李子(Prunus salicina Lindl.),别名山李子、嘉庆子、布林,能促进胃酸和胃消化酶的分泌,进而促进胃肠蠕动,有改善食欲,促进消化的作用;富含多种维生素和花青素,具抗炎、抗氧化和改善记忆力的功效,是抗衰老、防疾病的“超级水果”[1-2]。李子醋是李子的深加工产品之一,一方面保留了原果的天然成分,营养价值高,另一方面兼顾了果醋的独特口感,富含多种有机酸、多酚和矿物元素[3]。

目前关于李子醋的研究集中在工艺优化[3-4],对其品质评价的研究鲜有报道。有机酸和挥发性成分均是评价果醋风味和品质的重要因素,单一研究果醋挥发性成分或有机酸的报道较多[5-7],吴震等[8]综合研究了桑葚果渣固态发酵醋的有机酸和风味特征。Acetobacter pasteurianus AS1.41是我国工业酿造食醋的主要醋酸菌菌株之一。醋酸菌的严格中温特性(30 ℃)对实际工业上的控温系统要求高,乙醇浓度(醋酸发酵底物)也严重影响醋酸菌的生长。本实验室前期筛选了果醋专用醋酸菌(Acetobacter sp.LO2),在耐受环境下具有良好的产酸能力和生长特性,且发酵的果醋感官评价较好[9]。

本研究以李子为主要原料,在不同耐受条件下,以实验室筛选的Acetobacter sp.LO2发酵的李子醋为实验组,A.pasteurianus AS1.41发酵的李子醋为对照组,通过HPLC测定李子醋的有机酸含量;SPME-GC-MS结合相对气味活度值(relative odor activity value,ROAV)分析李子醋的挥发性风味化合物,为LO2菌株的实际应用提供参考,并为李子的高值化利用和精深加工提供思路和方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

李子(黑布林),陕西渭南；酿酒活性干酵母,广西丹宝利酵母有限公司；Acetobacter pasteurianus AS1.41,中国工业微生物菌种保藏中心;Acetobacter sp.LO2,实验室保藏菌种;有机酸标准品,色谱纯,上海源叶生物科技有限公司；其他试剂,分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1F型洁净工作台,上海博迅实业有限公司；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械厂；HWS-24型恒温水浴锅,上海恒科学仪器有限公司；7890B/5977A型GC-MS联用仪,美国Agilent公司；AL204型电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；萃取头(DVB/CAR/PDMS,60 μm),美国Supelco公司；L-2000高效液相色谱仪,日立高新技术公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化

干酵母的活化：将活性干酵母按照投料质量的1%溶于50 g/L的白砂糖水溶液,水浴45 ℃保持1 h(液面气泡翻滚即活化成功),活化后为酵母种子液。

醋酸菌的活化：醋酸菌种子液(李子汁版),取活化2次醋酸菌的单菌落接种至100 mL/250 mL李子汁(加入10 g/L的灭菌后的白砂糖),8层纱布封口,30 ℃,150 r/min振荡培养2 d(观察到浑浊)；醋酸菌种子液(李子酒版),将醋酸菌种子液(李子汁版)以8%的接种量接种到100 mL/250 mL李子酒中,8层纱布封口,30 ℃,150 r/min振荡培养2 d(观察到浑浊)。

1.3.2 李子醋的加工工艺流程及操作要点

李子→清洗→切块去核→榨汁→杀菌→调节糖含量→酒精发酵→醋酸发酵→离心→装瓶→杀菌

以李子汁的1.2%(体积分数)加入活化后的酵母液,接种后搅拌均匀,28 ℃ 静置发酵9 d。将李子酒的酒精度调整至5%和8%(均为体积分数,下同),分别接种醋酸菌AS1.41和LO2的种子液,以下述4种条件进行静置醋酸发酵8 d：适宜条件(N)(酒精度5%、温度30 ℃)；高温条件(HT)(酒精度5%、温度37 ℃)；高乙醇条件(HE)(酒精度8%、温度30 ℃)；高温高乙醇条件(HTE)(酒精度8%、温度37 ℃)。

1.3.3 有机酸含量的测定

参考文献[5]和[10]的方法测定,并稍作修改。样品制备：取10 mL样品4 000 r/min 离心10 min。量取2 mL上清液定容于10 mL容量瓶,用0.22 μm水系滤膜过滤后置于样品瓶中待测。6种有机酸(酒石酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸和富马酸)的含量用外标法测定。色谱条件：Inertsil ODS-3 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；淋洗条件：等度洗脱；流动相：V(0.1%磷酸)∶V(甲醇)=97.5∶2.5；流速0.5 mL/min；柱温40 ℃；检测波长210 nm；进样量20 μL。

1.3.4 挥发性成分的测定

1.3.4.1 萃取条件

参考王丹等[6]的方法并修改。准确称取1.5 g NaCl于20 mL顶空瓶中,量取5 mL样品(李子汁、李子酒和李子醋)于顶空瓶中迅速旋紧瓶盖。40 ℃水浴平衡15 min。将老化处理后的60 μm DVB/CAR/PDMS萃取头插入顶空瓶,推出纤维头,调整插入深度后,40 ℃水浴吸附30 min。随后,在GC进样口解吸5 min。

1.3.4.2 GC-MS条件

参考王丹等[6]的方法并修改。色谱条件：载气He；流速1 mL/min；进样口温度250 ℃；HP-5MS弹性毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；不分流模式进样。升温程序：起始温度40 ℃保持10 min,以3 ℃/min升至108 ℃保持2 min,以5 ℃/min升至250 ℃保持5 min。

质谱条件：电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃,检测器电压1.2 kV,质量扫描范围m/z 30～350。

定性分析：总离子流色谱图积分后对照美国国家标准技术研究所(NIST)14.L谱库检索化合物,本研究选择正反匹配度均大于800的物质。

定量分析：采用峰面积归一化法,根据色谱图保留峰面积计算各香气成分的相对含量。

1.3.4.3 特征风味分析

采用刘登勇等[11]的ROAV法来衡量挥发性成分对风味的贡献。定义对样品风味贡献最大的组分ROAVstan=100,其他挥发性化合物的ROAVA按公式(1)计算：

(1)

式中：CA,各挥发性化合物的相对含量,%；TA,各挥发性化合物的气味阈值,μg/kg；Cstan,对样品风味贡献最大组分的相对含量,%；Tstan,对样品风味贡献最大组分的气味阈值,μg/kg。

1.3.5 数据处理

每组试验设置3个平行,数据以的形式表示。SPSS 25.0 软件进行单因素方差分析法(ANOVA)和Duncan 多重比较法进行处理与分析,P<0.05,差异显著；Origin 2018软件绘制主成分图谱。

2 结果与分析

2.1 李子醋的有机酸组成及含量比较

李子汁的有机酸含量为11.36 g/L,李子酒的有机酸含量为15.34 g/L。4种不同发酵条件下,2株醋酸菌发酵的李子醋样品的有机酸的含量如表1所示。LO2菌株发酵的李子醋中,有机酸含量最高的是适宜条件(86.98 g/L),最低的是高乙醇条件(72.43 g/L)；AS1.41菌株有机酸含量最高的是适宜条件(83.89 g/L),最低的是高温高乙醇条件(24.29 g/L)。结果表明,对LO2菌株,高乙醇条件增加产酸量,其余发酵条件均抑制了菌株的产乙酸能力；对AS1.41菌株,各种条件都对产酸有不利影响,其中高温高乙醇条件尤甚。

乙酸是醋酸菌代谢的重要产物,也是李子醋酸味口感的主要成分。李子汁的乙酸含量为0.3 g/L,李子酒中未检测到乙酸,8种李子醋产品中的乙酸含量均高于其他有机酸,并占有机酸总含量的80%左右。方冠宇等[12]研究表明玫瑰醋的主要有机酸是乙酸和乳酸,但本研究中李子汁、李子酒和李子醋均未检测到乳酸含量(均用外标法验证),这与段雪荣等[13]对李子产品的有机酸测定结果一致。李子醋中占较高比例的苹果酸主要来自李子汁(苹果酸含量 8.74 g/L),酒石酸、柠檬酸、琥珀酸和富马酸调和了李子醋的酸味,减少乙酸的刺激感,使李子醋口感协调和柔和。特别地,富马酸赋予LO2菌株发酵的李子醋独特的酸味,吴震等[8]研究表明富马酸在不同菌株和发酵条件下差异较大,这可能与微生物在酿醋过程中的生长状态和不同菌株自身属性有关代谢情况有关。各种发酵条件下,LO2菌株发酵的李子醋的有机酸均高于AS1.41,且在各胁迫环境中有机酸产量稳定,具备良好耐温和耐醇性。同时,发酵条件和菌株种类对李子醋的影响存在明显差异,这与此前研究结果一致[9],为研究其挥发性成分差异提供基础。

2.2 李子醋的挥发性成分相对含量

采用SPME-GC-MS测定了4种发酵条件下,2株醋酸菌发酵的8种李子醋样品的挥发性成分。由表2可知,这8种李子醋的挥发性风味成分主要由发酵过程中产生的不同种类的化合物组成,主要是酯类(24种)、醇类(11种)和酸类(4种),醛类、酮类、酚类和烷烃等占很小比例,共计65种化合物。如图1-a所示,高温高乙醇条件下,LO2菌株发酵的李子醋检出的挥发性成分种类最多,且明显高于AS1.41菌株；在适宜条件和高乙醇条件下,2株菌发酵的李子醋的挥发性成分在种类上一致,但成分组成存在明显差异；高温条件下,LO2菌株发酵的李子醋的种类高于AS1.41组。如图1-b所示,8种李子醋产品的挥发性成分中,酯类和醇类占比大,为其主体挥发性成分,适宜条件高温条件和高温乙醇条件下，LO2菌株发酵的李子醋的酯类和醇类化合物之和高于AS1.41菌株。

挥发性化合物的相对含量不能说明其对风味的贡献程度,利用刘登勇等[11]的方法,参照关于香气阈值的相关报道[14-16],进行ROAV的计算和分析,ROAV越大则对气味贡献越大。如表3所示,4种发酵条件,2株醋酸菌发酵的李子醋的ROAV均存在一定的差异。适宜条件下,5种酯类(醋酸异戊

酯、2-甲基丁基乙酸酯、乙酸苯乙酯、水杨酸甲酯和醋酸甲酯)、3种醇类(苯乙醇、芳樟醇和活性戊醇)、壬醛、丁香酚和精萘是LO2和AS1.41菌株发酵的李子醋的共有特征挥发性物质(ROAV≥1);3种酯类(乙酸异丁酯、苯甲酸乙酯和戊酸乙酯),3种醇类(异香叶醇、异戊醇和ɑ-松油醇)、苯甲醛和2,4-二叔丁基苯酚是共有的对整体风味起修饰作用的化合物(0.1≤ROAV<1);特别地,甲酸甲酯是LO2菌株发酵的李子醋特有的特征挥发性物质,乙酸香叶酯和香叶基丙酮则是AS1.41菌株发酵的李子醋的特征挥发性物质和有修饰作用的物质。高温条件下,与适宜条件相比,LO2菌株发酵的李子醋的特征挥发性物质增加了乙酸乙酯(ROAV≥1),AS1.41菌株的减少了2-甲基丁基乙酸酯和活性戊醇。与适宜条件相比,高乙醇条件下,LO2菌株的增加了1种特征挥发性物质(乙酸乙酯)和3种修饰作用风味成分(正己酸乙酯、乙酸香叶酯和异辛醇),AS1.41菌株增加了6种特征挥发性物质(苯甲酸乙酯、正己酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯和异戊醇),两株菌均减少了戊酸乙酯和未检到精萘。高温高乙醇条件下,与适宜条件相比,LO2菌株增加了正己酸乙酯、乙酸乙酯和乙酸香叶酯,AS1.41菌株增加了正己酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸乙酯和9-十六碳烯酸乙酯。LO2菌株发酵的李子醋的特征挥发性物质(ROAV≥1)之和高于AS1.41菌株,LO2菌株发酵的李子醋风味更丰富,与此前研究报道的感官评价结果一致[9]。

大多数酯类化合物是由酸、醇在发酵和陈酿过程中酯化而成[17]。酯类是李子醋中主要的风味化合物,一般为香甜的水果香,且阈值较低。如表3所示,李子醋一共检出14种重要酯类挥发性化合物,其种类丰富、含量高和占比大,为其提供了独特丰富的果香。赵峰等[18]、王丹等[6]的研究均表明酯类化合物的种类和含量最高,这与本研究结果一致。醋酸异戊酯、2-甲基丁基乙酸酯、乙酸苯乙酯水杨酸甲酯和醋酸甲酯是8种李子醋中共有的特征性挥发风味成分。醋酸异戊酯和乙酸乙酯是对李子醋整体香气贡献最大的化合物,醋酸异戊酯是一种乙酸和异戊醇酯化反应得到的化合物,有香蕉气味；而ZOHRE等[19]的研究表明,乙酸乙酯含量过高会有不愉快的香气,本研究李子醋的乙酸乙酯含量高,可能会对香气产生不良影响。2-甲基丁基乙酸酯是常见的苹果香气成分,有独特的青苹果味道,除AS1.41菌株在高温条件下发酵的李子醋未检出外,其余李子醋样品中含量相当。乙酸香叶酯、辛酸乙酯和9-十六碳烯酸乙酯是AS1.41菌株发酵的李子醋产品中特有的挥发性风味成分。8种李子醋中的酯类化合物的相对含量依次为31.08%、28.62%、31.56%、21.40%、53.47%、21.59%、53.12%、17.21%(图1-b),LO2菌株发酵的李子醋平均含量均高于AS1.41菌株。

醇类化合物一般具有植物香气,是李子醋中主要的风味化合物之一,不饱和醇阈值偏低,并随着碳链的延长,香气也会随之增加,少量的高级醇(3个碳原子以上的一元醇的总称)还能作为其他香气物质的良好溶剂。李子醋的醇类化合物主要是酵母菌等利用糖代谢产生,其中,ROAV较大的苯乙醇是酿酒酵母利用葡萄糖通过莽草酸途径生成[20],贡献木香和风信子花香。李子醋的另一重要特征醇类风味成分是芳樟醇,赋予独特的青木香和花香,熊涛等[21]研究表明芳樟醇是发酵后胡萝卜汁的特征挥发性成分,这与本研究结果一致。如表3所示,李子醋中共检出8种醇类化合物,除苯乙醇和芳樟醇外,还有一些含量较低但对整体风味有贡献的醇类,例如异香叶醇、苯乙醇、α-松油醇和香茅醇,均为提供丰富多层次的花果香,丰富了酯类风味物质的种类,使香味更协调。对LO2菌株发酵的李子醋,发酵条件的改变对其醇类化合物影响不大,发酵条件的温度升高会降低AS1.41菌株发酵的李子醋的活性戊醇(提供苦味)含量,高乙醇条件发酵会降低AS1.41菌株发酵的李子醋的异香叶醇(提供玫瑰花香)的含量。8种李子醋的醇类化合物的相对含量依次为37.28%、35.84%、39.75%、35.74%、25.26%、63.77%、32.24%和66.68%,在前2种发酵条件下,LO2菌株发酵的李子醋的醇类相对含量均高于AS1.41,高乙醇和高温高乙醇条件下,AS1.41菌株发酵的李子醋的醇类异常高的原因是AS1.41菌株对该环境不耐受,未进行完全的醋酸发酵,其醇类物质主要来源于李子酒。

除醇类和酯类等主要的挥发性风味成分,李子醋还有一些其他种类的挥发性香气成分,如醛类、酸类、酮类、酚类等。醛类化合物因其较低的阈值而对风味具有较大的贡献,低、中和高碳位数的醛类分别具有刺激性气味、油脂味和柑橘皮的香味[22]。李子醋中的特征挥发性风味物质中的醛类化合物主要是壬醛(ROAV≥1)。孙宝国[15]研究表明水果中的壬醛等中碳链长度的醛类化合物对主体香气有重要辅助作用。长链的酸类化合物阈值较高,ROAV偏低,对李子醋的风味贡献不大。虽然李子醋的有机酸含量较高,但酸类化合物却不是李子醋的特征风味化合物,这是因为随着发酵时间的延长,酸类化合物和醇类化合物生成了对应的酯类化合物,使特征性挥发成分中酯类化合物占比高,酸类化合物占比低。不饱和脂肪酸或微生物氧化以及氨基酸降解,形成具有持久花果香气的酮类化合物[22-23]。发酵过程中的丁香酚的含量变化会引起李子醋的其他酚类化合物的变化,丁香酚为李子醋提供一种独特的辛香味,其具有良好的抑菌防腐作用[24]。

2.4 李子醋的挥发性成分相对含量

选择表3中对样品风味有重要影响的挥发性物质(ROAV≥0.1)进行主成分分析(principal component analysis,PCA),建立李子醋样本和化合物之间的相关性关系。不同发酵条件下的李子醋数据分散,提取的3个主成分PC1解释所有变量方差的40.3%,是方差贡献率最大的主成分；PC2和PC3分别解释所有变量方差的28.3%和14.3%,3个主成分累计解释所有变量的82.5%(表4)。

由图2可知,8种李子醋样品没有明显聚类,说明其主要挥发性成分存在差异。根据PCA原理,样品在得分图上距离越近,其挥发性成分的组成和含量相似度越高,载荷图中化合物与原点的距离与主成分之间有相关性[25]。

为了更好表示每个变量的相对重要性以及每个变量与主成分之间的相关性,分别在PC1～PC2和PC1～PC3平面绘制得分图和载荷图(图3)。由图3-a可知,李子醋样品分散在PC1～PC2平面的4个象限,挥发性成分和含量具有差异性,但AS1.41在适宜(NA)和高温条件(HTA),LO2菌株在适宜(NL)和高温条件(HTL),LO2菌株在高醇(HEL)和高温高乙醇(HTEL)发酵的李子醋分别在象限内聚集,在同一象限内聚集的样品的挥发性成分相似。LO2在高醇条件发酵的李子醋(HEL)的特点是甲酸甲酯(A1)含量最高；LO2在高温条件发酵的李子醋(HTL)的特点是苯乙醇(B2)和丁香酚(E3)得分最高。AS1.41在适宜条件发酵的李子醋(NA)在PC1上得分最高,NA的特点是戊酸乙酯(A9)、精萘(E5)和冰醋酸(D1)的含量最高；AS1.41在高温条件发酵的李子醋(HTA)的特点是L-石竹烯(E1)、香叶基丙酮(E2)和壬醛(C2)的含量最高；AS1.41在高醇条件(HEA)以辛酸乙酯(A13)和9-十六碳烯酸乙酯(A14)含量最高为特点。

依据每种醋的化合物特点,有助于将其与其他样品分开,并赋予其特定气味细微差别,如HTA的壬醛含量高,赋予其高于其他样品的独特的油脂味,如以精萘为特点的NA样品的强烈的樟脑丸味道。高温和适宜条件发酵的李子醋在PC1的正向,显示出挥发性成分相似性。由图3-b可知,HTEL和HEA在PC1～PC3平面的第2象限,酯类、醇类化合物聚集分布,说明酯醇类化合物成分的相关性,HTEL和HEA的酯、醇类化合物含量高于其他醋样。NA在PC1得分最高,对应在得分值较高的均为酯类,表明其酯类成分含量高。总体来讲,PCA能有效区分这8种不同李子醋,为李子醋评价提供基础。

3 结论

本研究通过HPLC发现,不同的发酵条件和菌株发酵的李子醋的有机酸组成和含量有差异,但LO2菌株在各发酵条件下发酵的李子醋有机酸含量相近,富马酸是LO2菌株发酵的李子醋特色有机酸。通过SPME-GC-MS发现,李子醋鉴定出酯类、醇类、酸类、醛类、酮类和酚类等8个类别共65种挥发性成分,适宜条件和高温条件挥发性成分和含量相似,其余2种条件的挥发性成分和含量相似。LO2菌株和AS1.41菌株在适宜条件的的挥发性化合物种类含量一致,高温条件会降低种类,高乙醇条件会丰富种类,高温高乙醇条件仅丰富了LO2菌株的挥发性种类。基于阈值计算的ROAV表明,LO2菌株发酵的李子醋的特征挥发性风味成分的ROAV大于AS1.41,特别地,高温高乙醇条件下,AS1.41大于LO2,原因是AS1.41菌株在此条件未进行完全醋酸发酵,保留了李子酒的大部分醇类挥发性物质。PCA结果表明,不同的发酵条件和菌株发酵李子醋的挥发性成分的种类和含量差异较大,可以建立李子醋的发酵条件与挥发性成分的关系。本研究明确了LO2菌株在胁迫环境下发酵李子醋的优势,为LO2菌株在工业上非严格控制发酵条件下发酵李子醋提供参考,为工艺调整、质量控制、节约能源和进一步提升产品品质提供理论基础和依据。

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Organic acids and volatile components of plum vinegar fermented by high-tolerance acetic acid bacteria under different conditions

ZHOU Yanqing1,JI Xu1,LU Jialei2,WANG Liping1,3*,CAO Yuling1,ZHANG Jingjing1

1(College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China) 2(College of Marine Ecology and Environment,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China) 3(Engineering Research Center of Food Thermal-processing Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Abstract To investigate the differences of organic acids and volatile components in plum vinegar fermented by Acetobacter sp. LO2 and Acetobacter pasteurianus AS1.41 under different fermentation conditions. The organic acids and volatile components were determined by HPLC and SPME-GC-MS. Compared with optimal condition, under high temperature, high ethanol, and high temperature and ethanol, the organic acid content of plum vinegar fermented by LO2 strains decreased by 8.37%, 16.73% and 8.16%, and these by AS1.41 strains decreased by 13.49%, 47.03% and 71.06%, respectively. The number of volatile components in plum vinegar fermented by LO2 strains was 2-10 more than that of AS1.41, the esters and alcohols of plum vinegar fermented by LO2 strains were higher than those of AS1.41. And the characteristic volatile flavor components of plum vinegar fermented by LO2 strains were more abundant than those of AS1.41, the highest ROAV of plum vinegar was isoamyl acetate. And principal component analysis could effectively distinguish eight kinds of plum vinegar. Therefore, plum vinegar fermented by LO2 strains was superior to AS1.41 strains in organic acid and volatile components. The results provide a reference for the follow-up practical application of LO2 strains in the quality evaluation of plum vinegar fermented under non-strictly controlled fermentation conditions.

Key words acetic acid bacteria; plum vinegar; tolerance; organic acids; volatile components; principal component analysis

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.027249

引用格式:周滟晴,季旭,卢家磊,等.高耐受醋酸菌在不同条件发酵李子醋的有机酸和挥发性成分研究[J].食品与发酵工业,2021,47(23):149-157.ZHOU Yanqing,JI Xu,LU Jialei,et al.Organic acids and volatile components of plum vinegar fermented by high-tolerance acetic acid bacteria under different conditions[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(23):149-157.

第一作者：硕士研究生(汪立平副教授为通讯作者，E-mail：lpwang@shou.edu.cn)

基金项目：国家重点研发计划“蓝色粮仓”资助项目(2020YFD0900905)

收稿日期：2020-03-05,改回日期：2020-03-26