茶酒是一类含有茶叶成分的酒精饮料,按照加工工艺的不同,分为配制型、汽酒型以及发酵型茶酒[1]。其中,发酵型茶酒的基本工艺是以茶叶或茶叶提取物和可发酵性糖为原料,进行液态发酵,成品中含有丰富的氨基酸、维生素及茶多酚、咖啡碱等多种营养成分[2-3],但多数产品存在滋味不协调等现象[4-5],亟需改进生产工艺。我国传统米酒是利用固态法发酵而成的酸甜可口、酒香醇厚的饮品,风味特征是水果香和花香,并伴有醇香和青草香[6-7],因此可将其作为改善发酵型茶酒品质的酒基。
通过对比我国六大茶类与米酒香气特征的相似程度,发现乌龙茶与米酒的香气特征相似度最高[8-10]。故前期试验分别以乌龙茶茶叶和茶汤为原料,采用米酒的酿造工艺发酵了一批米香型乌龙茶酒,发现茶酒中的苦涩味是影响其品质的主要原因。林艺端[11]将茶叶制作成速溶茶后能降低其多酚类物质的含量,苦涩味明显减弱而风味特征不会改变。因此,本试验以速溶乌龙茶粉和糯米为主要原料,采用单因素试验和响应面试验优化米香型乌龙茶酒的生产工艺,以期获得感官特性优良的米香型乌龙茶酒。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
糯米,黑龙江北纯农产品开发有限公司；乌龙茶,云南省腾冲古韵茶业有限公司；酿酒酵母与甜酒曲,安琪酵母股份有限公司；标准品：儿茶素(catechin,C)、表儿茶素(epicatechin,EC)、表没食子儿茶素(epigallocatechin,EGC)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin 3-O-gallate,ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin 3-O-gallate,EGCG)、没食子儿茶素(gallocatechin,GC)、没食子儿茶素没食子酸酯(gallocatechin gallate,GCG)、鞣花酸(ellagic acid,EA)、没食子酸(gallic acid,GA)、杨梅素(myricetin,MY)、槲皮素(quercetin,QU)、山奈酚(kaempferol,KF),成都曼思特生物科技有限公司；无水乙醇(食品级),天津市风船化学试剂科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
CP214型电子天平,北京赛多利斯天平有限公司；HB10型旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂；DHG-9140型喷雾干燥机,上海豫明仪器有限公司；SHB-III型循环水式真空泵,巩义市予华仪器有限责任公司；HH-S28S型数显恒温水浴锅,金坛市大地自动化仪器厂；LRHS-250-II型生化培养箱,上海跃进器械有限公司；SW-CJ-1FD型超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司；1200型高速液相色谱系统,美国安捷伦公司。
1.3 试验方法
1.3.1 米香型乌龙茶酒生产工艺流程
糯米→分选除杂→清洗→浸泡→沥干→蒸饭→冲凉→加入速溶乌龙茶粉、甜酒曲、酿酒酵母→发酵→过滤→巴氏灭菌→成品
操作要点：将乌龙茶中的杂质及梗等异形物去除,粉碎后过40目筛,随后按料液比1∶15(g∶mL)加入60%乙醇浸泡36 h后,收集经过滤得到的滤液；重复提取1次,合并2次滤液后40 ℃减压浓缩,浓缩液于160 ℃喷雾干燥,得到速溶乌龙茶粉,待用；将挑选好的优质糯米用纯净水淘洗干净浸泡8 h,放入蒸锅中蒸煮40 min至松软无白心；取出糯米放入干净摊凉容器中加入等质量的纯净水,轻微搅拌至米粒分散均匀后按后续试验方案加入一定量的速溶乌龙茶粉、酿酒酵母及2.0%甜酒曲,随后装入无菌密封罐内并将其中央搭成“倒喇叭状”的凹圆窝；在26～34 ℃发酵72～120 h,4层纱布过滤,收集滤液,巴氏灭菌(65 ℃、30 min)后得到成品。
1.3.2 米香型乌龙茶酒生产工艺单因素优化试验
在速溶乌龙茶粉添加量、酿酒酵母接种量、酿酒酵母接种时间、发酵温度及发酵时间分别为1.5%、0.06%、24 h、30 ℃、96 h的基本条件下,保持其他因素不变,只改变其中一个因素,分别考察速溶茶粉添加量(0.0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)、酿酒酵母接种量(0.00%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1%)、酿酒酵母接种时间(0、12、24、36、48 h)、发酵温度(26、28、30、32、34 ℃)及发酵时间(72、84、96、108、120 h)对米香型乌龙茶酒感官评分及酒精度的影响,每组试验重复3次。
1.3.3 米香型乌龙茶酒生产工艺响应面优化试验
在单因素试验的基础上,以速溶茶粉添加量(A)、酿酒酵母接种量(B)、酿酒酵母接种时间(C)、发酵温度(D)和发酵时间(E),进行响应面试验,因素水平如表1所示。
表1 响应面试验因素水平
Table 1 Factors and levels of response surface analysis
水平因素(A)速溶茶粉添加量/%(B)酿酒酵母接种量/%(C)酿酒酵母接种时间/h(D)发酵温度/℃(E)发酵时间/h-11.00.060308401.50.0812329612.00.102434108
1.3.4 米香型乌龙茶酒感官评分方法
由11名(5男6女)专业人员组成的感官评定小组,参照NY/T 1885—2017《绿色食品 米酒》对米香型乌龙茶酒从外观、香气、滋味、典型性等4个方面进行感官评分,评分标准见表2。
表2 米香型乌龙茶酒的感官评分标准
Table 2 Sensory score standards of rice-flavor oolong tea wine
指标感官评分(分)感官评分标准外观7～10亮黄色、无明显悬浮物、有光泽4～7黄色、较澄清、无夹杂物0～4淡黄色、浑浊、失光香气20～30酒香与乌龙茶香协调、浓郁10～20酒香与乌龙茶香较协调,但不浓郁0～10香气不协调、有异香滋味30～40茶酒滋味协调纯正、细腻,酒体香醇浓郁20～30酒体较丰满、较柔和,兼具米酒与乌龙茶的风味,无异味0～20口味不纯正,有一定的苦涩味典型性14～20具有茶酒的独特风格,品质优雅8～14有典型性,不够怡雅0～8酒体尚协调,有缺陷
1.3.5 米香型乌龙茶酒多酚类物质测定方法
按照实验室前期建立的方法,应用高效液相色谱法检测米香型乌龙茶酒中多酚类物质,并根据峰面积使用外标法进行定量分析[12]。
1.4 数据分析
以上每个试验重复3次,结果取平均值。采用OriginPro 12.1软件进行数据制图,应用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析,利用Design Expert 10.1软件进行响应面设计及结果分析。
2 结果与分析
2.1 米香型乌龙茶酒单因素试验
2.1.1 速溶茶粉添加量对米香型乌龙茶酒品质的影响
由图1可知,随着速溶茶粉添加量的增加,米香型乌龙茶酒的感官评分呈现先升后降的趋势。当速溶茶粉添加量为1.5%时,米香型乌龙茶酒的感官评分达到最高(76.0±0.7)分；随着速溶茶粉添加量继续增加,米香型乌龙茶酒的感官评分显著下降(P<0.05)。当速溶茶粉添加量较低(<1.5%)时,米香型乌龙茶酒的花果香及茶香较为寡淡,故造成米香型乌龙茶酒的感官评分不高；当速溶茶粉添加量较高时(>1.5%),米香型乌龙茶酒出现了一定的苦涩味。因此,适量的速溶茶粉能赋予米香型乌龙茶酒怡人的花果香[10],而过量的速溶茶粉则会将其多酚类物质的苦涩味在米香型乌龙茶酒中突显出来[11]。又因速溶茶粉中的多酚类物质对酿酒酵母的生长代谢具有一定的抑制作用[13],故米香型乌龙茶酒的酒精度随着速溶茶粉添加量的增加而显著下降(P<0.05)。对比速溶茶粉添加量从0增加到1.5%时,感官评分增加45.6%与酒精度降低7.5%,故采用速溶茶粉添加量为1.5%用于后续试验。
图1 不同速溶茶粉添加量对米香型乌龙茶酒品质的影响
Fig.1 Effect of instant tea powder concentration on the quality of rice-flavor oolong tea wine
注：不同字母表示具有差异显著性(P<0.05)(下同)
2.1.2 酿酒酵母接种量对米香型乌龙茶酒品质的影响
米香型乌龙茶酒的感官评分与酒精度随着酿酒酵母接种量的增加而增加(图2),特别是当酿酒酵母接种量从0增加到0.08%时,感官评分与酒精度随之显著增加(P<0.05)。当酿酒酵母接种量为0.08%时,米香型乌龙茶酒的感官评分为(85.0±0.8)分,酒精度为(9.8±0.1)%；当酿酒酵母接种量继续增加至0.10%时,米香型乌龙茶酒的感官评分与酒精度虽有增加,但较酿酒酵母接种量0.08%时增加不显著(P>0.05)。故选择酿酒酵母接种量为0.08%用于后续试验。
图2 酿酒酵母接种量对米香型乌龙茶酒品质的影响
Fig.2 Effect of different inoculation of S.cerevisiae inoculum on the quality of rice-flavor oolong tea wine
2.1.3 酿酒酵母接种时间对米香型乌龙茶酒品质的影响
米香型乌龙茶酒的感官评分及酒精度随着酿酒酵母接种时间的延长呈现出先增加后降低的趋势(图3)。酿酒酵母接种时间为发酵后12 h最佳,此时米香型乌龙茶酒的感官评分与酒精度分别达到了最高为(88.0±1.1)分与(10.5±0.1)%。若酿酒酵母接种时间较早(<12 h),甜酒曲中的根霉等微生物还未产生出能够满足酿酒酵母生长代谢的可发酵性糖,便会使酿酒酵母的生长繁殖受到抑制；当酿酒酵母接种时间超过12 h,会因为甜酒曲中的微生物大量繁殖抑制酿酒酵母的生长代谢[14],造成米香型乌龙茶酒的感官评分与酒精度偏低。故选择酿酒酵母接种时间为12 h用于后续试验。
图3 酿酒酵母接种时间对米香型乌龙茶酒品质的影响
Fig.3 Effect of inoculation time of S.cerevisiae on the quality of rice-flavor oolong tea wine
2.1.4 发酵温度对米香型乌龙茶酒品质的影响
由图4可知,米香型乌龙茶酒的感官评分及酒精度随着发酵温度上升呈现出先增加后降低的趋势。当发酵温度从26 ℃升高到32 ℃时,米香型乌龙茶酒香气不够怡人、酒体不够醇厚等不良感官特性逐渐消失,最后呈现出酒香与乌龙茶香协调、酒体香醇浓郁的感官特性,其感官评分和酒精度均达到了最高值,分别为(90.7±1.2)分、(10.9±0.1)%。当发酵温度高于32 ℃时,会抑制微生物体内的酶系,造成米香型乌龙茶酒的酒精度降低,并使其具有一定的苦涩味,进而影响感官品质[15]。因此,选择发酵温度为32 ℃用于后续试验。
图4 不同发酵温度对米香型乌龙茶酒品质的影响
Fig.4 Effect of fermentation temperature on the quality of rice-flavor Oolong tea wine
2.1.5 发酵时间对米香型乌龙茶酒品质的影响
米香型乌龙茶酒的感官评分及酒精度随着发酵时间的延长也呈现出先增加后降低的趋势(图5)。当发酵时间从72增加到96 h时,感官评分增加至最高(90.7±1.2)分,酒精度增加至最高的(10.9±0.1)%。其原因在于随着发酵时间的延长,酿酒酵母会产生更多的酒精与香气物质,促使米香型乌龙茶酒酒体更加丰满、香气更加浓郁[16]。随着发酵时间继续延长,米香型乌龙茶中的微生物会将一部分酒精代谢生成乙酸等物质,造成米香型乌龙茶酒酒精度下降、感官品质降低[17]。故选择发酵时间为96 h用于后续试验。
图5 发酵时间对米香型乌龙茶酒品质的影响
Fig.5 Effect of fermentation time on the quality of rice-flavor Oolong tea wine
2.2 米香型乌龙茶酒响应面法试验
在单因素试验的基础上,通过Box-Behnken中心组合设计[18]速溶茶粉添加量(A)、酿酒酵母接种量(B)、酿酒酵母接种时间(C)、发酵温度(D)和发酵时间(E)5个因素并以感官评分与酒精度为响应值进行响应面试验,结果见表3。
表3 响应面试验设计及结果
Table 3 Experimental design and results for response surface analysis
序号A:速溶茶粉添加量/%B:酿酒酵母接种量/%C:酿酒酵母接种时间/hD:发酵温度/℃E:发酵时间/h感官评分/分酒精度/%vol1-1(1)-1(0.06)0(12)0(32)0(96)62.9 8.3 21(2)-100073.2 9.2 3-11(0.10)00076.9 9.7 41100082.0 10.3 50(1.5)0(0.08)-1(0)-1(30)073.0 9.2 6001(24)-1080.1 10.1 700-11(34)083.3 10.5 80011092.7 11.6 90-100-1(84)73.0 9.2 100100-181.6 10.2 110-1001(108)85.4 10.7 120100194.6 11.9
续表3
序号A:速溶茶粉添加量/%B:酿酒酵母接种量/%C:酿酒酵母接种时间/hD:发酵温度/℃E:发酵时间/h感官评分/分酒精度/%vol13-10-10065.7 8.2 1410-10069.4 8.7 15-1010070.0 8.8 161010082.6 10.4 17000-1-174.1 9.3 180001-182.5 10.4 19000-1186.1 10.8 200001193.2 11.4 210-1-10069.4 8.7 2201-10086.9 10.9 230-110081.1 10.2 240110089.1 11.2 25-100-1061.9 8.1 26100-1074.1 9.3 27-1001079.0 9.9 281001079.4 10.0 2900-10-172.6 9.1 300010-179.7 10.0 3100-10184.2 10.6 320010193.8 11.2 33-1000-162.9 8.4 341000-172.6 9.1 35-1000179.0 9.9 361000184.6 10.6 370-10-1072.0 9.1 38010-1087.6 11.0 390-101083.3 10.5 400101090.2 11.3 410000091.2 11.6 420000091.7 11.5 430000091.0 11.4 440000093.4 11.4 450000092.3 11.6 460000092.9 11.2
对米香型乌龙茶酒感官评分(Y1)及酒精度(Y2)响应面试验数据进行方差分析,结果如表4。分别以感官评分和酒精度为响应值,经回归拟合后,得到相应的回归方程：
Y1=90.27+3.73A+5.55B+4.03C+4.67D+6.37E-1.31AB+2.21AC-2.96AD-1.03AE-2.35BC-2.16BD+0.14BE+0.56CD+0.61CE-0.33DE-13.99A2-4.56B2-5.86C2-4.72D2-3.66E2
Y2=11.47+0.39A+0.67B+0.47C+0.55D+0.71E-0.063AB+0.28AC-0.29AD-0.30BC-0.27BD+0.017BE+0.073CD-0.073CE-0.12DE-1.62A2-0.50B2-0.75C2-0.50D2-0.46E2
由表4可知,5个试验因素对米香型乌龙茶酒感官评分及酒精度的影响次序为E>B>D>C>A,即发酵时间对米香型乌龙茶酒感官评分与酒精度的影响最为显著,其次是酿酒酵母接种量,再次是发酵温度,随后是酿酒酵母接种时间,最后是速溶茶粉添加量。其中,一次项A、B、C、D、E,交互项AC、AD、BC、BD,二次项A2、B2、C2、D2、E2对米香型乌龙茶酒感官评分的影响极为显著(P<0.01),交互项AB对米香型乌龙茶酒感官评分的影响达到了显著水平(P<0.05)；一次项A、B、C、D、E,交互项AC、AD、BC、BD,二次项A2、B2、C2、D2、E2对米香型乌龙茶酒酒精度的影响达到了极显著水平(P<0.01)。
表4 响应面结果方差分析
Table 4 Variance analysis of response surface results
方差来源平方和自由度均方F值P值显著性Y1Y2Y1Y2Y1Y2Y1Y2Y1Y2Y1Y2模型3 834.0951.11 2020191.702.56 127.8470.79 <0.000 1<0.000 1∗∗∗∗A222.232.47 11222.232.47 148.1968.50 <0.000 1<0.000 1∗∗∗∗B492.297.18 11492.297.18 328.27198.97 <0.000 1<0.000 1∗∗∗∗C260.263.51 11260.263.51 173.5597.13 <0.000 1<0.000 1∗∗∗∗D348.204.77 11348.204.77 232.19132.26 <0.000 1<0.000 1∗∗∗∗E648.598.04 11648.598.04 432.51222.65 <0.000 1<0.000 1∗∗∗∗AB6.890.02 116.890.02 4.590.43 0.042 00.516 6∗AC19.450.31 1119.450.31 12.978.53 0.001 40.007 3∗∗∗∗AD34.930.35 1134.930.35 23.299.64 <0.000 10.004 7∗∗∗∗AE4.240.00 114.240.00 2.830.00 0.105 00.979 2BC22.000.35 1122.000.35 14.679.64 0.000 80.004 7∗∗∗∗BD18.580.29 1118.580.29 12.398.08 0.001 70.008 8∗∗∗∗BE0.080.00 110.080.00 0.050.03 0.821 00.855 3CD1.270.02 111.270.02 0.840.58 0.367 00.452 5CE1.490.02 111.490.02 0.990.58 0.328 70.452 5DE0.430.06 110.430.06 0.291.66 0.597 50.209 0A21 708.3622.80 111 708.3622.80 1 139.20631.72 <0.000 1<0.000 1∗∗∗∗B2181.692.20 11181.692.20 121.1661.00 <0.000 1<0.000 1∗∗∗∗C2299.974.88 11299.974.88 200.03135.31 <0.000 1<0.000 1∗∗∗∗D2158.892.19 11158.892.19 105.9560.59 <0.000 1<0.000 1∗∗∗∗E2116.651.83 11116.651.83 77.7950.56 <0.000 1<0.000 1∗∗∗∗残差37.490.90 25251.500.04失拟项33.060.79 20201.650.04 1.871.74 0.253 00.282 0纯误差4.430.11 550.890.02总离差3 871.5852.01 4545
注：“*”表示在P<0.05水平上差异显著,“**”表示在P<0.01水平上差异极显著
通过响应面软件分析,米香型乌龙茶在速溶茶粉添加量1.53%、酿酒酵母接种量0.09%、酿酒酵母接种时间16.02 h、发酵温度32.81 ℃、发酵时间106.56 h的条件下,感官评分可获得最高的理论值97.80分；在速溶茶粉添加量1.55%、酿酒酵母接种量0.09%、酿酒酵母接种时间14.47 h、发酵温度32.59 ℃、发酵时间104.75 h的条件下,酒精度可获得最高的理论值12.05%。为了试验的可操作性将软件得出的最优理论条件进行适当调整,后续在速溶茶粉添加量1.5%、酿酒酵母接种量0.09%、酿酒酵母接种时间16.0 h、发酵温度32.8 ℃、发酵时间106.6 h以及速溶茶粉添加量1.6%、酿酒酵母接种量0.09%、酿酒酵母接种时间14.5 h、发酵温度32.6 ℃、发酵时间104.8 h的条件下分别进行3组平行试验,其感官评分分别为(97.1±0.9)与(95.4±1.1)分,酒精度分别为(11.9±0.2)%与(11.9±0.1)%。故米香型乌龙茶酒的最优工艺条件为：速溶茶粉添加量1.5%、酿酒酵母接种量0.09%、酿酒酵母接种时间16.0 h、发酵温度32.8 ℃、发酵时间106.6 h。
2.3 米香型乌龙茶酒多酚类物质分析
测定米香型乌龙茶酒在经响应面优化后的工艺条件下多酚类物质的含量如图6所示。在米香型乌龙茶酒中检测出10种多酚类物质,分别为GA、GC、EGC、C、EGCG、EC、GCG、ECG、EA和MY,总含量为(1.9±0.2)mg/mL。其中,EGC、GC、EGCG的含量较高,分别为(0.8±0.1)、(0.4±0.1)和(0.3±0.0)mg/mL。据报道,EGC可以预防食管癌和直肠癌[19]；GC具有抗氧化、抗炎,保护心血管等功效[20]；EGCG拥有抗动脉粥样硬化、抗心肌梗死、抗糖尿病、抗炎、抗氧化和保护神经的特性[21]；MY可改善由免疫应答引起的炎症反应[22]。由此可见,该米香型乌龙茶酒具有一定的保健功能,其生物活性值得今后进一步研究。
图6 米香型乌龙茶酒多酚类物质含量
Fig.6 The content of polyphenols in rice-flavor oolong tea wine
3 结论
经过响应面试验得到米香型乌龙茶酒的最优工艺条件为：在经蒸煮后的糯米中添加1.5%速溶乌龙茶粉与2%的甜酒曲,32.8 ℃发酵16.0 h后接种0.09%的酿酒酵母,继续发酵90.6 h后固液分离,65 ℃巴氏灭菌30 min后可获得亮黄透明、酒香与茶香和谐、滋味爽口,感官评分为(97.1±0.9)分、酒精度(11.9±0.2)%vol和多酚类物质含量(1.9±0.2)mg/mL的米香型乌龙茶酒。试验结果为改善发酵型茶酒品质特征提供了新思路。
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