新疆杏品种资源丰富，2019年杏种植面积为108 800 hm2， 产量达到84.38万t[1]。小白杏是南疆轮台和库车地区特有的品种，因其肉质细嫩、风味独特、营养丰富，深受广大消费者喜爱。由于小白杏采后机械损伤和呼吸作用较快，会迅速出现衰老、腐烂、脱水、组织软化等现象，严重影响小白杏物流运输过程中的商品价值[2]。为提高小白杏的物流品质，亟需寻找一种有效的保鲜包装方式以防控小白杏果实在贮运过程中的衰老。
通常在流通前采用预冷的方法，延长其货架期[3]。真空预冷能提高荷兰豆叶绿素含量，较好地保持贮藏品质[4]。在生菜中发现真空预冷能保持叶绿体和细胞的完整性，提高酚类物质含量，增强抗氧化能力，延长贮藏期[5]。王娟等[6]在黄花菜中的研究表明，真空预冷可以快速降温，去除采后果蔬的田间热和呼吸热，抑制呼吸强度的升高，同时减少维生素C和可溶性固形物等营养成分的消耗。真空预冷在叶菜类应用广泛，但关于真空预冷在果品上的研究报道较少，因此，采用真空预冷方式快速降低果品田间积热值得深入研究。
N2熏蒸是一种在果蔬采后贮藏领域的气体熏蒸保鲜方式。低氧环境可以降低果蔬内部超氧阴离子自由基等多种活性自由基的含量[7]，降低膜脂过氧化程度，使果蔬细胞膜系统维持较好的选择透过性[8]。90%(体积分数)以上的N2处理能推迟呼吸释放高峰的出现，延缓果实可溶性固形物和抗坏血酸含量下降[9]。课题组前期研究发现，杏果实经N2处理后可显著延缓果实硬度、可滴定酸含量、总酚含量下降速率，能较好地保持果实色泽，从而延长鲜杏的贮藏时间[10]。目前，大多数的果品“个性化”包装都是采用充氮气的方式，长时间冷链运输也会出现胀袋、酒化、异味等问题。短时间氮气处理会抑制果实衰老进程，且氮气包装研究报道较少。真空预冷和N2处理虽然能延缓新鲜果蔬的成熟衰老进程，改善贮藏品质，但其在延缓杏果实衰老的问题上研究不够深入。近年来，将真空预冷和气调熏蒸保鲜技术结合的采后果蔬处理方式在国内外受到了广泛关注。因此，本研究拟采用真空预冷结合N2包装的方法，对小白杏进行采后处理，研究真空预冷结合N2处理方式对杏果实采后品质及活性氧相关酶活性的影响，为真空预冷结合N2熏蒸处理方式在杏果实采后保鲜中的应用提供理论依据和技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
绿熟期小白杏(总可溶性固形物≥12.18%)于2020年5月采自新疆库车县小白杏种植基地。挑选无病虫害、无机械损伤，且大小、颜色、外观一致的小白杏，利用真空预冷机将果心温度预冷至4 ℃备用。
氢氧化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、冰醋酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，天津市光复精细化工研究所；聚乙二醇-6000、聚乙烯吡咯烷酮、盐酸羟胺、对氨基苯磺酸、邻苯二酚、愈创木酚、过氧化氢，天津市致远化学试剂有限公司。以上试剂均为分析纯。
1.1.1 试验仪器
P902型电导率仪，上海佑科仪器仪表有限公司；UV-2600型紫外分光光度计，日本岛津公司；A11型研磨机，广州IKA实验室技术有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 样品处理
将气调包装机的气调比例调到100% N2，通过O2和CO2检测器测量确定保鲜盒中的O2浓度≤0.05% (体积分数)。将预冷后的果实放入保鲜盒中(每盒20个)，进行气调包装。用激光打孔机分别于2、4、6 h后打孔，贮于10 ℃恒温箱中，每隔3 d测定各项生理指标。杏果实用液氮冻样后，放入-40 ℃冰箱贮存。真空预冷4 ℃、真空预冷4 ℃结合N2熏处理2 h分别表示为CK、N2。
1.3 指标测定方法
1.3.1 硬度的测定
参考曹建康等[11]的方法，每盒随机选择15个杏果，围绕果实的赤道部位，间隔等距离的3个位置，各削去果皮(厚约1 mm)，用GY-4型果实硬度计测定各个位置果肉的硬度，重复3次。最终结果以平均值计，单位为N。
1.3.2 呼吸强度的测定
采用Check Point 3便携式顶空分析仪测定。
1.3.3 乙烯释放量的测定
参照HU等[12]的方法，称取5.0 g鲜杏放入到密封的玻璃器皿中，在(20±1) ℃条件下静置2 h，抽取1.0 mL气体进行乙烯含量的测定。乙烯释放量的单位为μL/(kg·h)。
1.3.4 维生素C含量的测定
称取10.0 g果蔬样品置于研钵中，加入少量20 g/L 的草酸溶液，在冰浴条件下研磨成匀浆，转入到100 mL容量瓶中，用20 g/L的草酸溶液定容至刻度，摇匀、提取10 min后，过滤收集溶液备用。用移液管吸取10.0 mL滤液置于100 mL的三角瓶中，用已标定的2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至微红，且15 s不褪色。同时，以10 mL 20 g/L的草酸溶液作为空白按同样方法进行滴定。重复3次。
1.3.5 细胞膜透性的测定
采用电导率仪法[13]进行测定，电导率计算如公式(1)所示：
电导率
(1)
1.3.6 丙二醛含量的测定
丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的测定参考曹建康等[11]的方法。称取1.0 g果蔬样品，加入5.0 mL 10%体积分数三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)溶液，研磨匀浆后，于4 ℃、10 000 r/min 离心20 min，收集上清液。取2.0 mL上清液(对照空白管中加入2.0 mL 10%TCA溶液代替提取液)，加入2.0 mL 0.67%(体积分数)硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)，混合后在沸水浴中煮沸20 min， 取出冷却后再次离心。分别测定上清液在450、532和600 nm处的吸光度值。重复3次。
1.3.7 超氧阴离子自由基产生速率的测定
参照曹建康等[11]的方法，以1 min 1 g果蔬组织(鲜重)产生的超氧阴离子的物质的量作为超氧阴离子的产生速率，表示为nmol/(min·g)。
1.3.8 H2O2含量的测定
参照VELIKOVA等[14]的方法，稍作修改。称取1.0 g果蔬样品，加入1 mL 0.1%(体积分数)TCA溶液进行提取，于4 ℃、8 000 r/min 离心20 min，收集上清液。取0.5 mL上清液并加入1 mL KI溶液和0.5 mL 磷酸缓冲液。记录390 nm处的吸光度值，将其表示为μmol/kg。
1.3.9 酶液的提取
参照ALI等[15]的方法，稍作修改。取5.0 g冷冻组织于5 mL磷酸盐溶液(pH 5.5)中研磨匀浆，8 000 r/min 离心15 min，收集上清液，测定过氧化氢酶(catalase，CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(peroxidase，POD)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)活力。
1.3.10 POD活性的测定
POD活性的测定参照PARAFATI等[16]的方法，稍加修改。向试管中加入3 mL磷酸缓冲溶液(pH 7.8， 50 mmol/L)、220 μL 0.3%(体积分数)愈创木酚和20 μL粗酶液。加入0.3%(体积分数)过氧化氢溶液后立即在470 nm下测定2 min内吸光度值的变化。1单位的POD酶活定义为1 min内吸光度值增加0.01，其结果表示为U/g。
1.3.11 CAT活性的测定
CAT活性的测定参照曹建康等[11]的方法，稍作修改。向试管中加入100 μL粗酶和2.9 mL 20 mmol/L 过氧化氢溶液。15 s后记录反应体系在240 nm处的吸光值，作为初始值，然后每隔30 s记录1次，连续测定6个数据，重复3次。以1 g克鲜重1 min 吸光度变化值减少0.01为1个过氧化氢酶活性单位，用U/g表示。
1.3.12 SOD活性的测定
SOD活性的测定参照参照曹建康等[11]的方法，以每分钟每克果蔬组织(鲜重)的反应体系对氮蓝四唑(yingwenquancheng，NBT)光化还原的抑制为50%为1个超氧化物歧化酶活性单位，用U/g表示。
1.3.13 PPO活性的测定
PPO活性的测定参照PAN等[17]的方法，稍加修改。向试管中加入4 mL磷酸缓冲溶液(50 mmol/L)、0.1 mL 粗酶液、0.9 mL 邻苯二酚(50 mmol/L)。以蒸馏水为参比空白，15 s后记录在420 nm处的吸光值，作为初始值，然后每隔30 s记录1次，连续测定6个 数据，重复3次。将单位PPO酶活性定义为在420 nm 每分钟吸光度增加0.01单位，PPO活性表示为U/g。
1.3.14 APX活性的测定
APX活性的测定参照曹建康等[11]的方法，稍加修改。向试管中加入磷酸钾缓冲液(50 mmol/L，pH 7.3)、 1 mmol/L还原型抗坏血酸、0.1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L过氧化氢溶液和0.1 mL上清液。1个酶活单位定义为在290 nm下混合液吸光度变化0.01，抗坏血酸过氧化物酶活性表示为U/g。
1.4 数据分析方法
使用GraphPad Prism 8.0软件作图，SPSS 20.0进行数据分析以及利用Duncan法来比较均值。P≤0.05 表示差异显著，P≤0.01表示差异极显著。
2 结果与分析
2.1 N2处理对小白杏硬度的影响
在贮藏期间，小白杏果实的硬度呈现出逐渐减小的变化趋势(图1)。贮藏至第6天，N2处理的硬度为6.65 N，高于对照组38.35%。随着贮藏时间的延长，经真空预冷结合N2处理后的小白杏果实硬度显著(P<0.05)高于对照组杏果实的硬度，说明N2处理能够较好地保持小白杏的硬度。
图1 N2处理对小白杏硬度的影响
Fig.1 Effects of N2 treatment treatment on hardness of Xiaobai apricot
注：*表示不同处理间差异显著(下同)
2.2 N2处理对小白杏呼吸强度、乙烯释放量的影响
呼吸作用是果蔬采后的重要生理活动，其强度越大，果蔬内部营养物质消耗越多，品质下降越快[18]。由图2-a可知鲜杏在贮藏过程中呼吸强度先上升后下降，其中N2能抑制小白杏果实的呼吸强度并能延缓呼吸高峰的出现。CK在第9天时达到呼吸高峰，最大值为81.61 mg/(kg·h)，N2处理组在第12天时达到呼吸高峰，最大值为65.37 mg/(kg·h)。与对照组相比，N2处理能显著抑制小白杏的呼吸强度(P<0.05)。
在贮藏过程中杏果实的乙烯释放量呈现先上升后下降的趋势，由图2-b可知，CK组在贮藏第9天时达到乙烯释放高峰，其中对照组乙烯释放速率高于处理组。N2在贮藏第12天时达到乙烯高峰，对照组乙烯释放量是N2处理组的1.15倍。因此，N2处理不仅能延缓杏果实乙烯高峰的出现还能显著降低乙烯的释放速率(P<0.05)。
a-呼吸强度；b-乙烯释放量
图2 N2处理对小白杏呼吸强度、乙烯释放量的影响
Fig.2 Effects of N2 treatment on respiratory intensity and ethylene release of Xiaobai apricot
2.3 N2处理对小白杏维生素C含量的影响
维生素C是果蔬重要的营养成分之一，同时也是果实内活性氧的重要抗氧化剂[19]，可有效地保护细胞组织免受损害从而延缓果蔬衰老的速度[20]。随着呼吸作用和自身的氧化消耗，维生素C含量呈现出逐渐下降的趋势(图3)。贮藏至第15天，CK组与N2处理组的含量分别为10.40、12.07 mg/100g。在整个贮藏期间，处理组明显高于对照组(P<0.05)。由此可知，N2处理可以有效保持小白杏果实的营养成分。
图3 N2处理对小白杏维生素C含量的影响
Fig.3 Effect of N2 treatment on vitamin C content of Xiaobai apricot
2.4 N2处理对小白杏细胞膜透性的影响
细胞膜透性在一定程度上反映了细胞受伤害和果品的衰老程度[21]。随着贮藏时间的延长，杏果实采后细胞膜透性持续上升(图4)，而N2处理组杏果实的细胞膜透性显著低于CK组(P<0.05)，贮藏至第18天时，细胞膜透性分别是74.71%、64.02%，与CK相比，N2处理在一定程度上降低了细胞膜透性，延缓了果实的衰老。因此，N2处理有利于保持细胞膜结构，从而抑制果实中细胞膜透性的增加。
图4 N2处理对小白杏细胞膜透性的影响
Fig.4 Effect of N2 treatment on membrane permeability of Xiaobai apricot
2.5 N2处理对小白杏丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的影响
MDA是膜脂过氧化作用的主要产物之一，能反映细胞膜脂过氧化程度，其含量的积累会对果蔬细胞造成氧化损伤[22]。由图5可知，鲜杏在贮藏的前15 d， MDA含量呈现缓慢上升的趋势，但N2处理组显著低于CK对照组(P<0.05)。贮藏至15 d，真空预冷结合N2处理组杏果实的MDA含量是对照组的71.36%。所以，N2处理能显著抑制MDA含量的积累(P<0.05)。
图5 N2处理对小白杏MDA含量的影响
Fig.5 Effect of N2 treatment on the content of malondialdehyde in Xiaobai apricot
2.6 N2处理对小白杏超氧阴离子自由基产生速率和过氧化氢含量的影响
超氧阴离子自由基产生速率和过氧化氢含量呈现出先上升后下降的趋势(图6)。贮藏至12 d时，N2处理组、CK组超氧阴离子产生速率分别为27.78、37.02 nmol/(min·g)，过氧化氢含量分别为42.64、19.32 μmol/kg。在整个贮藏期间，N2处理组杏果实的超氧阴离子自由基产生速率、过氧化氢含量显著低于CK组(P<0.05)。
a-超氧阴离子自由基产生速率；b-过氧化氢含量
图6 N2处理对小白杏超氧阴离子自由基产生速率和过氧化氢的影响
Fig.6 Effect of N2 treatment on superoxide anion production rate and hydrogen peroxide of Xiaobai apricot
2.7 N2处理对小白杏活性氧代谢相关酶活性的影响
在整个贮藏期间，处理组和对照组POD的活性呈现出先上升后下降再上升的趋势(图7)。对照组与N2处理组酶活性分别在第9天、第12天达到最大值，分别为1.45、2.01 U/g。N2处理显著(P<0.05)提高POD活性，在整个贮藏期间POD都相对稳定，并处于较高的活性水平。
CAT、APX活性呈现逐渐减小的变化趋势。由图7可知，在整个贮藏期间N2处理组CAT、APX活性始终高于对照组，第9天时N2处理组CAT、APX活性分别是对照组的1.39倍、1.46倍，N2处理能够延缓CAT、APX活性的降低。
SOD活性呈现先上升后下降的趋势，由图7可知，N2处理组的SOD活性始终高于对照组。对照组与N2处理组SOD活性分别于第9天、第12天达到最大值，分别为1.06、1.41 U/g。N2处理能够延缓SOD活性高峰的出现。
贮藏0～12 d对照组果实多酚氧化酶活性逐渐升高，之后逐渐下降。如图7所示，N2处理组中的多酚氧化酶酶活性在贮藏0～15 d呈上升趋势，随后呈下降趋势。第15天时，处理组比对照组多酚氧化酶活性高24.03%。与N2处理组相比，对照组在整个贮藏时间内均保持较高的酶活性。
a-POD；b-CAT；c-SOD；d-PPO；e-APX
图7 N2处理对小白杏活性氧相关酶活性的影响
Fig.7 Effect of N2 treatment on active oxygen species related enzymes in Xiaobai apricot
3 讨论
MDA含量是植物细胞膜质过氧化程度的体现[23]，果实硬度逐渐下降，细胞膜透性增加，直接影响了果实的耐贮性和商品率[24]。本试验中对照组MDA含量随着贮藏时间的延长不断升高且显著高于处理组，说明贮藏期间细胞膜质过氧化程度不断升高，细胞膜受到的伤害逐渐加剧。在N2处理条件下，高抗氧化酶活对减轻膜脂过氧化有积极的作用，能有效减缓杏果实中MDA含量的积累和细胞膜透性的增加。
果蔬的品质下降、货架期缩短与H2O2密切相关，过氧化氢的增加会导致膜不饱和脂肪酸的过氧化反应，从而产生更高的MDA[25]。在本文中N2处理能有效抑制小白杏贮藏期间MDA、H2O2含量的增加及超氧阴离子自由基生成速率。N2处理组中活性氧积累的减少与MDA含量的降低相一致，表明N2处理可能通过抑制活性氧的积累来防止膜过氧化。
杏果实的呼吸强度和乙烯释放量是一系列酶相互作用的结果，N2处理通过抑制相关酶活性来降低杏果实的呼吸作用。杏果实在呼吸作用下产生大量呼吸积热，促使小白杏内部温度升高，加速果实失水，导致品质劣变。因此，N2处理能显著(P<0.05)抑制小白杏果实在贮藏过程中呼吸强度的升高，较好地保持鲜杏品质。在本研究中，POD活力的变化趋势与果实呼吸强度变化趋势一致，表明POD活力与呼吸强度、乙烯的生物合成以及细胞衰老密切相关。在桃[26]、蓝莓[27]和甜樱桃[28]的研究中发现，提高抗氧化能力能消除活性氧的过量产生，延缓果实衰老进程。CAT、SOD和APX是活性氧清除的关键酶，能清除活性氧，防止活性氧的积累[29]。N2处理能促进抗氧化酶SOD活力增加、延缓CAT、APX活力的降低、维持活性氧代谢平衡、抑制呼吸强度和乙烯释放量、诱导抗氧化酶活力、抑制自由基的累积、维持细胞的稳定，延缓小白杏果实采后衰老进程。
4 结论
小白杏果实的衰老与活性氧代谢密切相关。真空预冷结合N2熏蒸通过提高PPO、POD、SOD、CAT、APX活性，延缓呼吸强度和乙烯释放量，从而抑制果实硬度的下降和细胞膜透性的增加，延缓杏果实的衰老。因此，真空预冷结合N2处理技术作是一种安全有效、便于应用的保鲜方式，可为小白杏采后保鲜贮藏及提高果实物流品质提供理论和技术支持。
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