果酒是以果实为原料，经过破碎、压榨取汁、发酵或者浸泡等工艺酿制而成的一种含有酒精的饮品。生产果酒不仅能解决水果生产过剩、销售难的困境，还能提高原料的附加值，增加果农的经济收益。目前果酒市场种类繁多，常见的除葡萄为原料外，还有苹果、枣、柑橘等[1-3]。随着生活水平的提高，人们对果酒的质量提出了更高要求，兼备高营养价值和美好风味的果酒日益受到广大消费者的青睐。通过使用木瓜，香蕉和西瓜生产混合果酒，改善了果酒的理化和感官特性[4]；TSEGAY等[5]通过添加马缨丹果汁使果酒中总酚含量和感官值显著提高。
果酒成分中的挥发性化合物在决定感官质量方面起着关键作用，当然也会影响消费者的偏好[6]。果酒的香气受多种因素控制，如水果类型、品种、气候、酵母菌株和酿酒程序[7]。挥发性化合物的最终组合将定义果酒的特征香气，并且将在根据其质量区分果酒方面发挥重要作用。事实上，一些特定的挥发性化合物可能与不同品种果酒的独特特征有关，例如，辛酸、大马士革烯酮和乙酸异戊酯构成了樱桃酒的独特品质[8]。
许多方法能检测分析果酒复杂的风味物质，如同时蒸馏萃取法、顶空固相微萃取法(headspace solid-phase micro extraction, HS-SPME)、搅拌棒吸附萃取法、吹扫捕集法等[9]。HS-SPME是一种快速、灵敏、无溶剂的方法，广泛应用于提取蔬菜和水果的香气[10]，和其他样品处理方法相比,具有操作简便、测试迅速, 不需有机溶剂，集样品萃取、浓缩为一体等优点,其常与GC-MS一起使用测定果酒中的挥发性成分。
偏最小二乘法(partial least squares regression, PLSR)基于高维投影思想，通过提取主成分的方法对系统中的数据信息进行分解和筛选，实现对系统解释性最强的综合变量的有效抽取；PLSR可进行样本量小、变量间存在多重相关性的数据处理[11]，常用于感官属性与挥发性化合物关系的模型建立。陈义等[12]采用PLSR对信阳毛尖中的香气成分与感官之间的关系进行了研究，有效确定了信阳毛尖香气的等级划分。牛云蔚等[13]通过PLSR对不同产地樱桃酒中特征呈味物质与感官属性之间的相关性进行研究，结果表明感官属性与部分特征呈味物质显著相关。
虽然人们对果酒中挥发性物质的提取和鉴定进行了大量的研究，但对仪器分析与感官评定之间的关系以及复合果酒与单一果酒的比较研究较少。本研究旨在探索和表征单一果酒和复合果酒的化学成分和感官特性。文章研究了风味成分与感官特性之间的关系，并对感官特性的影响因素进行了探讨。将为复合果酒风味特征研究及产品的开发和推广提供有价值的参考信息。
1 材料与方法
1.1 果酒样品
从市场购买了4种含有相同原料葡萄的果酒样品，包括W1、W2、W3三种复合果酒和W4 单一型果酒。通过添加额外水果探究对其果酒风味成分和感官的影响。果酒的描述和编号如表1所示。
表1 研究中使用的果酒说明
Table 1 Description of fruit wines used in the study
编号生产年份主要原料酒精体积分数/%W12018荔枝、葡萄、苹果、玫瑰12W22017百香果、葡萄11W32017柑橘、葡萄11W42018葡萄12
1.2 仪器与设备
ICS-3000离子色谱系统，美国Dionex公司；MPS-2自动进样器，德国Gerstel公司；聚四氟乙烯硅隔板，英国Chromacol公司；IKA RCT碱性磁力搅拌器，德国Werke GmbH公司；岛津GC-2010气相色谱仪、MS-QP 2010 Plus质谱仪，日本岛津公司。
1.3 果酒质量参数分析
每个样品的pH值由pH计测量。可滴定酸度(titratable acid，TA)测定为0.1 mol/L NaOH滴定至pH=8.2为其终点，并以酒石酸(g/L)表示。有机酸的鉴定/分析采用ICS-3000离子色谱系统。采用Ionpac AS11-HC型分离柱(250 mm×4 mm) 和Ionpac AG11-HC型保护柱(50 mm×4 mm)， 样品体积为25 μL，通过与已知纯化合物的保留时间和标准曲线(R2>0.99)进行鉴别和定量。所有样品分析一式三份。
1.4 HS-SPME
使用MPS-2自动进样器提取挥发性芳香化合物。在250 ℃的气相色谱进样口对SPME纤维进行1 h的预处理。在对纤维涂层、提取时间、提取温度和样品体积/顶空体积比进行深入优化后，将4 mL样品转移到15 mL的SPME玻璃小瓶中。随后添加2-辛醇内标溶液(5 μL，104.46 mg/L)和NaCl(1.0 g)，用聚四氟乙烯硅隔板盖住小瓶，用IKA RCT碱性磁力搅拌器在40 ℃下以120 r/min 搅拌样品20 min，平衡挥发性化合物，然后在相同温度和搅拌下提取30 min。将纤维立即插入气相色谱进样口，在250 ℃下解吸挥发物8 min。
1.5 GC-MS
解吸后的挥发性化合物在气相色谱仪中分离，该仪器配备有DB-5毛细管柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)和MS-QP 2010 Plus质谱仪。载气为氦气，流速为1 mL/min， 裂解比为1∶2。气相色谱烘箱温度条件为：40 ℃烘3 min，3 ℃/min升至165 ℃，保持1 min，10 ℃/min升至220 ℃，保持5 min。
MS系统中传输线、四极和电离源的温度分别为280、150、230 ℃；在70 eV电离电压下记录电子碰撞质谱。采集以全扫描模式(30～350 amu)进行。
1.6 感官分析
感官评价在中国食品发酵工业研究院感官实验室进行，采用定量描述感官评价法对果酒样品进行感官评价，评价小组由10名专业品评成员(均有1年以上酒类品评经验)组成，4 名男性和6名女性，年龄在28～45岁。评价人员根据ISO4121标准进行了培训，分别对4款果酒的 8种感官属性进行评价，包括花香、果香、麦芽香、辛辣味、乳酸味、乙酸味、甜味和苦味(表2)；呈味强度采用5分制打分(0分表示没有味道，5分表示味道最强)，记录各评价人员的评价打分结果。每个样品在不同日期重复评价3次。
表2 感官属性及相应参考标准一览表
Table 2 List of sensory attributes and corresponding reference standards
气味参考成分花香12 mL接骨木花汁果香碾碎的草莓、树莓和黑莓麦芽香20 g谷物浸泡在1 L牛奶中2 h的滤液辛辣味10 g胡椒和丁香乳酸味10 mL市售酸奶乙酸味10 mL市售醋甜味5 g蜂蜜和2 g焦糖苦味0.15 g硫酸奎宁溶于1 L水中
1.7 统计分析
所有数据均表示为3次平行的平均值。数据处理采用Microsoft Excel 2019和SPSS 23.0。经方差分析，差异具有统计学意义(P=0.05)。使用The Unscrambler X 10.4进行PLSR分析。
2 结果与分析
2.1 果酒质量参数分析
4种果酒样品的有机酸成分如表3所示，酒精含量如表1所示。对影响果酒质量的TA、pH和有机酸进行了分析。所有变量在样本间均有显著性差异(P<0.05)。 果酒的乙醇体积分数为11%～12%，pH值为3.26～3.52。酒精含量和pH值的差异已被证明会影响人们对果酒中某些香气的感知。TA为4.90～ 7.91 g/L，W2最高，W4最低，但是整体之间差距并不大，本研究中选用相近基本理化指标的样品可降低其他因素对最终香气的影响。
表3 四种果酒中的有机酸成分
Table 3 Physicochemical properties in the four fruit wines
注：表中数据是3次重复的平均值(下同); *表示TA以酒石酸表示; 同一行不同的小写字母表明在P<0.05的Tuckey检验中有显著性差异
指标W1W2W3W4pH3.52±0.01c3.45±0.02b3.31±0.01a3.26±0.01d可滴定酸*/(g·L-1)5.42±0.08b7.91±0.05d7.21±0.04c4.90±0.03a乳酸/(g·/L-1)0.19±0.01b0.16±0.02a0.53±0.01c0.19±0.03b乙酸/(g·L-1)0.40±0.03b0.27±0.03a2.96±0.06d1.06±0.05c苹果酸/(g·L-1)1.92±0.06c1.86±0.03c1.49±0.03b0.41±0.02a柠檬酸/(g·L-1)0.74±0.03b3.36±0.02d1.96±0.04c0.61±0.02a总酸/(g·L-1)3.25±0.07a5.65±0.06ab6.97±0.06c6.27±0.04bc
酸度被认为是果酒的基本要素，应该足以给最终产品带来干净、清爽的印象[14]。在4种果酒中柠檬酸和苹果酸含量最高，乙酸含量也较高，W3的乙酸含量明显高于其他样品，达到了2.96 g/L。苹果酸在苹果酸乳酸发酵过程中会转化为乳酸，通过将苹果酸转化为乳酸，减少生果酒的酸涩和粗糙感，使得果酒的口感更加柔和、圆润。乳酸和苹果酸的含量可以用来指示葡萄酒中苹果酸乳酸发酵的程度[15]。W3中乳酸含量较高，说明其苹果酸-乳酸发酵过程较好。柠檬酸可以用来调节酒类产品的酸度，其中以W2的含量最高。W2变酸可能是柠檬酸所致。
2.2 不同果酒中挥发性风味物质成分的鉴定与表征
果酒样品中检测到的挥发性风味物质成分如表4所示。所有这些化合物均根据其质谱数据进行了表征。经初步鉴定，共有15种化合物为风味物质成分，包括8种醇、4种醛、缩醛、酮和3种酯。W3(826.68 mg/L)和W1(548.6 mg/L)的总风味物质成分含量分别最高和最低。
表4 四种果酒风味物质成分及含量 单位：mg/L
Table 4 The composition and concent of different fruit wine flavor substances
注：nd表示未检测到；线性保留指数(linear retention index，LRI)的理论值在Flavournet和Pherobases在线数据库查找
编号成分CAS分子式LRI理论值实际值W1W2W3W4醇A1甲醇67-56-1CH4O1 4201 416115.2±5.1b109.3±4.5a159.1±6.7d174.8±4.1cA2正丙醇71-23-8C3H8O1 0441 04141.4±1.2b33.2±1.1a85.3±2.1d54.2±1.7cA3异丁醇78-83-1C4H10O1 1061 10063.1±2.2b76.6±2.5c79.9±3.1d41.8±2.1aA4正丁醇71-36-3C4H10O1 1661 16310.5±0.9a10.5±0.8a11.8±0.5b10.2±0.1aA5活性戊醇137-32-6C5H12O85284535.0±0.3b26.8±0.8a35.7±1.1c41.7±0.8dA6异戊醇123-51-3C5H12O1 2171 228119.9±0.4a140.5±0.2b168.0±0.7d158.4±0.8cA7β-苯乙醇60-12-8C8H10O1 1221 13215.9±0.3b15.5±0.3b10.0±0.1a25.2±0.4cA82,3丁二醇513-85-9C4H10O28388649.4±0.1b7.0±0.3a7.3±0.4a10.4±0.3c小计410.4419.4557.1516.5百分比/%74.272.767.466.6醛,缩醛,酮B1乙醛75-07-0C2H4O70273241.5±0.3b72.5±0.2c68.5±0.2d20.0±0.4aB2乙缩醛105-57-7C6H14O25055124.3±0.2a5.3±0.2b5.4±0.4bndB33-羟基-2-丁酮513-86-0C4H8O21 2941 28510.3±0.2c5.7±0.1a12.5±0.1d8.4±0.4bB4糠醛98-01-1C5H4O21 465 1 457 nd4.1±0.1bndnd小计56.187.686.428.4百分比/%10.115.212.93.7酯C1乳酸乙酯97-64-3C5H10O31 3581 35541.2±0.2b35.4±0.3a99.4±0.2c174.4±0.5dC2丁二酸二乙酯123-25-1C8H14O41 6851 67311.9±0.1c9.1±0.2b6.3±0.2a12.1±0.1dC3乙酸乙酯141-78-6C4H8O289590433.3±0.4b25.7±0.3a57.6±0.3d43.7±0.1c小计86.470.2163.3230.2百分比/%15.612.219.629.7总计552.9577.2806.7775.1
2.2.1 醇分析
酵母发酵导致形成许多醇，也称为杂醇，主要由C3～C5直链醇，支链醇和苯基醇组成，它们产生于氨基酸的脱羧和脱氨基以及糖的分解代谢[16]。据报道，氨基酸的组成取决于酿酒原料。因此，这些挥发性化合物与所用原料有关[17]。这些果酒中醇的含量从 410.4 mg/L(W1)～557.05 mg/L(W3)。对于单个醇，甲醇和异戊醇是所有果酒样品中发现的最多的，尤其是在W4和W3中。其次是异丁醇和正丙醇。
2.2.2 醛、缩醛和酮分析
醛类、缩醛和酮类的含量相对较低，例如，这些化合物的含量在不同果酒中分别为28.4～106.34 mg/L。尽管它们的含量很低，但这些化合物与其他化合物结合，可能会产生奇妙的芳香，有助于增强整体芳香的复杂性和平衡性[18]。主要醛类为乙醛，特别是在W2(72.5 mg/L)中。糠醛仅在W2中被检测出来。
2.2.3 酯分析
在本研究中，不同果酒中酯的总含量差别较大，为70.2 mg/L(W2)～230.2 mg/L(W4)。对于单个酯，在总酯中W4乳酸乙酯含量最高，为174.4 mg/L。在这些果酒中同时还检测到了丁二酸二乙酯、乙酸乙酯，据报道，这些酯属于发酵性化合物[19]，尤其是乙酸乙酯，它似乎是许多品种的重要香气成分。由发酵过程中酵母产生的酰基辅酶A形成的乙酸酯和乙酯，为果酒提供了独特的水果和植物香味[20]。
2.3 不同果酒中的活性气味剂
果酒中存在大量的芳香挥发性化合物，其风味强度取决于浓度和阈值[21-22]。尽管不同香气成分之间可能发生相互作用，但只有有限数量的气味活性值(odor activity values，OAV)>1的挥发物可以被视为香气贡献者以及活性气味剂[23-25]。如表5所示，计算了14种挥发性化合物的OAV，根据从参考文献中获得的每种香气的气味阈值，在所调查的14种挥发性化合物中，有11种化合物OAV>1。
表5 根据气味阈值测定果酒中挥发性香气化合物的OAV
Table 5 The OAV of volatile aroma compounds in fruit wine based on odor thresholds
注：气味描述基于Favournet和Pherobase在线数据库；-表示OAV数值过小不予统计
成分气味描述气味阈值/(μg·L-1)W1W2W3W4甲醇辛辣味1001 151.81 093.01 591.01 747.6 正丙醇酒精味,辛辣味50082.766.3170.6108.3 异丁醇葡萄酒味,溶剂味,苦味40 0001.61.92.01.0 正丁醇药味,水果香5 0002.12.12.42.0 活性戊醇麦芽香300116.789.2118.9138.9 异戊醇威士忌味,麦芽香,焦香味30 0004.04.75.65.3 β-苯乙醇花香,玫瑰香,蜂蜜味,花香,花粉味,香水味43 985.03 880.02 502.56 292.5 2,3丁二醇水果香150 0000.1--0.1 小计5 343.95 137.34 392.98 295.7 百分比/%76.263.855.2791.1乙醛辛辣味,乙醚味251 660.02 900.02739.2800.03-羟基-2-丁酮黄油味,奶油味80012.97.115.610.5糠醛面包味,杏仁味,甜味3 000-1.4--小计1 672.92 908.52 754.8810.5百分比/%23.836.144.728.9乳酸乙酯水果香146 0000.30.20.71.2丁二酸二乙酯葡萄酒味,水果香200 0000.10.1-0.1乙酸乙酯水果香,甜味154 6360.20.20.40.3小计0.60.51.11.5百分比/%0.010.010.010.02总计7 017.48 046.37 148.89 107.7
醇类和醛酮类化合物是果酒活性香气的主要来源。与其他果酒相比，在W4(8 295.7 mg/L)中获得的醇值最高，其次是W1和W2(5 137.3～5 343.9 mg/L)。β-苯乙醇和甲醇是活性最强的醇。其中，β-苯 乙醇在所有观察到的果酒中值都较高，特别是在W4(6 292.5 mg/L)中。此外，果酒的香气也主要来自醛酮类，尤其是乙醛(800.0～2 900.0 mg/L)。相比之下，高浓度和高阈值的酯对果酒香气的贡献较小(OAV<2)。
2.4 感官分析
对果酒感官评价数据进行方差分析，结果表明，不同果酒样品的8种感官指标均存在显著差异(P<0.05)。图1为不同果酒感官特性分析雷达图，总体来看，复合型果酒(W1，W2，W3)比单一型果酒(W4)的香气更为丰富、浓郁。4款果酒在花香、甜味、乙酸味和乳酸味差异较大；而在果香、辛辣味和麦芽香几个感官特性上差异较小。花香、果香和甜味在W1和W2中更突出，而W3中的乳酸味、乙酸味和苦味较为突出。
2.5 感官属性与化学成分的相关性
PLSR分析研究了感官属性(Y矩阵)和挥发性化合物(X矩阵)之间的关系[26-27]。在本研究中，87%的X方差(挥发性化合物)和82%的Y方差(感官属性和样品)可以在PLSR模型中得到解释(图2)。图2-b展示了相关载荷图，其中内椭圆表示50%的解释方差，而外椭圆表示100%的解释方差。大多数感官描述和挥发性化合物位于2个椭圆形之间的图形中，根据之前的一项研究，内椭圆形内的化合物建模不佳，无法解释感官数据的变化[28]。位于2个椭圆形之间的感官描述符和挥发性化合物表明，可以用PLSR模型很好地解释两者之间的相关性。
a-果酒PLSR评分曲线；b-香气成分和感官属性的相关载荷图
图2 果酒样品、香气成分与感官属性的PLSR图
Fig.2 PLSR plot of fruit wines samples, aroma components and sensory attributes
注：坐标括号内数值表示因子的X方差和Y方差
W3位于PC1正值和PC2正值处，它的特征是具有乳酸味、乙酸味、苦味和麦芽香的感官特性，与图1中得分最高的感官评价结果一致，这4种气味描述并与乙醛、正丁醇、正丙醇和异戊醇等挥发性化合物有关。W2位于PC1正值和PC2负值处，它的特征是具有花香、果香和甜味的感官特性，并与糠醛、异丁醇等挥发性化合物有关，这一结果与和先前的研究结果一致[29]。然而，W1的感官描述与挥发性成分之间的相关性较弱，可能是受复杂成分的影响，有待进一步研究。
图1 果酒感官属性强度的雷达图
Fig.1 The spider plot of sensory attributes intensity of fruit wines derived
3 总结
本研究采用HS-SPME和GC-MS分析，对含有相同原料的3种复合果酒和一种单一果酒的香气成分进行了表征。共鉴定出15种挥发性化合物，其中大部分高浓度的化合物来源于不同的发酵过程，如醇类、乙酯类。此外，还计算了14种量化挥发性化合物的OAV，并测定了11种可能造成影响的气味剂(OAV>1)。感官属性的强度由专业评估人员完成，与单一果酒W4相比，复合果酒W1、W2、W3的香气更浓郁、更丰富。在PLSR模型中，对W2和W3的香气特征进行了识别和呈现。相比之下，W4没有发现明显的特征。这些结果表明，复合果酒比单一果酒具有更丰富的香气特征。本研究对复合果酒中的关键香气成分进行了深入的探讨。PLSR可以用来描述果酒的香气成分与感官特性之间的关系。
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