在生物学上往往具有结果和功能的相似性和互补性，或者受同一代谢通路的正、负调控。因此选择聚类分析将具有相近性质的对象化为一类，而将较大性质差异的对象归到不同类[28]，结果如图3所示。

图3为黑豆经煮制加工前后的差异组分层次聚类分析热力图，横坐标r和p分别代表新鲜黑豆样本和煮制加工黑豆样本，纵坐标代表2种黑豆样本对比的差异代谢物名称，热力图的颜色代表了代谢物的丰度，红色为高表达组分，蓝色为低表达组分，颜色由蓝到白再到红代表着代谢物丰度逐渐升高。图3可以分成上下2个区域，上半区域的原儿茶酸、(-)-表阿夫儿茶精、黄豆苷元、根皮苷、没食子酸、丁香酸等此类酚酸类化合物与黄酮类化合物表达量明显高于p样本；下半区域的富马酸、地奥司明、白皮杉醇、豆苷、柚皮素等此类酚类化合物与异黄酮类化合物表达量明显高于r样本。根据观察颜色变化差异得出木犀草苷、三叶苷、芹菜素-7-葡萄糖苷、辣椒素酯等物质存在极显著差异；没食子酸、丁香酸、黄豆黄素、二氢香豆素、高香草酸等物质存在差异显著，这与表3结果相似。通过层次聚类分析可以看出，煮制加工对黑豆多酚类代谢物产生的影响显著，黑豆中大部分多酚类物质在经过煮制加工后含量有所减少。这些差异代谢物是众多代谢物中因煮制加工而导致的含量变化显著的物质，则差异代谢物对于黑豆功能性食品的开发与研究具有一定的参考意义。

3 结论

本研究通过对黑豆煮制加工前后总酚、总黄酮的含量进行比较，并基于UHPLC-QE-MS代谢组学平台，较系统地明确了新鲜黑豆和煮制加工黑豆的多酚类化合物组成。通过显著变化的多酚类化合物，为探索煮制对多酚类化合物的影响及代谢机制提供参考。研究表明，煮制加工对黑豆中多酚类化合物的数量、种类及含量均具有影响，其中含量上的差异最为显著，且加工对黄酮类化合物影响最显著。多酚类化合物作为具有多种生物功能活性的化学物质，下一步可对其加工后的功能活性变化进行研究，而且还可深入探讨加工对黑豆中酚类物质构效关系的影响。

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