酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在营养缺陷或极端情况下，双倍体的酵母会进入减数分裂过程，最终在二倍体细胞中产生4个单倍体孢子，从而对抗外部环境[1]。单个酿酒酵母孢子的直径在2 μm左右，可用作大分子生物材料[2-4]。然而现有报道中，尚未成功解析酿酒酵母孢子壁的结构[5-8]。本实验室主要对酿酒酵母孢子进行研究，并且通过高浓度盐洗脱酿酒酵母孢子表面，在洗脱液中发现了RNA[9]。
HEK293T细胞来源于人胚胎肾细胞HEK293细胞的优化，是生物分子研究中常用到的细胞之一，由于HEK293T细胞的转染效率高，已成为广大研究者研究基因功能的一个首选细胞株[10]。HEK293T细胞不同于巨噬细胞，没有明显的吞噬作用[11-13]。实验室发现HEK293T可以吞噬酿酒酵母孢子，且内化效率较高[9]。本研究使用购自Sigma公司的聚苯乙烯乳胶颗粒(latex beads amine-modified polystyrene, beads)，其直径为2 μm。HEK293T细胞不能内化beads，但是beads通过静电结合酿酒酵母孢子表面分子后，可以被HEK293T细胞内化。
因此，本文着力研究酿酒酵母孢子表面分子与beads交联后，能否出现吞噬作用，以及影响吞噬效率的因素[14-15]。本研究为诱导非巨噬细胞内化大颗粒机制研究、酿酒酵母孢子表面的特性研究奠定了基础[16-17]，也为未来酿酒酵母孢子的医用提供了理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株
酿酒酵母菌株是以SK-1背景下的二倍体菌株AN120作为野生型(wild type，WT)菌株；大肠杆菌DH5α。本研究所用菌株均为本实验室保存。
1.1.2 酶及试剂
Lyso-Tracker Red，碧云天生物技术公司；RNase、Protease、Loading buffer，宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)；PBS缓冲液、Agrose M、酵母提取物、胰蛋白胨、腺嘌呤、乙酸钾、葡萄糖、氯化钠、山梨醇，生工生物工程有限公司；Liticase溶菌酶、山梨醇、RNAiso Plus、beads，Sigma；DNA marker 1kb plus，北京全式金生物技术有限公司；氯仿、异丙醇、戊二醛，中国医药集团有限公司。
1.1.3 培养基及其他溶液配制
LB培养基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10， NaCl 5，琼脂粉20(固体培养基)。
YPAD液体培养基(g/L)：酵母提取物10，胰蛋白胨20，腺嘌呤3，葡萄糖20。
YPACe培养基(g/L)：酵母提取物10,胰蛋白胨20，腺嘌呤3，乙酸钾20。
KACe培养基(g/L)：乙酸钾20。
1.4 mol/L 山梨醇：255 g山梨醇溶解于1 L 0.5% PBS缓冲液。
1.1.4 仪器与设备
DS-Ri2共聚焦荧光显微镜，Nikon公司；TY7622振荡混合器，易扩中国有限公司；QB-128旋转培养器，其林贝尔仪器制造有限公司；HYL-A电热恒温摇床，上海三发科学仪器有限公司；MX 150高速冷冻离心机，日本日立 HITACHI公司；DYY-6C凝胶电泳仪，北京六一仪器厂；Universal Hood II凝胶成像仪，Bio-Rad(美国)公司；JY92-IIN超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技有限公司；NanoDrop2000，赛默飞世尔科技有限公司公司。
1.2 实验方法
1.2.1 酵母培养与产孢
本文用到的酵母为AN120(野生型，二倍体)。酵母营养细胞使用YPAD培养基，酵母产孢使用YPACe培养基和KACe培养基。
先将酿酒酵母接入5 mL的YPAD培养基于试管中，放入30 ℃，220 r/min的摇床上培养24 h；将5 mL培养物转入100 mL的YPACe培养基于摇瓶中，放入30 ℃，220 r/min的摇床上培养24 h；离心收集菌体，再将菌体转入100 mL的KACe培养基于摇瓶中，放入30 ℃，220 r/min的摇床上培养24 h；取5 μL在显微镜下观察产孢率，统计酿酒酵母和孢子的数量，再用孢子数量除以总数即为产孢率，实验中的产孢率要达到90%；最后离心收集孢子。
1.2.2 孢子的纯化
将收集的细胞重悬于5 mL 1.4 mol/L山梨醇中，向其中加入20 μL的1 mg/mL溶菌酶充分混匀，37 ℃孵育2 h后弃上清液。向孢子中加入5 mL水，超声破碎20 min，将子囊膜破碎，在显微镜下观察，90%以上的孢子处于游离状态。以3 000×g，2 min离心收集菌体。用0.5% TritonX-100洗涤3～6次，每次均以3 000×g，2 min离心收集菌体，随后用水洗涤3次，每次均以3 000×g，2 min，最后离心收集孢子。
1.2.3 酿酒酵母孢子表面RNA的提取
将纯化好的孢子进行称重，加入适量水，使孢子终质量浓度为0.1 g/mL，取500 μL，9 000×g离心1 min， 去除水；加入500 μL 0.6 mol/L NaCl溶液，放入振荡器振荡3 min；15 000 r/min 离心，取上清液500 μL， 加入RNAiso Plus(TaKaRa)500 μL[18]。充分混匀，冰上放置5 min；加入200 μL氯仿(国药)，迅速混匀，冰上静置15 min；12 000×g 4 ℃ 离心15 min； 取600 μL上清液转入新的1.5 mL 离心管，加入 600 μL 异丙醇，冰上静置30 min，随后12 000×g 4 ℃ 离心10 min，弃上清液；加入500 μL 75%乙醇清洗沉淀，7 500×g 4 ℃ 离心5 min；去除上清液，冰上静置10 min， 加入50 μL DEPC水。最后用Nano Drop检测 RNA的浓度。
1.2.4 酿酒酵母营养细胞与大肠杆菌RNA提取
酵母细胞于5 mL YPAD过夜培养，取1 mL于1.5 mL 离心管中，9 000×g离心1 min，加入适量玻璃珠，加入RNAiso Plus(TaKaRa)1 mL 于振荡器上振荡1 min，破碎细胞，放置冰上5 min；加入200 μL氯仿，迅速混匀，冰上静置15 min；12 000×g 4 ℃ 离心15 min；取600 μL上清液转入新的1.5 mL 离心管，加入 600 μL异丙醇，冰上静置30 min，12 000×g 4 ℃ 离心10 min，倒去上清液；加入500 μL 75%乙醇清洗沉淀，7 500×g 4 ℃ 离心5 min；去除上清液，冰上静置10 min，加入50 μL DEPC水。最后在Nano Drop检测 RNA的浓度。
大肠杆菌于5 mL LB培养基过夜培养，操作步骤同上。
1.2.5 酿酒酵母孢子表面分子的提取
将纯化好的孢子进行称重，加入适量水，控制孢子终质量浓度为0.1 g/mL，取500 μL，9 000×g离心1 min， 弃上清液；加入500 μL 0.6 mol/L NaCl溶液，放入振荡器振荡3 min；15 000 r/min 离心，取上清液500 μL。 考虑到NaCl的浓度对于吞噬效率以及表面分子的影响，对0.6 mol/L NaCl进行10倍稀释，具体稀释比例可根据后期需要的RNA的量，计算得出对应的 0.6 mol/L NaCl的量，再进行10倍稀释。
1.2.6 beads的交联
不加入戊二醛交联：将beads置于2 mL离心管中，RNA组(加入定量的RNA)，酿酒酵母表面分子组(按照RNA的量，计算出加入酿酒酵母表面分子的量)，加入DEPC水，定容至2 mL。最后置于旋转仪上(4 ℃，24 h)，充分交联[19]。
戊二醛交联：将beads置于2 mL离心管中，向离心管中加入200 μL 2%戊二醛预处理beads，置于30 ℃ 培养箱1 h；离心(5 000×g， 1 min)，并用去离子水洗涤，再离心，重复3次；RNA组(加入定量的RNA)，酿酒酵母表面分子组(按照RNA的量，计算出加入酿酒酵母表面分子的量)，加入DEPC水，定容至2 mL。最后置于旋转仪上(4 ℃，24 h)，充分交联。
1.2.7 RNA的检测
对于酿酒酵母孢子表面分子，分别用RNase(0.5 U) 进行处理，37 ℃，1 h，再进行1.2.6中的交联。
1.2.8 HEK293T细胞的培养
在长满HEK293T细胞的培养皿中，去除培养液，加入10 mL新的培养液充分悬浮，并取适量转入新的24孔培养板中，计数，数量约为2.5×106个，37 ℃培养。
1.2.9 beads的吞噬与显微镜观察计数
将1.2.6中的终产物，3 000×g 2 min 离心，去除上清液，加入10 μL 水，混匀，取10 μL加入1.2.8中的HEK293T细胞培养液中，加入30 μL lysosome tracker，37 ℃ 放置1 h。取出培养板，除去培养液，加入100 μL PBS。在显微镜下观察吞噬现象，并计数，计算吞噬的数量，从而得出吞噬效率。
2 结果与分析
2.1 HEK293T细胞对beads的吞噬
首先，在本研究室前期的研究工作中，发现酿酒酵母孢子能够被HEK293T细胞吞噬，孢子直径2 μm左右，所以HEK293T细胞对于微米级的颗粒也有着吞噬的作用。为此，研究中购买来自Sigma公司的聚苯乙烯乳胶珠可用于创建乳胶凝集系统，称为beads，beads表面带有氨基基团，呈正电荷，直径2 μm。用beads来进行吞噬研究。研究中将beads和HEK293T细胞共同培养1 h，然后共聚焦显微镜下观察beads内化现象。如图1所示， beads本身具有蓝色荧光，在显微镜DAPI下能明显观察到；lysosome tracker显示的红色即为被吞噬的beads，所以在TRAIC下能观察到红色的圆圈即为被吞噬；BF为拍到的beads和HEK293T细胞；MERGE为前3张图的重叠图。结果显示beads能被HEK293T细胞吞噬。考虑到研究中加入的beads的数量是否会改变吞噬效率，因此研究了不同的beads量对于吞噬效率的影响，如图2所示，100个HEK293T细胞吞噬的beads的数目即为吞噬百分比，进而来表示吞噬的效率，吞噬百分比越高即为100个HEK293T细胞吞噬的beads数目越多。在加入不同量的beads条件下，100个HEK293T细胞吞噬的beads数目在1～2个左右，且差距不大，在后续的研究中使用8×107个beads做吞噬研究。
A-BF; B-TRAIC; C-DAPI; D-MERGE
图1 HEK293T细胞吞噬beads
Fig.1 HEK293T cell phagocytizes beads
图2 不同beads量的吞噬效率
Fig.2 The phagocytosis efficiency of different amount of beads
2.2 RNA对于吞噬的影响
本研究用0.6 mol/L NaCl溶液洗脱酿酒酵母孢子表面，从NaCl洗脱液中提取RNA再进行纯化，然后将RNA和beads一起孵育绑定，RNA带负电荷，氨基修饰的beads带正电荷，通过正负电荷作用力进行绑定，形成RNA-beads后再进行吞噬实验。研究猜测不同的RNA量对于吞噬效率有影响，所以用不同浓度的RNA绑定beads。为了探究不同来源的RNA是否对beads的吞噬有影响，分别从大肠杆菌、酿酒酵母营养细胞中提取了RNA，并与酿酒酵母孢子壁RNA以及购买的tRNA作了比较，不同RNA的凝胶电泳如图3所示。如图4-A所示,50 000 ng的RNA效果最优，因此后续的研究都选用50 000 ng的RNA进行反应；吞噬效率的结果如图4-B所示，结果表明所有RNA对于吞噬都有促进作用，但是来自酿酒酵母孢子表面的RNA和tRNA有更明显的促进作用，同时由图3看出，酿酒酵母孢子表面RNA和tRNA 都是长度非常短的RNA，猜测短链RNA更能影响beads的吞噬效率。
图3 不同RNA纯化后的凝胶电泳图
Fig.3 Gel electrophoresis of different purified RNA
A-不同RNA的量；B-不同来源RNA
图4 不同RNA的量、不同来源RNA对于吞噬效率的影响
Fig.4 The phagocytosis efficiency of different amount of RNA and different sources of RNA
2.3 RNase对beads和RNA-beads吞噬作用影响
为了进一步确认RNA对于beads的吞噬有着促进作用，因此有必要在体系中分别用RNase处理beads和RNA-beads，再和HEK293T细胞共同孵育，进行吞噬实验。如图5所示，结果显示RNase不会对beads的吞噬产生影响。对于从酿酒孢子表面的RNA进行纯化，并对样品分别加入RNase(0.5 U)，37 ℃， 1 h，再进行绑定然后观察吞噬结果。研究发现RNase可以明显的降低吞噬效率。因此研究中纯化的RNA确实对吞噬有促进作用。
图5 RNase对只有beads吞噬效率的影响和对加入RNA的beads吞噬效率的影响
Fig.5 Effects of RNase on the phagocytosis efficiency of beads and phagocytosis efficiency of beads with RNA
2.4 酿酒酵母孢子表面分子和戊二醛交联作用促进吞噬作用
本研究选择用0.6 mol/L NaCl进行洗脱酿酒酵母孢子表面的分子，由于RNA也是从NaCl洗脱液中提取纯化获得，研究猜想是否洗脱液也会影响beads的内化，所以用beads直接绑定孢子表面洗脱液，对洗脱液进行了10倍稀释以防高浓度的NaCl影响beads对分子的绑定。如图6所示，NaCl的洗脱液相对于对照组、纯化后的RNA都有明显提升。考虑到酿酒酵母表面分子的洗脱液中可能还有其他物质，所以使用交联剂戊二醛去研究是否其他分子也影响了beads的吞噬，戊二醛能够作为交联剂，对于氨基、羧基等有着交联作用。结果见图6，戊二醛的加入，使吞噬作用有了显著提升，这说明孢子洗脱液中除RNA外还有其他分子也可以影响beads的吞噬。研究中对戊二醛的影响做了猜测，戊二醛可能交联了酿酒孢子表面除RNA外的其他分子，对于该分子需要进一步研究。
图6 戊二醛的加入对不同分子对于吞噬效率的影响
Fig.6 Effect of glutaraldehyde on phagocytosis efficiency of different molecules
2.5 酿酒酵母孢子表面分子洗脱液中NaCl浓度对吞噬作用影响
本研究选择用0.6 mol/L NaCl进行洗脱酿酒酵母孢子表面的分子，考虑到NaCl浓度影响，先前实验在洗脱后进行了稀释。在此实验中，加入了不稀释组，并在稀释组与不稀释组2组的最后体系中测量RNA和蛋白质的量，如表1所示，没有明显差异。在吞噬作用实验中，如图7所示，2组也不存在差异，因此NaCl浓度对于beads绑定分子吞噬没有影响。
表1 不同浓度NaCl洗脱液中蛋白浓度和RNA总量
Table 1 Protein concentration and total RNA in different concentrations of NaCl of spore eluent
NaCl浓度/(mol·L-1)因素蛋白质质量浓度/(mg·mL-1)RNA总量/ng0.60.33740 1250.060.33339 843
图7 不同浓度NaCl对于吞噬效率的影响
Fig.7 Effects of different concentrations of NaCl on phagocytosis efficiency
2.6 RNase对酿酒酵母孢子表面分子促吞噬作用的影响
研究发现高盐洗脱液也可以诱导beads内化，是否高盐洗脱液中诱导内化的关键分子是RNA，为此用RNase处理了高盐洗脱液。研究中加入了RNase(0.5 U)，在37 ℃放置1 h，再进行绑定交联然后吞噬观察结果，如图8所示，研究发现RNase的处理可以使吞噬数量大幅降低。因此酿酒酵母孢子表面洗脱液中RNA是调节内化的关键分子。
图8 RNase对酿酒酵母表面分子和beads吞噬效率的影响
Fig.8 Effects of RNase on the phagocytosis efficiency of beads with molecules from spore wall
3 讨论
首先，本研究发现酿酒酵母孢子表面的分子可以诱导2 μm颗粒被HEK293T细胞内吞，并对HEK293T细胞内化beads数量做了评估。进一步分析显示酿酒酵母孢子表面的RNA可显著影响beads的吞噬，并发现其他物种的RNA也具有诱导beads内化的功能，这说明RNA诱导beads内化具有普遍性。同时研究发现高盐洗脱液诱导beads内化的效率要比纯化后的RNA更为显著，这说明孢子表面的其他分子也具有调节beads内化的能力，对于该分子有待进一步研究和探讨。
酿酒酵母孢子表面结构复杂，由内到外依次是甘露糖层，葡聚糖层，壳聚糖层和二酪氨酸层，最新研究发现孢子表面具有脂滴等结构。0.6 mol/L NaCl 洗脱液中包含了除RNA以外的其他分子促进beads的吞噬，到底是什么分子促进了这一过程需要进一步的探索。在研究中，使用洗脱液孵育戊二醛处理过的beads的吞噬效率最高。对酿酒酵母孢子表面分子和非巨噬细胞的吞噬研究，将为未来药物运输的材料和传递提供新思路。
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