珍珠龙胆石斑鱼(♀Epinephelus fuscoguttatus×♂E. lanceolatus),属于鲈形目、鮨科、石斑鱼属,具有成长快、病害少、抗逆性强、肉质细腻、营养丰富等优点,是我国南方海水养殖的重要经济鱼类之一,年产量高达10万t,产值超100亿元[1-3]。其销售主要以活鱼为主,但由于保活流通技术的限制,其死亡率较高,死亡石斑鱼的销售价格大大降低。针对死亡的珍珠龙胆石斑鱼,采用一些技术手段开发高附加值产品(如酶解制备活性肽、提取鱼油等),可以提高其经济价值。

目前,利用水产蛋白通过酶解制备生物活性肽是科学研究和消费市场关注的热点之一。因为这类生物活性肽具有抗氧化、降血压、抗凝血、提高免疫力等多种生理功能,且容易被机体吸收[4-7]。珍珠龙胆石斑鱼肉是一种优质蛋白质来源(85.19%,干背基),必需氨基酸(essential amino acid,EAA)含量高(34.56%,干背基)[8],是开发生物活性肽的优质原料。本研究以保活流通过程中死亡的珍珠龙胆石斑鱼为对象,采用生物酶解制备小分子肽,并对其超滤处理,分析超滤组分的蛋白质含量和氨基酸组成,评价其营养价值,为利用珍珠龙胆石斑鱼肉酶解产物开发生物活性肽提供基础数据,实现其高值化利用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

珍珠龙胆石斑鱼是实验室保活流通试验中刚死亡的鱼,鱼体完整、健康,个体质量为(500±50)g。取鱼肌肉,经高速组织捣碎机捣碎后,等量分装,-20 ℃冰箱保存备用。

风味蛋白酶(酶活力30 000 U/g),广西南宁东恒华道生物科技有限责任公司；柠檬酸钠,上海碧云天生物技术有限公司；分子标准品：杆菌酶(M：1 450 Da)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(M：451 Da)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(M：189 Da)、乙腈(色谱纯),西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；羟脯氨酸测试盒,南京建成生物工程研究所；盐酸(优级纯),国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HHS型电热恒温水浴锅,上海博迅实业有限公司医疗设备厂；BSA224S-CW型万分之一电子天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；Varioskan Flash型酶标仪,美国赛默飞世尔科技公司；pHS-3C型雷磁pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司；VAP450型全自动凯氏定氮仪,德国格哈特分析仪器有限公司；L-8900型全自动氨基酸分析仪,日本日立公司；LC20AD型高效液相色谱仪,日本岛津公司。

1.3 实验方法

1.3.1 石斑鱼肉酶解产物超滤组分的制备

采用课题组前期优化的酶法工艺[9]制备珍珠龙胆石斑鱼肉酶解产物(enzymatic hydrolysates,EH)：鱼肉与水的比例1∶3.5(g∶mL)、pH 7、温度53 ℃、风味蛋白酶添加量1 050 U/g,酶解5.5 h后煮沸灭酶,再冷却至室温,离心取上清液。分别采用8 k、5 k、3 kDa的超滤膜对酶解液进行分离,获得4种组分：EH-1(>8 kDa)、EH-2(5 k～8 kDa)、EH-3(3 k～5 kDa)和EH-4(<3 kDa)；对4种组分分别进行蒸发浓缩和真空冷冻干燥,获得4种鱼肉肽粉产品。

1.3.2 蛋白质含量测定

参考GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》,采用凯式定氮法测定鱼肉肽粉的蛋白质含量。

1.3.3 胶原蛋白含量测定

羟脯氨酸主要存在于胶原蛋白中,而在其他蛋白中含量较少,甚至不存在。本实验采用试剂盒法测定鱼肉肽粉中的羟脯氨酸含量,然后乘以换算系数转换为胶原蛋白含量。水生动物的换算系数一般为11.1[10],胶原蛋白含量计算如公式(1)所示：

胶原蛋白含量/(μg·mg-1)=羟脯氨酸含量(μg·mg-1)×11.1

(1)

1.3.4 氨基酸组成测定

参考GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》,采用酸水解进行前处理后测定鱼肉肽粉的氨基酸组成。

1.3.5 相对分子质量分布测定

参考GB/T 22729—2008《海洋鱼低聚肽粉》,采用高效凝胶过滤色谱法测定鱼肉肽粉的相对分子质量分布。

1.3.6 营养价值评价

采用氨基酸评分(amino acid score,AAS)、化学评分(chemical score,CS)、氨基酸比值(ratio of amino acid,RAA)、氨基酸比值系数(ratio coefficient,RC)、氨基酸比值系数分(score of ratio coefficient,SRC),对鱼肉肽粉进行营养价值评价[11-12]。

1.3.7 数据处理与分析

每个试验重复3次,数据用平均值±标准差表示；用SPSS软件进行单因素方差分析和Duncan多重比较进行组间显著性分析,P<0.05表示显著性差异。

2 结果与分析

2.1 鱼肉肽粉的粗蛋白和胶原蛋白含量测定

从表1可知,石斑鱼肉肽粉中粗蛋白含量较高,达到63%以上,是优质的蛋白质来源。包斐[13]采用酶解法制备长蛇鲻鱼肉蛋白粉,其蛋白含量高达74.68%,略高于本实验结果,这可能与酶解制备工艺有关,还可能与鱼的品种有关。石斑鱼肉肽粉的胶原蛋白含量较低,在5%左右。张延华等[14]测定了鲈鱼、鮻鱼、草鱼和鲤鱼等鱼肉中的胶原蛋白,其含量与本实验结果接近。虽然石斑鱼肉肽粉中胶原蛋白含量偏低,但其具有较强的抗氧化等生物活性,可以增强其肽粉的功能特性。

2.2 鱼肉肽粉的氨基酸组成

从表2可知,EH-2未检出天冬氨酸和丝氨酸,EH、EH-1、EH-3、EH-4均含有16种氨基酸；5种鱼肉肽粉均含有7种人体EAA(色氨酸未测),总氨基酸含量(total amino acids,TAA)在16.47～18.81 g/100 g,EAA含量在11.11～13.44 g/100 g,其EAA占TAA的比例在67.09%～71.52%。F值是指支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)与芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸)含量的比值,F值越大说明蛋白质潜在的生物活性可能越好[15]。从表2可知,鱼肉肽粉经过超滤分离后,各分离组分的F值比未分离EH高,说明超滤分离可以提高肽粉的潜在生物活性功能。

从表2还可知,石斑鱼肉肽粉的亮氨酸含量最高(2.95～3.85 g/100 g),较高的亮氨酸水平饮食对激活胰岛素信号通路有着重要作用,从而增强机体的糖酵解和脂肪酸的合成[16],此外,与亮氨酸同属于支链氨基酸的缬氨酸和异亮氨酸的含量也比较丰富,有增强免疫力、防止肌肉损伤的功能。石斑鱼肉肽粉的赖氨酸含量也较高,占氨基酸总量的8.6%以上。赖氨酸是谷物类食品的第一限制氨基酸,故石斑鱼肉肽粉可作为以谷物为主的膳食模式的赖氨酸补充剂,同时赖氨酸还具有促钙吸收、促食欲、促进幼儿生长发育、减轻焦虑等功能[17]。石斑鱼肉肽粉的苯丙氨酸含量也较高,达到了1.96 g/100 g以上。苯丙氨酸可以调节人体中酪氨酸的浓度[18],合成神经递质和激素,参与机体代谢。石斑鱼鱼肉肽粉的精氨酸同样含量丰富,均在1.7 g/100 g以上,占TAA含量的10%左右。精氨酸是婴儿的EAA,也是人体多种物质的合成底物,如肌酸、NO、多胺、脯氨酸、谷氨酸和高精氨酸等,与血管舒张、免疫、神经传递、能量代谢和预防多个系统的功能障碍有关[19]。因此,石斑鱼肉肽粉是一种较好的人体EAA来源,可作为开发适合各年龄阶段的功能食品原料。

2.3 鱼肉肽粉的呈味特征

蛋白酶解产物的呈味特征很大程度取决于氨基酸的种类与含量[20]。味道强度值(taste activity value,TAV)是评价呈味物质对呈味特征贡献程度的重要指标,它是指呈味物质的浓度与其呈味阈值的比值。当TAV<1时,该呈味物质对呈味特征的贡献较小；TAV越大说明该呈味物质对呈味特征的贡献越大。石斑鱼肉肽粉的呈味特征见表3。石斑鱼肉肽粉的呈味特征为苦味>鲜味>甜味。且除脯氨酸和酪氨酸TAV<1外,鱼肉肽粉中其他氨基酸TAV均>1。

谷氨酸和天冬氨酸能为食品提供鲜味,决定食品的鲜美程度,且普遍认为谷氨酸对鲜味的作用大于天冬氨酸,同时各组分谷氨酸的TAV值均>天冬氨酸的TAV值,因此,谷氨酸是石斑鱼肉肽粉的主要鲜味来源。各组分的甜味氨基酸TAV值均为丙氨酸最高,明显高于其他甜味氨基酸,是甜味的主要来源。研究表明[15],丙氨酸是水产品中重要的甜味氨基酸,可与谷氨酸等鲜味氨基酸协同呈鲜。

蛋氨酸、精氨酸、赖氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等为鱼肉肽粉贡献较多的苦味,故该肽粉整体呈现苦味。有研究表明[23],水产蛋白的酶解产物通常具有一定的苦味,这是由于在酶解过程中大分子蛋白质水解成小肽,较多的疏水性氨基酸和碱性氨基酸暴露。根据相关研究[24],含有苦味的物质分子质量在1 kDa以下的占85.1%,而鱼肉肽粉正是小分子肽产品。通过促进多肽的卷曲,使疏水性氨基酸隐藏在肽链内部,以及深度酶解促使疏水性氨基酸残基转化为游离氨基酸,都能使肽粉的苦味减少[25]。

2.4 鱼肉肽粉的营养价值评价

AAS和CS是评价氨基酸营养价值最主要的方法,但是具有片面性,而世界卫生组织(World Health Organization,WHO)/联合国粮食及农业组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)提出以氨基酸模式来评价蛋白质营养价值,同时根据氨基酸模式来计算RAA、RC以及SRC,可以较为直观反映样品氨基酸含量偏离氨基酸模式的程度及EAA对氨基酸平衡的影响[26],综合运用这些方法可以较为全面、准确地评价样品的相对营养价值。

AAS是指样品中某种EAA的含量与FAO/WTO推荐的理想蛋白同种氨基酸含量的比值,其中最小的AAS值就是该样品的氨基酸评分,AAS最小的EAA被称为该样品的第一限制氨基酸。如果样品中某种EAA的AAS<1,说明该样品的EAA模式不满足FAO/WTO推荐的理想蛋白模式,其蛋白质的营养价值偏低；如果样品所有EAA的AAS都>1,说明该样品的蛋白质营养价值较高。

石斑鱼肉肽粉的AAS为1.56(表4),经超滤处理后除了EH-2组分外,其他分离组分的AAS均>1,这也说明石斑鱼肉肽粉及其超滤分离组分均有较高的营养价值。李慧凝等[27]以酶解法制备鲣鱼肽,鲣鱼肽的AAS均近似或大于1.0。因此,从蛋白质角度来讲,鱼肉肽具有较高的营养价值。

CS是指样品中某种EAA含量与鸡蛋蛋白中同种氨基酸含量的比值,其比值的意义与AAS一样。石斑鱼肉肽粉的CS分别为1.19、1.19、0.32、1.12、1.10(表5),说明除EH-2外其他组分的蛋白质营养价值在一定程度上优于鸡蛋蛋白质。

蛋白质的营养价值与其EAA的种类、数量及平衡状态密切相关。从表6可知,石斑鱼肉肽粉的EAA占TAA的比值除EH-2组分的苏氨酸外,均优于模式值。石斑鱼肉肽粉EAA中亮氨酸占比特别高,为模式值的2.5倍以上；苯丙氨酸+酪氨酸以及赖氨酸占比也较高,为模式值的2倍左右。单个氨基酸占比过高或过低于模式值均会影响氨基酸平衡,但是各组分的EAA占比的变化规律与模式值相似。总体而言,该肽粉的EAA种类齐全,含量丰富,且组成合理,是1种优质氨基酸产品。

通过计算EAA的RAA、RC、SRC来评价样品的营养价值。从表7可知,EH-3的SRC值最高达到了80.43,EH-2的SRC值较低为53.44,各样品的氨基酸平衡性为：EH-3>EH-1>EH>EH-4>EH-2,且蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸及苯丙氨酸+酪氨酸的RC值接近1,表明5种EAA含量比例与氨基酸模式最接近。各组分的亮氨酸的RC值最高,但苏氨酸和缬氨酸的RC值均<1,EH、EH-1、EH-2的第一限制氨基酸为苏氨酸,同时EH-2的苏氨酸RC值只有0.19,对氨基酸平衡起着很大的负作用；而EH-3、EH-4的第一限制氨基酸为缬氨酸。综上所述,石斑鱼肉肽粉是1种营养价值较高的海洋来源蛋白。

2.5 鱼肉肽粉的相对分子质量分布

根据实验前期结果[9]及SRC,选取石斑鱼肉肽粉中抗氧化活性较高同时比值系数分最高的组分EH-3,分析其相对分子质量分布。EH-3分子质量为249 Da,且EH-3组分中分子质量在1 kDa以下的含量为97%,说明经过酶解之后的鱼肉大部分降解为小分子肽,容易被人体吸收[29]。巫楚君等[30]通过复合蛋白酶酶解黄鳍金枪鱼肉,其酶解产物分子质量大部分在1 kDa以下,本试验结果与之相似。

3 结论

珍珠龙胆石斑鱼肉肽粉是一种高蛋白食物,粗蛋白质含量达63.41%以上；鱼肉肽粉的EAA组成齐全、含量丰富、比例相对均衡,具有较高的营养价值。经过超滤分离的石斑鱼肉肽粉为开发具有多种生物活性功能产品提供了优质的原料,然而肽粉还呈现出一定的苦味,如何消减或消除肽粉的苦味还有待于进一步深入研究。

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Amino acid composition analysis and nutrition value evaluation of peptide powder from grouper muscle

XU Jie1,LIAO Jin2,LIN Ze’an1,TANG Zhendong1,FAN Xiuping1,3,4*,SUN Qinxiu1,3,4,LIU Shucheng1,3,4*,SU Weiming1

1(College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety,Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center of Marine Food,Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution,Zhanjiang 524088,China) 2(Department of Food Science and Engineering,Jinan University,Guangzhou 510632,China) 3(Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory,Zhanjiang 524088,China) 4(Collaborative Innovation Center of Seafood Deep Processing,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China)

Abstract Using grouper muscle as material, enzymatic hydrolysate was prepared by biological enzymatic hydrolysis and was separated by ultrafiltration. The crude protein content and amino acid compositions of enzymatic and ultrafiltration hydrolysate were analyzed, and their nutritional value was evaluated. The results showed that the crude protein content of enzymatic and ultrafiltration hydrolysate was 63.41%-67.53% and the content of collagen was 3.65%-5.97%. The ratio of essential amino acids to total amino acids was 67.09%-71.52%. The essential amino acids of enzymatic and ultrafiltration hydrolysate were complete, rich and relatively balanced in proportion which with high nutritional value. The peptide powder from grouper muscle separated by ultrafiltration provides high quality raw materials for the development of products with a variety of bioactive functions.

Key words enzymatic hydrolysate; protein; amino acid; nutrition value; Epinephelus fuscoguttatus×E.lanceolatus

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.028583

引用格式:徐杰,廖津,林泽安,等.石斑鱼肉肽粉的氨基酸组成分析与营养价值评价[J].食品与发酵工业,2021,47(23):221-226.XU Jie,LIAO Jin,LIN Ze’an,et al.Amino acid composition analysis and nutrition value evaluation of peptide powder from grouper muscle[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(23):221-226.

第一作者：硕士研究生(范秀萍博士和刘书成教授为共同通讯作者，E-mail: fanxp08@163.com；Lsc771017@163.com)

基金项目：南方海洋科学与工程广东省实验室(湛江)资助项目(ZJW-2019-06)；广东普通高等学校海洋食品绿色加工技术研究团队(2019KCXTD011)；广东省大学生创新创业训练计划项目(S201810566063)

收稿日期：2021-07-07,改回日期：2021-08-08