我国传统的白酒酿造工艺中,酿酒微生物参与酒精及其香味物质的形成,赋予白酒特有的风味[1]。虽然白酒产量一直处于高速发展阶段,但名优白酒酿造受到严苛的酿造环境制约,优质酒的供需矛盾反而越来越尖锐。目前,提出了白酒生态发酵技术,通过重视微生态系统建立起完善的科学理论体系,进一步实现以质能提升代替量能提升[2]。
白酒中含有大量潜在的小分子生物活性物质,其中短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)在白酒中含量较高,对发酵酒醅酸度的变化起主要贡献,乙酸、丙酸、丁酸等SCFAs与多种醇类形成的酯类是白酒典型风味形成的关键。同时,对肠道稳态对人体健康具有重要意义[3-5],与酒精性肝脏疾病进程联系密切。研究表明,SCFAs(乙酸、丙酸和丁酸)在低浓度时有一定的抗炎作用,揭示了酒类、醋类的保健作用[6-8]。因此研究SCFAs在清香型白酒中的含量变化本身具有意义。
清香型白酒地缸发酵过程中核心微生物菌群易受温度、酸度、原料等外界环境因素的影响,进而影响酒体的风味与品质[9]。每年9月初立醅,开始新一轮的生产,在实际生产中发现该时期出酒率正常,但原酒中存在总酸、总酯的含量较低等问题。夏季挑醅期气温升高,细菌生长旺盛,导致酒醅升酸高但出酒率低,酒体易出现酸高,乳酸乙酯与乙酸乙酯比例不协调现象。解决这一系列问题需要从不同产酸环境着手研究。近年来,对清香型白酒不同生产周期的研究开始有报道,如对汾酒立醅与圆排期酿酒过程微生物群落结构和风味物质的研究,结果表明耐酸乳杆菌的缺失是造成两时期发酵差异的主要因素[10]。从四季发酵过程微生物菌群与风味代谢差异中,找到关键驱动因素[11]。
但对于立醅与挑醅期的对比鲜见有相关研究。本文以解决生产中的实际问题为切入点,通过监测立醅及挑醅生产环境中的产酸微生物及与产酸直接相关的SCFAs动态变化,揭示两个时期发酵过程在产酸方面的显著性差异,对科学把控发酵进程和发酵工艺现代化升级改造具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 样品采集
发酵过程酒醅样品取样于山西杏花村汾酒厂股份有限公司,采样时间点为大茬发酵0、7、15、28 d,选择全厂有代表行的4个车间的4个班组作为平行样品,每个酒醅样品300 g。样品挖取地缸表面中心向下30 cm处各3个,共120个样品。用无菌袋采样后迅速放置冰盒内,取样时间与样品处理时间隔不超过20 min。
酒体取样于对应4个车间的大茬蒸馏后的原酒,共8个。
1.2 主要试剂与仪器
MRS培养基，索莱宝；两性霉素，VWR Life Science；冰乙酸(≥98.0%)、乳酸(≥90.0%)、无水乙醇(≥99.5%)，国药。
标准品：乙酸乙酯(GC-MS级)，Merck；乙酸(≥99.5%)、异丁酸(>99.0%)、磷酸，国药；丙酸(>99.0%)、丁酸(>99.0%)、戊酸(>98.0%)、异戊酸(>99.0%)，TCI；己酸(≥99.5%)、异己酸(98%)，阿拉丁。
Agilent 7890A/5975C气-质联用仪、Agilent DB-WAX 毛细管柱30 m×0.25 mm ID×0.25 μm，安捷伦；WT3003N 电子天平，奥豪斯；QL-866涡旋仪，赛洛捷克；H1650-W冷冻离心机，湖南湘仪；LT-36VLC8人工气候生长培养箱，PERCIVAL；ZHJH-C1109C超净工作台，上海智诚；MAC-350P高压灭菌锅，日本SANYO；Milli Q Plus超级纯水仪，Bio-Rad；WP750中型机械微波炉，广东格兰仕；LQ-300DE超声波清洗机，昆山舒美。
1.4 酒醅产酸菌培养方法
1.4.1 培养基配制
MRS培养基+两性霉素(乳酸菌)[12]：胰蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,酵母提取物5 g,K2HPO4 2 g,柠檬酸二铵2 g,乙酸钠5 g,葡萄糖20 g,吐温80 mL,MgSO4·7H2O 0.58 g,MnSO4·4H2O 0.25 g,蒸馏水1 L,调pH至6.2～6.4,121 ℃灭菌15 min。
1.4.2 酒醅样品产酸菌的分离培养及计数
取10 g酒醅样品溶于90 mL无菌水中,充分混匀,形成10-1的菌悬液,作为原液。依次10倍稀释,制成6个梯度的悬浊液,分别吸取100 μl涂布于相应培养基中,做3组平行。37 ℃培养箱培养。3 d后取出,计数统计。
每克样品中乳酸菌数=同一稀释度3个培养皿的菌落平均数×稀释倍数×10
1.5 短链脂肪酸检测
1.5.1 标准品配制
称量乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸标准品,用乙酸乙酯配制成0.1,0.5,1,5,10,20,50,100 μg/mL八个混合标准质量浓度梯度。取600 μL标准品,加入25 μL终浓度为500 μmol/mL的4-甲基戊酸作为内标,混匀加入进样瓶,进行GC-MS检测,进样量1 μL,分流比10∶1,分流进样。
1.5.2 代谢物提取
将样品冰上解冻,取 200 mg样品于2 mL玻璃离心管中。加入900 μL 0.5%的磷酸重悬,振荡混匀2 min；14 000×g离心10 min,取上清液800 μL,加入等量的乙酸乙酯提取,振荡混匀2 min,14 000×g离心10 min；取600 μL上层有机相,加入终浓度为500 μmol/L的4-甲基戊酸作为内标,混匀加入进样瓶,进行GC-MS检测,进样量1 μL,分流比10∶1,分流进样。
1.5.3 色谱-质谱分析
气相色谱条件：样品采用Agilent DB-WAX毛细管柱气相色谱系统进行分离。程序升温：初始温度90 ℃；以10 ℃/min升温至120 ℃；再以5 ℃/min升温至150 ℃；最后以25 ℃/min升温至250 ℃,并维持2 min。载气为氦气,载气流速1.0 mL/min。
质谱分析：采用Agilent 7890A/5975C气-质联用仪进行质谱分析。进样口温度250 ℃；离子源温度230 ℃；传输线温度250 ℃,四极杆温度150 ℃。电子轰击电离(EI)源,全扫及SIM扫描方式,电子能量70 eV。
1.5.4 数据处理
采用MSD ChemStation软件提取色谱峰面积及保留时间。绘制标曲曲线,计算样品中SCFAs的含量。
2 结果与分析
2.1 立醅与挑醅期发酵酒醅样品酸度变化
酸度检测采用碱式滴定法,结果如图1所示。从4个车间立醅、挑醅发酵过程均值水平酸度曲线图可知,挑醅期整个发酵期产酸高于立醅期,随发酵进程酸度递增；立醅期入缸后酸度更低,随发酵进行至7对(即7天,下同)时，两时期以相同的增长速度均呈上升趋势,而在7对时至发酵结束,挑醅期以更快的增长速度持续增长至最高,这与该时期产酸菌的迅速增长有关；立醅期则在7对时后缓慢上升至最高,两个时期在出缸时酸度相差最多为2.22。
图1 立醅(LP)与挑醅(TP)期发酵酒醅样品酸度变化
Fig.1 Changes of acidity of fermented grains in LP and TP
2.2 立醅与挑醅期大茬发酵过程微生物生物量的动态变化
两个时期酒醅发酵过程中产酸菌生物量的变化如图2所示。立醅大茬发酵期乳酸菌总数呈马鞍形,存在二次发酵现象,发酵4对时至15对时,环境产酸较弱,乳酸菌菌落数增减变化不大,而此后时期,耐酸乳杆菌是丰度最高优势菌[13-15],乳酸菌开始增长,推测延迟发酵期有助于酒醅酸度上升；挑醅大茬发酵期乳酸菌总数变化呈先增后减趋势,产酸菌生物量高于立醅期；大茬立醅发酵期入缸平板芽胞杆菌是优势菌,而大茬挑醅发酵期入缸平板先长乳酸菌3 d后才长芽胞杆菌,推测立醅期发酵材料中富集环境的乳酸菌较少或乳酸菌活力较弱,很难较快增长；挑醅期材料产酸高,发酵前期乳酸菌增长快,发酵后期,由于还原糖不足及环境酸度过高等特殊环境,乳酸菌生长受抑制而大幅下降至无。
图2 立醅与挑醅期发酵过程中产酸菌的生物量变化
Fig.2 Viable lactic acid bacteria counts of fermented grains in LP and TP
2.3 立醅与挑醅期发酵酒醅样品及酒体SCFAs含量变化
标准品检测结果和标准曲线如表1所示。结果表明标准曲线质量较好可以用于定量分析(R2>0.99)。分别对两个时期的7种SCFAs含量变化做差异性对比,结果如图3所示。
表1 标准品信息和标准曲线
Table 1 Standard reference materials and standard curve
名称线性方程R2线性范围(μg·mL-1)乙酸y=0.685 602x-2.075 3010.998 30.5～5 000丙酸y=0.826 970x+7.918 954E-0040.999 20.01～100异丁酸y=0.984 595x-0.025 5910.999 80.01～100丁酸y=2.428 497x-0.001 0820.999 90.01～100异戊酸y=2.823 742x-0.005 3280.999 90.01～100戊酸y=2.366 914x-0.049 3180.999 10.01～100己酸y=1.898 181x-0.104 3720.998 10.01～100
由图3-a所示,立醅期入缸乙酸含量显著低于挑醅期,但在大茬发酵结束后达到同一水平。两个时期在0～7对时随发酵进行乙酸含量上升,7～15对时立醅期略有下降,挑醅期以更快的速度增长,而在15对时-出缸,立醅期乙酸迅速增长,挑醅期开始下降仍高于立醅期。立醅期较挑醅期发酵水平延滞,增加立醅期发酵对于乙酸水平的增加有正向作用。
由图3-b所示,立醅期丙酸含量显著低于挑醅期,起始含量相差12倍,为最大。产丙酸的菌群在立醅期最缺失,在环境中很难短期培养。丙酸菌在清香型白酒的中的研究极少。而丙酸菌对于酒体产香与增乙降乳都有一定的作用。
由图3-c所示,立醅期入缸异丁酸含量略低于挑醅期,但在大茬发酵结束后相差不多。两个时期在整个大茬发酵过程中异丁酸呈逐渐上升趋势,4～15对时增长缓慢,15对时至出缸发酵后期迅速增长至最高。
由图3-d所示,立醅期入缸丁酸含量显著低于挑醅期,在大茬发酵结束后相差最大。立醅整个发酵期呈递增趋势,挑醅呈先降后升趋势,入缸后至4对时稍有下降,4～14对时两个时期丁酸含量以同一水平保持不变,发酵后期,立醅期上升4倍至最高,挑醅期上升8倍增至最高。
由图3-e所示,立醅期异戊酸含量显著低于挑醅期,立醅期整个发酵过程变化不大,两个时期均呈缓慢的先增后降再迅速增长趋势,立醅期7对时开始下降,15对时上升至出缸；挑醅期4对时缓慢下降,7对时至出缸一直上升至最高,立醅较挑醅期在该指标上有延滞。
由图3-f所示,立醅期戊酸含量显著低于挑醅期,两个时期发酵变化趋势不同。挑醅期入缸与出缸时含量最高相差不多,4～15对时略微变化。立醅期在入缸至15对时基本保持不变,发酵后期开始上升,较挑醅期相差3.45倍。
a-乙酸；b-丙酸；c-异丁酸；d-丁酸；e-异戊酸；f-戊酸；g-己酸
图3 立醅与挑醅期发酵过程中各短链脂肪酸变化
Fig.3 Comparison of SCFAs dynamics of fermented grains in LP and TP
如图3-g所示,立醅期己酸含量显著低于挑醅期,两个时期发酵变化趋势不同。但与戊酸的变化趋势一致。
由图4可知,整体来看,挑醅期的SCFAs含量均高于立醅各指标含量,且乙酸、异丁酸及异戊酸在两个时期随发酵进程呈递增趋势,而己酸、戊酸及丙酸在挑醅发酵起始含量较高,随发酵进行呈先减后增趋势,在整个发酵过程中挑醅期高表达,尤其是丙酸,两时期发酵末期差异倍数最高。立醅期除乙酸、异丁酸外其他几种酸在7对时开始增长直至最高。立醅期产酸最高水平只接近于挑醅期7对时,显然,热季发酵环境对产酸水平有很大影响。
图4 立醅与挑醅期发酵过程中各短链脂肪酸变化热图
Fig.4 Heatmap of SCFAs of fermented grains in LP and TP
立醅期、挑醅期一车间的酒体乙酸含量均是最高,与该车间特殊的微生态环境下的产酸菌有关；除己酸外,热季挑醅期的SCFAs含量均高于立醅期各指标含量。热季停排对立醅发酵产酸有直接影响。
立醅期4个车间除乙酸外其他SCFAs相差不多,其中立醅期7车间原酒丙酸含量最高,其他指标均是最少含量；汾一车间除丙酸外其他SCFAs含量在立醅期均是最高；挑醅期除乙酸、戊酸外其他均是汾九车间的最高；汾十二车间的各SCFAs均是最低。
图5 立醅与挑醅期酒体中各短链脂肪酸变化热图
Fig.5 Heatmap of SCFAs of Baijiu in LP and TP
3 结论与讨论
立醅与挑醅是清香型白酒新一轮发酵的始末两个时期,基于此特殊性,在大生产中最易出现质量不稳定,优质率下降的问题。本文针对这一现象,对两个时期发酵产酸情况进行对比分析,研究证实了发酵过程SCFAs的变化的差异性,与以往认知不同的是,无论在发酵过程还是原酒中,乙酸的差异倍数并不显著,需要关注的是除乙酸外的其他SCFAs的差异造成的影响,同时应关注这些SCFAs相应的合成微生物及参与的代谢途径,以实现精准调控微生物发酵及酒体质量稳定。现已对浓香型白酒酿造体系来源的SCFAs合成微生物种类、代谢途径及其与其品质的关系的研究[16-19]。
结合两时期的发酵情况来分析,挑醅期发酵环境最易产酸,发酵起始产酸菌已高度富集,酸度随发酵持续上升,致使酵母菌增长受限,还原糖利用率下降,酒醅酸败使发酵不完全,进一步影响出酒率,而蒸馏截酒在保证酒精度的前提下,酒尾中的SCFAs乙酸、乳酸等只有少量接出；立醅期发酵产酸全周期最低,菌群中产酸菌比例下降,酸度上升速度较缓慢,使酵母菌对还原糖利用率相对较高,发酵较完全,根据经验科学在实际蒸馏截酒时较挑醅期可适当拉长酒尾,将乙酸、乳酸等接入原酒,因此,两时期的发酵材料酸指标相差很大,酒体SCFAs差异倍数缩小,通过调整工艺范围参数可保证了两个时期酒体风格一致[20]。
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