沙丁鱼是我国重要的经济鱼类,加工过程中大约产生30%的下脚料,主要包括头、内脏、皮和尾等。目前,只有小部分沙丁鱼下脚料被用于制作鱼粉和动物饲料,大部分被丢弃。这些下脚料含有丰富的有价值的生物材料,如蛋白质、脂类和酶。因此,有必要将这些下脚料转化为高附加价值产品。
鱼露是利用价格低廉的鱼虾或水产品加工中的下脚料,加入30%～40%的盐,在太阳下暴晒发酵1～2年得到的产品[1]。因此,可以利用沙丁鱼下脚料来制备鱼露,这样不仅能减少环境污染问题,还能够提高沙丁鱼下脚料的经济价值。不过,传统鱼露的发酵的周期长,生产效率低,不利于工业化。因此,缩短鱼露的发酵周期,提高企业的生产效率一直是研究的重点。目前,缩短鱼露的发酵周期的主要方法包括：保温法、外加酶、外加曲法以及微生物发酵法。LOPETCHARAT等[2]发现把太平洋鳕鱼的发酵温度提高到50 ℃时,其发酵15 d时发酵液中总氮的含量与商品鱼露相一致。李勇等[3]以鲫鱼为原料,采用复合酶解的方法,先加胰蛋白酶后加入木瓜蛋白酶,得到的成品鱼露的各项指标达到了国标要求,有效地缩短了生产周期。白政泽等[4]采用加曲适量保温的方式生产鱼露,发酵30 d得到了一级鱼露。YONGSAWATDIGUL等[5]从泰国鱼露的发酵过程中分离出来了Virgibacillus sp.SK33,并以此作为细菌发酵剂,能够把鱼露的发酵时间由12个月降低到4个月。本研究采用4种发酵方式制备鱼露,通过监测发酵过程中理化指标探讨每一种发酵方式的优缺点,旨在为水产品加工下脚料的高值化利用提供思路。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
沙丁鱼下脚料(鱼头、鱼尾、鱼骨和内脏等),由宁波佳必可食品有限公司提供,使用前置于冰箱-20 ℃冷冻备用。传统发酵的商业一级鱼露,山东威海某公司；复合蛋白酶(1.5 AU/g)、风味蛋白酶(500 LAPU/g),诺维信(中国)生物技术有限公司；曲霉菌YL001、贝莱斯芽孢杆菌S2(Bacillus velezensis S2),本研究室保藏；种子培养基(g/L)：可溶性淀粉10,牛肉膏5 g,NaCl 50 g；其他化学试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。
JYSA800型绞肉机,九阳股份有限公司；PHS-3C型 pH 酸度计,上海仪电科学仪器股份有限公司；Kjeltec 8400型全自动凯氏定氮仪,丹麦福斯分析仪器公司；H2050R型高速冷冻离心机,湖南湘仪离心机仪器有限公司；SPX-250B-Z生化培养箱,上海博讯实业有限公司医疗设备厂；7200可见分光光度计,尤尼柯(上海)仪器有限公司；数显式恒温水浴锅,上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SPME手柄与萃取头,美国Supelco公司；7890 N/5975C气质联用仪,美国Agilent公司。
1.2 实验方法
1.2.1 沙丁鱼下脚料鱼露的制备
冷冻的沙丁鱼下脚料在流水中解冻1 h后,用绞肉机将其斩拌成鱼糜,然后与蒸馏水按1∶1(g∶mL)的比例混合,并装在1 000 mL玻璃罐中,接着用4种发酵方法制备鱼露(如图1)。
图1 沙丁鱼下脚料制备鱼露流程图
Fig.1 Flow chart of preparation of fish sauce from sardine by-products
(1)双酶酶解法。先加质量分数0.5%(酶/鱼糜)的复合蛋白酶,在50 ℃水浴2.5 h,再加入质量分数0.7%(酶/鱼糜)风味蛋白酶,在55 ℃继续水浴2.5 h,最后加入质量分数15%的盐(盐/混合物)后,发酵后所得鱼露为鱼露A。
(2)双酶酶解与发酵剂复合发酵法。将前期从自然发酵鱼露筛选得到的1株产蛋白酶的贝莱斯芽孢杆菌S2,接到种子培养基(60 mL/250 mL),37 ℃、80 r/min振荡培养20 h。然后通过双酶酶解得到酶解液,加入鱼糜质量5%的贝莱斯芽孢杆菌S2种子培养液离心(8 000 r/min,4 ℃,15 min)后的得到菌体以及质量分数15%的盐(盐/混合物),发酵后所得鱼露为鱼露B。
(3)双酶酶解与YL001曲复合发酵法。曲霉菌YL001是从酱油曲筛选出来的高产蛋白酶菌,YL001曲的制备参照白政泽等[4]方法。首先通过双酶酶解得到酶解液,然后加入质量分数14%的YL001曲(曲/鱼糜)以及质量分数15%的盐(盐/混合物),发酵后所得鱼露为鱼露C。
(4)仅加YL001曲法。先在50 ℃水浴中自溶2.5 h,然后在55 ℃继续水浴2.5 h,然后加入质量分数14%的YL001曲(曲/鱼糜)以及质量分数15%的盐(盐/混合物),发酵后所得鱼露为鱼露D。
为了得到更高品质的鱼露,所有样品都先在35 ℃的恒温培养箱中保温发酵30 d,然后在室温(15～25 ℃)下发酵60 d。
1.2.2 pH的测定
用pH计直接测量鱼露样品的pH值。
1.2.3 总酸及氨基酸态氮(amino acid nitrogen,AAN)含量的测定
参考GB 5009.235—2016中甲醛滴定法。
1.2.4 总氮的测定
GB 5009.5—2016中的凯氏定氮法。
1.2.5 挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)的测定
参考GB 5009.228—2016的自动凯氏定氮仪法。
1.2.6 挥发性化合物的鉴定
鱼露的挥发性成分的测定参考GAO等[6] 方法。将5 mL过滤后的鱼露样品放入顶空进样瓶,插入萃取头于60 ℃下吸附30 min。再迅速插入进样口,250 ℃下解吸5 min。
GC色谱柱为HP-5MS柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)；升温程序：初始温度40 ℃,保持3 min,以5 ℃/min的速度升温至90 ℃,再以8 ℃/min的速度升温至230 ℃,保持7 min。载气He,流速1.0 mL/min。质谱离子源温度 230 ℃,电子能量 70 eV；不分流进样；质量扫描范围m/z 35～550。
1.2.7 感官评价
采用描述性定量分析(quantitative descriptive analysis,QDA)法对鱼露样品进行感官评价分析[7]。评价小组由9名研究生(5名男性和4名女性,年龄24～30岁)组成。在感官评价之前,先进行了鱼露风味描述的一致认定和培训。经过训练的组员对不同风味的鱼露(焦糖味、肉味、鲜味、酸味、苦味、鱼腥味、氨味、腐臭味)进行评分。计分采用10分制,“1”分代表该风味完全没有,“10”分代表该风味非常强烈。
2 结果与分析
2.1 不同发酵方法制备沙丁鱼下脚料鱼露过程中pH的变化
如图2所示,发酵过程中A、B、C和D 4种鱼露的pH值的变化趋势相似。它们的pH值均在发酵的前15 d升高,紧接着(除A外)pH值又逐渐下降。发酵过程中pH变化的原因是挥发性碱基氮类化合物及有机酸类化合物在不同的发酵阶段生成量不同[7]。在发酵前期pH的上升可能是因为沙丁鱼下脚料的蛋白质被降解成小分子的胺、氮等碱性物质含量比例较大所致,而后来pH下降可能是因为蛋白质被分解为氨基酸、多肽及脂肪等被分解为一些有机酸类化合物。发酵结束后,鱼露A、B、C和D的pH值分别为6.34、6.23、5.90和5.78,差异显著(P<0.05)。鱼露C、D的pH值比鱼露A、B的pH值低,这说明双酶酶解与YL001曲复合发酵法及仅加YL001曲法能够把原料的蛋白质、脂肪等物质分解更完全。
图2 鱼露发酵过程中pH值的变化
Fig.2 Changes of pH during fish sauce fermentation process
2.2 不同发酵方法制备沙丁鱼下脚料鱼露过程中总酸和AAN的变化
发酵过程中总酸含量的变化如图3所示。总酸含量主要与蛋白质分解产生的氨基酸、胺类化合物以及发酵过程在产生的有机酸有关。由图3可知,鱼露A和B在发酵初期总酸略微下降,随后趋于平稳；鱼露C和D在发酵初期下降后,随后酸度又增加,最后趋于平稳。鱼露C和D的总酸度比鱼露A和B高,说明加入YL001曲促进了原料中的蛋白质及脂质的分解,导致酸类物质较高。鱼露B的酸度高于鱼露A的酸度,说明加入贝莱斯芽孢杆菌S2也能促进沙丁鱼下脚料的分解,不过分解能力弱于YL001曲；鱼露D的酸度高于鱼露C的酸度,这可能是因为在加入商业蛋白酶后产生了较多的碱类物质。
图3 鱼露发酵过程中总酸的变化
Fig.3 Changes in total acids during fish sauce fermentation process
AAN是一个衡量鱼露质量的重要指标。我国鱼露的行业标准SB/T 10324—1999《鱼露》规定一级鱼露AAN的含量应大于9.0 g/L,二级鱼露AAN的含量应大于6.5 g/L；而日本CODEX STN 302—2011规定鱼露AAN含量应大于总可溶性氮(total soluble nitrogen,TSN)含量的40%[8]。如图4所示,4种发酵方法所制备鱼露中的AAN的含量均随着发酵时间的增加不断地增加,在发酵的前30 d即保温发酵过程中,AAN含量增加迅速,当进入室温发酵后,AAN含量增加缓慢。AAN的含量变化代表着鱼露中主要氨基酸浓度的变化,与鱼中多肽和蛋白质降解的联合作用有关[9]。
图4 鱼露发酵过程中氨基酸态氮(AAN)含量的变化
Fig.4 Changes in conttent of amino nitrogen during fish sauce fermentation process
在整个发酵过程中,双酶酶解与YL001曲复合发酵法制备的鱼露的AAN含量最高,其次是仅加YL001曲法,然后是双酶酶解与发酵剂复合发酵法,最低的是双酶酶解法。经过90 d的发酵,鱼露A、B、C、D的AAN的含量分别为8.0、8.5、11.0及10.0 g/L,差异显著(P<0.05)。鱼露A和B达到了我国二级鱼露的AAN标准,而鱼露C和D达到了我国一级鱼露的AAN标准。
2.3 不同发酵方法制备沙丁鱼下脚料鱼露过程中TSN的变化
TSN是另一个衡量鱼露质量的重要指标,我国鱼露的行业标准SB/T 10324—1999《鱼露》规定,一级鱼露TSN的含量应大于12.0 g/L,二级鱼露TSN的含量应大于8.7 g/L；而日本CODEX STN 302—2011以及韩国规定,鱼露TSN含量应大于10.0 g/L[8-9]。鱼露样品中TSN含量如图5所示,与AAN的变化趋势相似(图4),都是随着发酵时间的延长而不断增加。这主要是因为沙丁鱼下脚料中的蛋白质在原料所含的蛋白酶、添加的商业蛋白酶、YL001曲或者贝莱斯芽胞杆菌S2分泌的酶与一些微生物的降解的共同作用的结果[10-11]。在发酵的整个过程中,不同发酵方式所制备的鱼露的TSN含量高低与AAN指标的趋势完全一致。发酵结束,鱼露A、B、C、D的TSN的含量分别为10.6、11.2、13.7及12.8 g/L,存在显著性差异(P<0.05)。因此,结合AAN以及TSN的含量,可知鱼露A和B为二级鱼露,鱼露C和D为一级鱼露。
图5 鱼露发酵过程中可溶性总氮(TSN)的变化
Fig.5 Changes in total soluble nitrogen during fish sauce fermentation process
经过3个月的发酵,双酶酶解与YL001曲复合发酵法是所得鱼露的质量最高；仅加YL001曲所得鱼露的质量虽然低于双酶酶解与YL001曲复合发酵法,但是也能够达到我国一级鱼露的标准,且不加商业蛋白酶能够降低企业的生产成本,从而更有利于鱼露的产业化；双酶酶解与发酵剂复合发酵法所得鱼露质量低于上面两种发酵方式,得到了接近一级鱼露标准的鱼露产品；双酶酶解法所得鱼露质量是4种发酵方式中最低的,不过也达到了二级鱼露标准,这为企业制造中低端的鱼露产品提供了一种方法。
2.4 不同发酵方法制备沙丁鱼下脚料鱼露过程中TVB-N的变化
发酵过程中TVB-N含量的变化如图6所示。在发酵的前30 d,TVB-N的含量均显著增加,但是随后缓慢增加。TVB-N,包括氨、三甲胺等挥发性碱性氮化合物,是衡量海产品新鲜度和变质程度的重要指标[12]。TVB-N的积累一般与原料的腐败以及特定腐败菌的生长有关系[13]。经过90 d的发酵,鱼露A、B、C、D的TVB-N的含量分别为1.42、1.48、2.38和2.18 g/L。鱼露A和B的TVB-N含量不存在显著性差异(P>0.05),这说明加入贝莱斯芽孢杆菌S2后并不会使TVB-N的含量显著增加,因此具有良好的应用前景。酶与YL001曲复合发酵法和仅加YL001曲法所得鱼露产品的TVB-N含量相近,但是前两种发酵方式的TVB-N含量显著低于后两种发酵方式(P<0.05),这是可能是因为加入YL001曲后,在水解蛋白质的过程中产生了一些挥发性碱类化合物,因此鱼露A和B的安全性更高。
图6 鱼露发酵过程中挥发性盐基氮(TVB-N)的变化
Fig.6 Changes in TVB-N during fish sauce fermentation process
2.5 挥发性化合物的分析
通过SPME-GC-MS检测了发酵90 d后的鱼露A、B、C、D以及传统发酵的商业鱼露样品的挥发性化合物,其中主要包括醛类、醇类、酮类、酯类、烃类、含氮化合物等。
如增强出版附件表1所示,醛类物质在鱼露A、B、C、D中的相对含量分别为47.19%、31.46%、33.89%和29.35%。醛类来自发酵过程中的脂质氧化,其中支链短链醛类或芳香族醛类可能是由氨基酸脱氨作用产生[14]。醛类一般具有令人愉快的气味,而且由于醛类的阈值较低,所以醛类有助于形成发酵鱼的独特香味[15]。在传统发酵的商业鱼露以及鱼露A、B、C、D中均检测到了3-甲基丁醛,而3-甲基丁醛被认为是鱼露特有风味的来源[11],这说明4种发酵方式均能使沙丁鱼下脚料鱼露具有传统发酵鱼露的特征性风味物质。此外,鱼露A、B、C、D中均检测到了2-甲基丁醛,它被认为是鱼露中重要的风味物质[15]。另外,在传统发酵的商业鱼露和4种鱼露中均检出大量苯甲醛和苯乙醛,不过苯甲醛和苯乙醛对鱼露气味的影响不大。庚醛是鱼腥味的主体成分[16],在4种鱼露中均检测到,传统发酵的商业鱼露中没有检测到,这可能是因为商业鱼露经过了脱腥处理。
醇类物质阈值较高,它们通常不会影响鱼露的整体气味[5]。鱼露D中检测到了3-甲基-1-丁醇,这种物质通常与强烈的蘑菇和草的气味有关[17],是大豆酱油中产生芳香作用的化合物[18],这说明鱼露D的风味接近大豆酱油。1-辛烯-3-醇是不饱和脂肪酸的氧化产物,能产生类似蘑菇的气味[17],这种物质仅在鱼露B和鱼露D中检测出。酮类物质一般与微生物活动和脂类的氧化有关,具有高阈值,可能对鱼露的气味没有贡献,不过烯酮能增强鱼的腥味。酯类物质在鱼露A、B、C、D中的相对含量分别为8.12%、4.51%、11.84%和10.15%,传统发酵的商业鱼露的酯类物质含量为20.16%。除了赋予水果花香的特性,酯类还能减弱或掩盖不愉快的游离氨基酸衍生的气味。
4种鱼露中均检测到了含氮化合物,它主要来源于氨基酸和碳水化合物之间发生的美拉德反应或氨基酸的热分解[16]。三甲胺是腥味物质的主要来源,在4种鱼露中均检测到,不过传统发酵的商业鱼露中没有检测到。2-乙基呋喃的阈值较低,有助于产生青草味或者豆香味[16],鱼露B和D中2-乙基呋喃的相对含量较高,豆香味较浓。烷烃类由于风味阈值较高,一般对风味没有重要影响[19]。酸类物质对鱼露的酸味有重要作用,在传统发酵的商业鱼露中检测出的4-甲基-戊酸具有刺激的酸味,在4种鱼露中均未检测到。不过,具有奶酪味的2-甲基丁酸仅在传统发酵的商业鱼露中检测到。另外,在传统发酵的商业鱼露以及鱼露A、B和C中均检测到了二甲基二硫,它是造成鱼露独特气味的有效化合物[5],这说明鱼露A、B和C具有和传统发酵鱼露相近的风味。
采用双酶酶解法、双酶酶解与发酵剂复合发酵法所得鱼露产品的腥味较重,风味相对较差；采用双酶酶解与YL001曲复合发酵法的腥味最轻、风味最佳,仅加YL001曲法所得鱼露风味较接近于大豆酱油。虽然用4种发酵方式生产出的沙丁鱼下脚料鱼露不及传统发酵鱼露的风味浓郁,但已经具有传统发酵鱼露的特征性风味。
2.6 感官评价
4种鱼露的感官评价如图7所示,4种鱼露的苦味、酸味、氨味、腐臭味得分都较低,这说明4种发酵方式所得鱼露产品均无特别强烈或难闻的味道。鱼露C和鱼露D鲜味和焦糖味高于鱼露A和B,这是因为加YL001曲后促进了原料中蛋白质等成分的降解,而其降解产物,如氨基酸、TSN等成分能够促进鱼露中鲜味和焦糖味的形成。另外,虽然与传统发酵的商业鱼露相比4种鱼露的风味和滋味较差,但是4种鱼露的整体接受性良好,尤其是鱼露C已经和传统发酵的商业鱼露质量相差不大。
图7 鱼露样品的感官评价
Fig.7 Sensory evaluation of fish sauce samples
3 结论
本研究为了探索利用沙丁鱼下脚料制作鱼露的可能性,采用4种发酵方式来制备鱼露。利用双酶酶解与YL001曲复合发酵法所得的鱼露样品C的质量最高,风味最好,达到了一级鱼露标准。仅用YL001曲法所得的鱼露样品D质量虽然低于前者,但是也达到了一级鱼露标准,且不添加商业蛋白酶能够极大的降低企业的生产成本,更有利于鱼露的工业化。双酶酶解与发酵剂复合发酵法所得的鱼露样品B的质量接近于一级鱼露,其安全性更好,因此有良好的应用前景。双酶酶解法所得鱼露A的质量最低,但也达到了二级鱼露。4种发酵方式所得的鱼露产品通过GC-MS均检测到了3-甲基丁醛、2-甲基丁醛等鱼露特征性风味物质,感官评价也表明鱼露产品均富有传统发酵鱼露固有的鲜美滋味。因此虽然4种发酵方式各有优缺点,但均能利用沙丁鱼下脚料来生产鱼露。
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