RRLC-MS/MS法测定酒类产品中11种非法添加利尿组分

酒类产品品种繁多,口味独特,在社交娱乐及养生保健方面都占有重要的位置。酒类产品中添加利尿剂能够促进机体快速排尿,去除饮酒而带入体内的大量水分。利尿剂通过选择性阻断钠-钾-氯等共同转运体来促进尿液中钠和水的排泄[1-2]或保钾以达到排钠排尿的作用,部分利尿剂联合使用可以起到更好的利尿效果[3]。但人体长期摄入利尿剂易引起低血钠、低血钾、低血镁等电解质紊乱及高尿酸血症等代谢紊乱症状,同时存在痉挛、尿频等其他不良反应[1-4],严重影响身体健康,必须严格控制机体的摄入来源。

目前,保健食品及中成药中非法添加化学药物的检测主要是先通过液相色谱法进行色谱分离初筛,采用保留时间和紫外吸收光谱初步定性,初筛为阳性的样品经液相色谱-串联四级杆质谱法、液相色谱-飞行时间质谱法或液相色谱-离子阱/轨道阱进行确证[5-7]。液相色谱法的分离能力有限,复杂基质的样品中干扰峰较多,增加了分离的难度和色谱分析的时间；液相色谱质谱法灵敏度较高,且各化合物之间在保留时间上不必完全分离,其中液相色谱-飞行时间质谱法和液相色谱-离子阱/轨道阱属于高分辨检测仪器,在未知化合物的碎片解析及已知化合物的定性确证方面应用较多,定量能力有待改进[8-11]；液相色谱-串联四级杆质谱法抗干扰能力较强,可针对每个化合物设定专有通道进行检测,且精密度较好,适合多种已知的化合物同时进行定性、定量分析检测[12]。

本文涉及的11种化合物中个别化合物因不同的功效在不同的基质中被检出的情况已有报道,所涉及的基质包括尿液、保健食品和化妆品[13-16],所涉及的检测技术包括液相色谱法初筛后经气相色谱-质谱法[13]或液相色谱-离子阱/轨道阱进行定性确证[14-15]、通过液相色谱-串联四级杆质谱法直接进行定性和定量分析[16],其中气相色谱-质谱法确证前需要进行衍生化处理,衍生过程繁琐且衍生物不稳定[13]。酒类产品中11种利尿化合物的定性定量检测未见报道。综上,本文建立酒类产品中非法添加利尿组分的快速分离液相色谱-质谱联用(rapid resolution liquid chromatography-mass spectrometry,RRLC-MS/MS)方法,上机后可在13 min内同时完成11种利尿化合物的定性及定量检测,方法筛查效率高、灵敏度高、准确性强,为监督酒类产品质量和打击酒类产品中非法添加利尿组分行为提供有力的技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Agilent 1260 prime-6470A液相色谱-串联四极杆质谱仪,美国Agilent公司；Sartourious BT125D十万分之一电子天平,德国赛多利斯公司；AS 20500B超声波清洗器,天津奥特赛恩斯仪器有限公司；Milli-Q超纯水系统,美国Millipore公司。

1.2 材料与试剂

对照品：氢氯噻嗪(批号 100309—201103，含量99.8%)、茶碱(批号100121—201805，含量99.9%)、米诺地尔(批号100238—201702，含量99.7%)、氨苯蝶啶(批号100429—201602，含量99.8%)、呋塞米(批号100544—201503，含量99.3%)、吲达帕胺(批号100257—201605，含量97.7%)、螺内酯(批号100193—201704，含量99.9%)、非洛地平(批号 100717—201403，含量99.6%)，中国食品药品检定研究院；苄氟噻嗪(批号100007—200703，含量100%)、环戊噻嗪(批号100188—199701，含量100%)，中检所；坎利酮(批号MS190929—20，含量98.06%)，Stanford Chemicals。

样品：从山东省青岛市的超市和便利店采购10批酒类产品,涉及啤酒、葡萄酒、果酒、黄酒4种类型,其中啤酒3批,葡萄酒3批,果酒2批,黄酒2批。

甲醇、乙腈,色谱纯，德国默克；甲酸(色谱纯),赛默飞世尔科技有限公司；水为超纯水。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

1.3.1.1 对照品溶液的制备

分别精密称取11种化合物对照品10 mg至10 mL量瓶中,加入甲醇4 mL,振摇溶解,螺内酯、茶碱需超声处理(功率100%,频率40 kHz)5 min,并振摇溶解,冷却至室温,用甲醇稀释至刻度,摇匀；精密量取上述对照品溶液各0.1 mL至10 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀；精密量取上述对照品溶液各1 mL至25 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,作为对照品的上机参数优化用溶液。

精密称取11种化合物对照品各50 mg至同1个50 mL量瓶中,加入甲醇25 mL,超声处理(功率100%,频率40 kHz)5 min,并振摇使溶解,冷却至室温,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得质量浓度为1 mg/mL的混合对照品溶液；精密量取上述混合对照品溶液0.1 mL至50 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得2 μg/mL的混合对照品溶液；精密量取上述混合对照品溶液50、100、300、500、1 000 μL至10 mL量瓶中,用甲醇-水(体积比9∶1)稀释至刻度,摇匀,作为线性方程用系列对照品溶液,质量浓度分别为0.01、0.02、0.06、0.1、0.2 μg/mL。

1.3.1.2 样品溶液的制备

精密称取样品约0.5 g至100 mL具塞比色管中,加入甲醇5 mL,超声处理(功率100%,频率40 kHz)提取5 min,冷却至室温,用甲醇定容至刻度,摇匀；精密量取上述溶液0.1 mL至100 mL量瓶中,用甲醇-水(体积比9∶1)稀释至刻度,摇匀,过0.22 μm的微孔滤膜即得样品溶液。

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse plus C18 Rapid Resolution HD色谱柱(3.0 mm×50 mm,1.8 μm)；流动相：以0.1%(体积分数)的甲酸溶液为流动相A,以含0.1%(体积分数)甲酸的甲醇为流动相B,梯度洗脱(0～3 min：95%A→60%A；3～8 min：60%A →20%A；8～10.5 min：20%A→ 20%A；10.5～10.7 min：20%A→ 95%A；10.7～16.0 min：95%A)；流速0.3 mL/min；进样量5 μL；柱温30 ℃。

实验采用电喷雾离子源(AJS ESI),各化合物分别在正离子或负离子模式下通过动态多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式进行测定；干燥气温度为300 ℃；干燥气流速为9 L/min；雾化气压力为37 psi；鞘气温度为350 ℃；鞘气流速为11 L/min；正离子模式时,毛细管电压为3 600 V,喷嘴电压为400 V；负离子模式时,毛细管电压为 3 000 V,喷嘴电压为400 V；质谱的碰撞气为高纯氮气。11种化合物22个通道优化后的动态MRM方法中母离子、定性子离子、定量子离子、碎裂电压及碰撞能量等参数见表1,11种化合物的提取离子色谱图见图1。

1.3.4 基质效应和方法专属性的考察

实验选取啤酒、葡萄酒、果酒、黄酒4种类型的阴性样品基质进行等体积混合,得到混合基质溶液。用甲醇-水(体积比9∶1)配制50 ng/mL的纯溶剂混合标准溶液,待测；精密称取混合基质溶液0.5 g至100 mL具塞比色管中,加入1.3.1.1中1 mg/mL的混合对照品溶液5 mL,按照1.3.1.2的方法制备得到50 ng/mL的混合基质加标溶液,待测。将50 ng/mL的纯溶剂混合标准溶液和50 ng/mL的混合基质加标溶液上机测定,通过计算2种溶液中化合物的响应值百分比来考察基质效应的影响[17-19]。

实验选取啤酒、葡萄酒、果酒、黄酒4种类型的阴性样品,分别按照1.3.1.2的制备方法得到空白基质溶液,按1.3.2和1.3.3的方法进样测定,考察方法的专属性。

1.3.5 方法的线性、检出限、定量限和回收率

将1.3.1.1中制备的线性方程用系列对照品溶液按照1.3.2和1.3.3项下的色谱条件和质谱条件进行测定,以化合物的质量浓度(μg/mL)为横坐标,以定量离子对的峰面积为纵坐标绘制线性方程。以3倍信噪比计算各化合物的检出限,以10倍信噪比计算各化合物的定量限。精密称取1.3.4中混合基质溶液0.5 g至100 mL具塞比色管中,加入1.3.1.1中1 mg/mL的混合对照品溶液10 mL,按照1.3.1.2的方法制备得到100 ng/mL的混合基质加标溶液,平行制备6份,按1.3.2和1.3.3的方法进样测定,计算平均回收率和相对标准偏差。

1.4 数据分析

数据分析采用美国Agilent公司的QQQ Quantitative Analysis程序软件和Microsoft Office Excel 2007软件,绘图采用Microsoft Office Excel 2007软件。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

实验选用1.3.1.1的对照品上机参数优化用溶液上机,对11种化合物分别进行ESI+和ESI-条件下的一级全扫,根据一级全扫结果确认化合物的电离模式,并选定合适的母离子,通过设定不同的碎裂电压,以母离子的响应强度为观察目标选定最优碎裂电压,在此碎裂电压下进行目标母离子的二级全扫,选择强度最大的2个碎片离子分别进行碰撞能量的优化,在最优碎裂电压和最优碰撞能量下响应强度最大的定为定量子离子,响应强度次之的定为定性子离子,综合11种化合物的上述参数建立该11种化合物的MRM方法。为充分提高每种化合物的灵敏度,实验在MRM方法参数的基础上根据保留时间建立了11种化合物22个通道的动态MRM方法。

2.2 色谱条件的优化

在前期的实验基础上,选取了0.1%甲酸溶液-含0.1%甲酸的甲醇和0.1%甲酸溶液-含0.1%甲酸的乙腈2种流动相体系对11种化合物的色谱行为和响应强度进行考察。流动相为0.1%甲酸溶液-含0.1%甲酸的乙腈条件下,砍利酮、螺内酯响应较弱,氨苯喋啶响应较强；流动相为0.1%甲酸溶液-含0.1%甲酸的甲醇条件下,氨苯喋啶响应略有降低,但其他化合物响应与前一种流动相体系相比无较大影响或有增强。综合考虑化合物的出峰时间、分离情况和响应强度,实验选用0.1%甲酸溶液作为流动相A,含0.1%甲酸的甲醇作为流动相B进行测定。基于上述色谱条件,结合优化后的质谱参数,建立11种化合物22个通道的快速液相色谱-串联四级杆质谱联用方法。

2.3 溶剂的优化

以0.1%的甲酸溶液为流动相A,以含0.1%甲酸的甲醇为流动相B,考察对照品和样品上机前最后一步的稀释溶剂,实验选定甲醇-水(体积比1∶9)、甲醇-水(体积比5∶5)、甲醇-水(体积比9∶1)与甲醇共4种溶剂进行溶解并测定,结果见图2,发现氨苯喋啶、氢氯噻嗪、非洛地平的响应随着甲醇浓度的升高而增强,纯甲醇作为溶剂时响应最强,略高于甲醇-水(体积比9∶1)作为溶剂时的响应强度；其余化合物均在甲醇-水(体积比9∶1)作为溶剂时响应最强。

为充分提高化合物的灵敏度,综合考虑,实验选定甲醇-水(体积比9∶1)作为对照品和供试品上机前最后一步的稀释溶剂。

2.4 基质效应和方法专属性

将1.3.4中50 ng/mL的纯溶剂混合标准溶液和50 ng/mL的混合基质加标溶液上机测定,计算2种溶液中化合物的响应值百分比,结果发现,氨苯喋啶、米诺地尔等响应值百分比大于1,呈现基质抑制效应,环戊噻嗪、苄氟噻嗪、氢氯噻嗪响应值百分比小于1,呈现基质增强效应,吲哒帕胺、螺内酯、砍立酮等基质效应影响不大。结果表明11种化合物的基质效应均在77.4%～112.8%,因为非法添加药物的添加剂量一般需要添加到能够发挥药效的剂量,通常为毫克级别,不属于痕量检测,所以常见的4种类型的阴性样品基质对该11种化合物的基质效应影响在可接受范围内[20]。

按照1.3.4考察该方法的专属性,结果发现4种类型的22个通道中均未见有干扰11种目标化合物的色谱峰,方法的专属性较好。

2.5 方法的线性、检出限、定量限和回收率

按照1.3.5的方法得到的线性方程、检出限和回收率结果见表2。11种化合物在本实验的线性范围内均具有良好的相关性,相关系数均大于0.999 0；以3倍信噪比计算的11种化合物的检出限在0.8～133.9 ng/g,定量限在2.7～446.3 ng/g,灵敏度较高；6份加标样品中11种化合物的平均回收率为88.3%～105.3%,平均相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.3%～2.2%,回收率较高。

2.6 样品测定

将1.2中10批酒类市售产品按照1.3.1.2方法制备,按照1.3.2和1.3.3方法上机测定,通过比较供试品和对照品中11种化合物的定性离子对和定量离子对的保留时间、定性离子对与定量离子对的离子比率进行定性,以定量离子对的峰面积进行外标法定量。结果发现样品中均未检出11种目标成分,这可能与该10批样品均为大型超市购买的正规市售产品有关。

3 结论

本研究首次建立了一种快速筛查酒类产品中非法添加11种利尿组分的RRLC-MS/MS方法,可在13 min内同时完成该11种化合物的定性筛查和定量检测,方法操作简便、筛查效率高,具有较好的方法专属性和较高的灵敏度,重复性好,对酒类产品的安全监督及风险性筛查工作具有重要意义。

[1] LOGGIE J M H,KLEINMAN L I,VAN MAANEN E F V.Renal function and diuretic therapy in infants and children.Part I[J].The Jounal of Pediatrics,1975,86(4):485-496.

[2] 王海军.噻嗪类利尿药在高血压治疗中的应用效果观察及药学分析[J].临床医药文献电子杂志,2018,5(83):162-163.

WANG H J.Pharmacy analysis and effect of thiazide diuretic in hypertension treatment[J].Journal of Clinical Medical Literature,2018,5(83):162-163.

[3] KAO L C,WARBURTON D,SARGENT C W,et al.Furosemide acutely decreases airways resistance in chronic bronchopulmonary dysplasia[J].The Journal of Pediatrics,1983,103(4):624-629.

[4] CHAPMAN M D,HANRAHAN R,MCEWEN J,et a1.Hyponatraemia and hypokalaemia due to indapamide[J].The Medical Journal of Australia,2002,176(5):219-221.

[5] 国家食品药品监督管理局.20090230 国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件[S].北京:国家食品药品监督管理局,2009.

National Food and Medical Products Administration.20090230 Approval of supplementary inspection methods and inspection items for drug inspection from National Food and Medical Products Administration[S].Beijing:National Food and Medical Products Administration,2009.

[6] 国家食品药品监督管理局.2009024 国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件[S].北京:国家食品药品监督管理局,2009.

National Food and Medical Products Administration.2009024 Approval of supplementary inspection methods and inspection items for drug inspection from National Food and Medical Products Administration[S].Beijing:National Food and Medical Products Administration,2009.

[7] 国家食品药品监督管理局.2009029 国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件[S].北京:国家食品药品监督管理局,2009.

National Food and Medical Products Administration.2009029 Approval of supplementary inspection methods and inspection items for drug inspection from National Food and Medical Products Administration[S].Beijing:National Food and Medical Products Administration,2009.

[8] 王军,李铁健,曲喜龙,等.超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法定性分析奥利司他氢化液中的杂质[J].分析测试学报,2019,381(12):1 450-1 457.

WANG J,LI T J,QU X L,et al.Qualitative analysis of impurities in orlistat hydrogenation solution by ultrahigh performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry[J].Journal of Instrumental Analysis,2019,38(12):1 450-1 457.

[9] 李庆运,花磊,何梦琦,等.高气压光电离-化学电离-飞行时间质谱在绿茶香型快速鉴别中的应用[J].分析化学,2019,47(4):541-549.

LI Q Y,HUA L,HE MQ,et al.High-pressure photoionization/chemical ionization-time-of-flight mass spectrometry for classification and identification of green tea aromas[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry,2019,47(4):541-549.

[10] 谢博,傅红,杨方.UPLC-Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用鉴别掺假蜂蜜[J].食品工业科技,2020,41(2):244-251.

XIE B,FU H,YANG F.Identification of adulterated honey by UPLC-Q-exactive quadrupole-electrostatic field track trap high resolution mass spectrometry[J].Science and Technology of Food Industry,2020,41(2):244-251.

[11] 刘宇文,邹耀华,殷红妹.高分辨四级杆串联飞行时间质谱快速鉴定一种他达拉非衍生物[J].中国药学杂志,2016,51(23):2 059-2 062.

LIU Y W,ZOU Y H,YIN H M.Identification of a tadalafil analogue based on Q-TOF-MS[J].Chinese Pharmaceutical Journal,2016,51(23):2 059-2 062.

[12] 李卓,张亚锋,孙晓,等.超高效液相色谱-串联质谱法测定抗疲劳类保健食品及补肾壮阳类中成药中15 种添加药物[J].药物分析杂志,2019,39(6):1 127-1 133.

LI Z,ZHANG Y F,SUN X,et al.Determination of 15 additives in invigorant Chinese patent medicines and antifatigue dietary supplements by PULC-MS/MS[J].Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis,2019,39(6):1 127-1 133.

[13] 秦旸,朱绍棠,张长久.兴奋剂中利尿剂的检测方法[J].分析测试学报,2001,20(2):82-86.

QIN Y,ZHU S T,ZHANG C J.Determination of diuretics in doping[J].Journal of Instrumental Analysis,2001,20(2):82-86.

[14] 国家食品药品监督管理局.2009032国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件[S].北京:国家食品药品监督管理局,2009.

National Food and Medical Products Administration.2009032 Approval of supplementary inspection methods and inspection items for drug inspection from National Food and Medical Products Administration[S].Beijing:National Food and Medical Products Administration,2009.

[15] 国家食品药品监督管理局.2009031国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件[S].北京:国家食品药品监督管理局,2009.

National Food and Medical Products Administration.2009031 Approval of supplementary inspection methods and inspection items for drug inspection from National Food and Medical Products Administration[S].Beijing:National Food and Medical Products Administration,2009.

[16] 国家食品药品监督管理总局化妆品标准专家委员会.化妆品安全技术规范[M].北京:人民卫生出版社,2017.

Expert Committee on Cosmetic Standards in National Food and Medical Products Administration.Technical Code for safety of cosmetics[M].Beijing:People’s Medical Publishing House,2017.

[17] 何小琴,郗存显,唐柏彬,等.超高效液相色谱-串联质谱法快速测定口服液中非法添加的25种激素[J].分析测试学报,2014,33(6):635-641.

HE X Q,XI C X,TANG B B,et al.Rapid Determination of illegally added 25 hormones in oral by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Journal of Instrumental Analysis,2014,33(6):635-641.

[18] 王兴龙,蔡强,诸寅,等.直接稀释/超高效液相色谱-串联质谱法测定河豚鱼与织纹螺中2种河豚毒素[J].分析测试学报,2020,39(5):640-645.

WANG X L,CAI Q,ZHU Y,et al.Analysis of to kids of tetrodotoxins in puffer fish and nassarius by ultra high performance Liquid chromatography-tandem mass spectrometry with direct dilution approach[J].Journal of Instrumental Analysis,2020,39(5):640-645.

[19] 郭常川,孙华,石峰,等.Orbitrap高分辨质谱法高通量筛查生化药品、中成药与保健品中非法添加的13种消化类化学药物[J].分析测试学报,2018,37(3):300-306.

GUO C C,SUN H,SHI F,et al.High-throughput screening of 13 digestive drugs adulterated illegally in biochemical drugs,Chinese patent medicines and dietary supplements by orbitrap high-resolution mass spectrometry[J].Journal of Instrumental Analysis,2018,37(3):300-306.

[20] 王超,祝波,杨钊.RRLC-MS/MS法同时测定保健食品中31种降糖、降压、降血脂类非法添加化学药物[J].中国药师,2019,22(10):1 946-1 950.

WANG C,ZHU B,YANG Z.Determination of 31 anti-diabetic,anti-hypertensive and anti-hyperlipemia compounds illegally added to health foods by RRLC-MS/MS[J].China Pharmacist,2019,22(10):1 946-1 950.