含量显著增高(P<0.05),引起了细胞抗氧化超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶系统平衡的破坏,加剧了脂质过氧化和蛋白羰基化程度,MDA含量增加,最终抑制了菌体的生长。摘 要 粉红单端孢(Trichothecium roseum)是多种植物及采后果蔬重要的病原菌,该文探讨了短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)HN-10抗菌肽P-1对粉红单端孢细胞膜结构以及活性氧(reactive oxygen species,ROS)代谢的影响。通过平板培养(牛津杯法)和液体培养体系考察了B.pumilus HN-10抗菌肽P-1对粉红单端孢菌体生长的抑制作用；采用碘化丙啶染色和透射电镜技术,动态观察了抗菌肽P-1对液态培养12 h的内粉红单端孢细胞壁、膜结构的影响；通过液态培养试验体系,分析了抗菌肽P-1对膜通透性的影响,并基于膜脂过氧化反应研究了抗菌肽P-1对粉红单端孢ROS及其代谢产物丙二醛(malondialdehyde,MDA)的影响。结果表明,固态、液态培养的粉红单端孢菌体生长受到明显抑制,随着抗菌肽P-1处理时间的延长,粉红单端孢孢子数逐渐增多,抗菌肽P-1对粉红单端孢孢子壁、膜造成了局部损伤,并出现缺口,导致细胞质大量流出,孢子变形。抗菌肽P-1处理使得菌体麦角甾醇的含量减少,第7天时,比对照组低35%。同时,抗菌肽P-1处理显著增大了N-苯基-1-萘胺的摄取率、相对电导率,第7天时,分别比对照组高24%、35%。此外,抗菌肽P-1处理使胞内含量显著增高(P<0.05),引起了细胞抗氧化超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶系统平衡的破坏,加剧了脂质过氧化和蛋白羰基化程度,MDA含量增加,最终抑制了菌体的生长。
粉红单端孢(Trichothecium roseum)是引起果蔬采后病害的重要病原物[1],它不仅能够侵染果蔬产品,造成严重的经济损失,而且产生的次级代谢产物单端孢霉烯毒素具有生物毒性[2]。目前,控制由T.roseum引起的果蔬采后病害主要依赖于化学合成的杀真菌剂[3],但是化学合成杀菌剂的长期使用,易引起药物残留,污染环境并影响人类健康,甚至增加病原体的抗药性[4]。因此,选择替代或减少化学合成杀菌剂,研究相应的抑菌物质具有重大意义[5]。
抗菌肽又名抗微生物肽[6],是一类小分子的多肽类物质,具有抗真菌的生物学特性且不易产生耐药性,有望成为化学药物替代品,应用潜力和价值巨大[7]。实验室前期从腐败的湿粉条中分离得到了1株对粉红单端孢具有拮抗作用的芽孢杆菌,经鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) HN-10,利用B.pumilus HN-10发酵液开展了拮抗实验研究[8]；严海娇等[9-10]通过硫酸铵沉淀、AB-8大孔吸附树脂、Sephadex G-100凝胶和半制备型反相高效液相色谱法对B.pumilus HN-10发酵液进行逐级分离纯化,获得了抗真菌肽P-1,并证实了B.pumilus HN-10抗菌肽P-1仅对粉红单端孢具有抑菌作用;明确了其氨基酸序列和分子质量,分别是GGSGGGSSGGSIGGR和1 149.14 Da；郭娟等[11]采用转录组学和蛋白组学初步分析了抗菌肽P-1对粉红单端孢胞内核酸,以及蛋白质的影响,但尚未明确其抑菌机理。
本试验以粉红单端孢为供试菌,基于平板培养和液态培养体系,采用碘化丙啶(propidiumiodide,PI)染色和透射电镜技术观察、结合系列生理生化指标测定,从细胞壁、膜结构变化、膜通透性以及膜脂过氧化等方面,探讨B.pumilus HN-10抗菌肽P-1处理对粉红单端孢细胞膜结构和活性氧(reactive oxygen species,ROS)代谢的影响,以期阐明抗菌肽P-1的抑制作用机理,为红粉病害控制及新型生防治剂的开发应用提供理论依据和支持。
试验材料：抗菌肽P-1,分离纯化于短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) HN-10。
试验菌株：粉红单端孢(Trichothecium roseum)CICC 2703,中国工业微生物菌种保藏中心。
1.2.1 B.pumilus HN-10抗菌肽P-1的粗提和分离纯化
参照严海娇等[9]的方法测定。
1.2.2 T.roseum孢子悬浮液制备
参照刘志恬等[12]的方法制备。
1.2.3 抗菌肽P-1抑菌效果的测定
采用牛津杯法进行抑菌实验。在PDA平板中央滴1滴(约2 μL),1×108 个/mL的T.roseum孢子悬浮液,然后在孢子悬浮液等距2 cm处放置4个牛津杯,吸取抗菌肽P-1 1 μL滴加于牛津杯中,等量无菌蒸馏水做为空白对照,置于28 ℃培养箱中培养7 d,采用十字交叉法测定抑菌直径。实验设3个重复。
1.2.4 抗菌肽P-1对T.roseum孢子细胞膜完整性和超微结构的影响
细胞膜完整性采用PI染色检测,具体参照WANG等[13]的方法测定,其超微结构变化参照HELAL等[14]的方法进行测定。
1.2.5 抗菌肽P-1对T.roseum菌体生长曲线的测定
在150 mL PDA 液体培养基中接种120 μL密度为1×108个/mL的孢子悬浮液和1 μg/mL的抗菌肽P-1,28 ℃,200 r/min 培养0、1、3、5、7 d,10 000 r/min离心20 min分别收集菌丝,80 ℃ 烘干至恒重,称量质量。每组重复3次。
1.2.6 抗菌肽P-1对T.roseum菌体细胞膜上麦角甾醇含量的影响
参考LIU等[15]的方法进行测定。
1.2.7 抗菌肽P-1对T.roseum 细胞膜通透性的影响
细胞外膜通透性参照付永岩等[16]的方法进行测定；电导率参照王雪燕等[17]的方法；脂质过氧化参照PUSHPANATHAN等[18]的方法；蛋白羰基化参照段丽菊等[19]的方法；丙二醛(malondialdehyole,MDA)含量参照王霆等[20]的方法。
1.2.8 抗菌肽P-1对T.roseum 菌体活性氧代谢的影响
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、H2O2按照上海优选生物科技有限公司试剂盒的方法进行测定；过氧化物酶(peroxidase,POD)参照王新绘等[21]的方法。
全部数据用Excel 2010计算平均值和标准偏差,使用Origin 9.0软件作图。用SPSS 19.0进行差异显著性分析及相关性分析(P<0.05)。
由表1可知,B.pumilus HN-10抗菌肽P-1经过硫酸铵沉淀、AB-8大孔吸附树脂、Sephadex G-100凝胶进行了分级纯化,最终得到了抗菌肽P-1。结果显示,经过逐级纯化的抗菌肽P-1对粉红单端孢具有明显的抑菌作用。
表1 不同纯化方式对粉红单端孢的抑菌活性
Table 1 Antifungal activity of different purification methods against T.roseum
抗菌肽P-1的纯化抑菌直径/mm硫酸铵沉淀9.73±0.10AB-8大孔吸附树脂10.45±0.10Sephadex G-100凝胶11.40±0.10
抗菌肽P-1对T.roseum的抑菌作用如图1,抗菌肽P-1对粉红单端孢菌体生长具有明显抑制作用,抑菌圈直径达到(12.1±0.10) mm。
1-加入抗菌肽P-1；CK-对照
图1 抗菌肽P-1对T.roseum的抑制效果
Fig.1 Inhibitory effect of antifungal peptide P-1 on T.roseum
PI为非膜渗透性荧光染料,可以染色细胞核,质膜完整的细胞中,PI无法正常进入细胞,因而可以利用这一性质观察细胞核是否被染色,若能观察到荧光则证明质膜不完整。在荧光显微镜下观察,正常的细胞不能被染上红色,只有细胞膜被破坏的细胞才能发出红色荧光,并且早期凋亡的细胞红光比较微弱,晚期凋亡的细胞红光变强[22]。由图2可知,处理组中随着抗菌肽P-1时间的延长,被PI染色的孢子数逐渐增多(图2-d～图2-f),处理组可观察到明显荧光,而对照组(图2-a～图2-c)几乎无荧光。由此说明抗菌肽P-1破坏了T.roseum孢子的细胞膜完整性。
a-对照4 h；b-对照8 h；c-对照-12 h；d-处理4 h；e-处理8 h；f-处理12 h
图2 抗菌肽P-1对T.roseum孢子质膜完整性的影响
Fig.2 Effect of antifungal peptide P-1 on plasma membrane integrity of T.roseum spores
为了进一步验证抗菌肽P-1对T.roseum孢子的破坏作用,通过透射电镜观察正常菌体及被抗菌肽P-1处理的菌体细胞形态、细胞壁、膜及细胞器的变化情况,从细胞水平分析抗菌肽P-1对菌体的影响[23]。对照组孢子结构完整且紧密,壁、膜平滑完整,胞内横隔膜完整且细胞器分布均匀(图3-a)。抗菌肽P-1处理4 h后,有些菌体壁、膜边缘变得粗糙不平,甚至出现局部的破损缺口(图3-b)。处理8 h时,菌体内横隔膜内陷断裂细胞壁薄厚不均甚至残缺,细胞质外渗出现电子密度高的阴影,细胞器分布紊乱(图3-c)。延长处理时间至12 h时,观察到细胞器不规则且模糊,细胞质内含物大多消失,细胞质大量外渗,孢子变形(图3-d)。由此可知,抗菌肽P-1处理破坏了T.roseum菌体的超微结构,且处理时间越长,破坏越严重。
Cw-细胞壁;Cm-细胞膜;Cy-细胞质
a-对照0 h(×18 000)；b-处理4 h(×25 000)；
c-处理8 h(×21 000)；d-处理12 h(×21 000)
图3 抗菌肽P-1对T.roseum孢子超微结构的影响
Fig.3 Effect of antifungal peptide P-1 on ultrastructure of T.roseum spores
注：a-×18 000；b-×25 000；c、d-×21 000
菌体生物量如图4-a,对照组的T.roseum生长良好,具有典型微生物的生长曲线特征,在第5天进入稳定期,第7天时达到最大生物量为0.171 g。而处理组生长曲线位于对照组下方,生长曲线呈现为平缓的下降趋势。结果说明抗菌肽P-1能够明显抑制T.roseum的生长繁殖。
麦角甾醇是真菌细胞膜的重要组分,主要以自由态的形式存在于磷脂双分子层中,在维持细胞膜流动性方面起着重要的作用[24]。麦角甾醇的缺失或降低,会导致真菌细胞膜结构破坏及功能的丧失[25]。因此,麦角甾醇含量的变化是衡量细胞膜受损的主要指标。由图4-b可知,随着时间的延长,麦角甾醇含量呈下降趋势,且在每个时段,处理组的麦角甾醇含量显著低于对照组(P<0.05),第7天时,相比对照组,减少了35%(P<0.05)。结果表明,抗菌肽P-1可以有效抑制T.roseum麦角甾醇的合成,引起细胞膜结构和功能受损,从而达到抑菌作用。
a-T.roseum菌体生物量；b-麦角甾醇含量
图4 抗菌肽P-1处理对T.roseum菌体生物量和麦角甾醇含量的影响
Fig.4 Effects of antifungal peptide P-1 treatment on T.roseum biomass and ergosterol content
注：竖线代表标准偏差(±SD),*代表组内差异显著(P<0.05)(下同)
2.6.1 荧光染料N-苯基-1-萘胺摄取率的测定结果
N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,NPN)是一种疏水荧光探针,在水环境中不会发出荧光,但在疏水环境中会发出强烈的荧光[26]。因此可以利用荧光染料NPN来评价抗菌肽P-1通过T.roseum细胞外膜的能力。图5反映了T.roseum胞内荧光NPN摄取率随培养时间的变化情况。结果显示,在整个培养过程中,随着时间的延长,NPN摄取率呈现增强趋势,且在每个时段,处理组的NPN摄取率显著高于对照组(P<0.05)。在第7天时,其高出对照组24%(P<0.05),说明抗菌肽P-1处理可造成T.roseum细胞外膜通透性增大,使NPN与膜上的磷脂分子中的疏水基结合,产生荧光。
图5 抗菌肽P-1处理对T.roseum菌体NPN荧光吸收强度的影响
Fig.5 Effect of antifungal peptide P-1 treatment on NPN fluorescence absorption intensity of T.roseum cells
2.6.2 电导率测定结果
电导率的变化可反映细胞膜渗透性的改变[27]。图6显示,随着培养时间的增加,处理组菌体细胞相对电导率明显高于对照组,在第7天,比对照组高35%(P<0.05),表明抗菌肽P-1处理使T.roseum细胞膜的渗透性发生改变,导致细胞内外渗透压的调节能力下降,使细胞失水或胀破,从而起到抑菌作用。
图6 抗菌肽P-1处理对T.roseum菌体相对电导率的影响
Fig.6 Effect of antifungal peptide P-1 treatment on relative conductivity of T.roseum cells
2.7.1 对菌体超氧阴离子自由基
的影响
ROS是细胞内一类具有较高化学反应活性的氧代谢产物,具有多种存在形式,主要以氧化过程形成的
存在。图7反映了含量随培养时间的变化情况。结果显示,随着培养时间的延长,其含量呈现上升趋势。且每个时段,处理组的含量显著高于对照组(P<0.05)。说明P-1处理诱导了胞内ROS的积累。
图7 P-1处理对T.roseum菌体
的影响
Fig.7 Effect of P-1 treatment on superoxide anion of T.roseum
2.7.2 对抗氧化酶系(SOD、CAT、POD)和H2O2含量的影响
图8反映了P-1处理对参与ROS反应的相关抗氧化酶系活力和H2O2含量的影响。随着培养时间的延长,SOD活性呈现下降趋势,第1、3天,处理组的SOD活性都显著低于对照组(P<0.05)(图8-a)；CAT活性呈先增大后减小的趋势,处理组的CAT活性显著高于对照(P<0.05)(图8-b)；POD整体呈现增大的趋势,且处理组的POD活性显著高于对照组(P<0.05)(图8-c)；H2O2含量呈现下降的趋势,且处理组的H2O2的含量显著低于对照组(P<0.05)(图8-d)。结果表明抗菌肽P-1处理加剧了T.roseum胞内的抗氧化程度。
a-SOD活力；b-CAT活力；c-POD活力；d-H2O2含量
图8 抗菌肽P-1处理对T.roseum 菌体SOD活力、CAT活力、POD活力及H2O2含量的影响
Fig.8 Effect of antifungal peptide P-1 on SOD,CAT,POD activity and the content of H2O2 in T.roseum
2.7.3 对脂质过氧化、蛋白羰基化的影响
脂质和蛋白是细胞膜的主要组成部分,由ROS大量积累引起的脂质和蛋白的氧化损伤,可直接影响T.roseum的正常生理活动。由图9可知,随着培养时间的延长,处理组的脂质过氧化值(OD535)高于对照组,第7天时,OD535高于对照组55%(P<0.05)(图9-a)；处理组蛋白羰基含量显著高于对照组。第7天时,羰基含量高于对照组71.96%(P<0.05)(图9-b)。上述结果表明抗菌肽P-1处理使T.roseum细胞膜氧化损伤引起的脂质过氧化和蛋白羰基化程度加深。
a-T.roseum菌体OD535；b-羰基含量
图9 抗菌肽P-1处理对T.roseum菌体OD535和羰基含量的影响
Fig.9 Effect of P-1 treatment on OD535 and carbonyl content of T.roseum
2.7.4 对MDA含量的影响
MDA是膜脂过氧化作用的主要产物之一,一般利用其含量作为膜脂过氧化的指标,反映细胞膜脂质过氧化的程度[28]。由图10可知,处理组MDA含量显著高于对照组,第7天时,MDA含量比对照组高67.6%(P<0.05)。表明抗菌肽P-1处理使菌体发生膜脂质过氧化反应,引起菌体MDA含量升高,最终导致细胞膜受损。
图10 抗菌肽P-1处理对T.roseum菌体MDA含量的影响
Fig.10 Effect of antifungal peptide P-1 treatment on MDA content of T.roseum
本试验从超微结构、细胞膜通透性及ROS代谢3个方面研究了抗菌肽P-1处理对T.roseum有抑菌作用。液体培养结果显示,抗菌肽P-1处理能够明显抑制T.roseum菌体生物量的增加,通过超微观察发现P-1破坏了T.roseum孢子的细胞壁膜、局部出现了缺口、细胞质大量流出,致使孢子的形态发生了剧烈的变化,胞质变得不均匀。这可能是抗菌肽P-1抑制T.roseum菌体生长的主要原因[29]。
细胞膜是主要由磷脂构成的富有弹性的半透性膜,麦角甾醇可以与磷脂结合形成稳定磷脂相,进而增加细胞膜的稳定性[30]。本研究结果显示,抗菌肽P-1处理使T.roseum细胞膜上麦角甾醇含量减少,可能是由于抗菌肽P-1抑制了麦角甾醇的生物合成途径,使膜的结构和完整性受到影响,使NPN这种对细胞外膜敏感性荧光染料透过了细胞外膜,与膜上的磷脂双分子层中的疏水基产生了结合；同时,抗菌肽P-1处理后T.roseum菌体细胞相对电导率的不断增大,进一步证明抗菌肽P-1处理破坏了细胞膜的结构,改变了膜的稳定性。
MDA是由高水平的ROS诱导的,过量的MDA通过与脂质、蛋白质交联而表现出膜损伤,最终导致细胞功能衰退或丧失[31]。本研究结果显示,抗菌肽P-1处理使T.roseum菌体脂质过氧化指标、蛋白羰基含量以及MDA含量增加。说明抗菌肽P-1使菌体发生了膜脂过氧化反应,并且产生了膜脂代谢产物MDA,导致机体内积累了ROS。该情况下机体会通过自身抗氧化酶系使其达到平衡,一旦平衡被破坏,可能导致菌体膜完整性的丧失。正常的细胞过程取决于ROS产生和清除之间的动态平衡,抗氧化酶可以减少ROS的积累。SOD可以将生成H2O2,CAT和POD降低H2O2含量,使其生成H2O。活性氧的过度产生或抗氧化酶的失效都会干扰这种平衡,导致氧化应激,这被描述为抗菌活性的重要机制[32]。
本研究通过测定抗菌肽P-1处理后T.roseum菌体胞内ROS的含量和抗氧化酶的活性,结果显示,抗菌肽P-1使T.roseum菌体SOD活性降低、CAT活性先增大后减小以及POD活性增大,胞内含量增加,H2O2含量降低。说明抗菌肽P-1处理使SOD的活性降低导致超氧自由基清除失败,同时,CAT和POD的活性被刺激降低了H2O2水平。尽管H2O2含量降低,但ROS的积累不受影响,因为是ROS的中心活性氧。因此,可以得出抗菌肽P-1处理使T.roseum菌体ROS过度产生以及抗氧化酶活性的不平衡变化,从而引起超氧自由基的积累,导致细胞膜完整性丧失,菌体生长受到抑制。
本研究从超微结构、膜通透性以及ROS代谢的研究中推测出抗菌肽P-1对粉红单端孢的抑菌机理可能是通过破坏T.roseum菌体膜的完整性,改变膜的通透性,以及诱导ROS在胞内的积累,引起氧化胁迫反应,从而导致细胞膜完整性丧失,菌体生长受到抑制。
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Abstract This study explored the effects of antifungal peptide P-1 from Bacillus pumilus HN-10 on cell membrane structure and reactive oxygen species (ROS) metabolism of T. roseum. The inhibitory effect of antifungal P-1 on the growth of T. roseum was investigated by plate cultivation (Oxford cup method) and liquid cultivation system, and the effect of antifungal P-l on the cell membrane structure of T. roseum in liquid cultivation within 12 h was dynamically observed by propidiumiodide and transmission electron microscope. The influence of antifungal P-1 on membrane permeability was analyzed by liquid cultivation system, and based on membrane lipid peroxidation, the effect of antifungal P-l on ROS and its metabolite malondialdehyde (MDA) was studied. The results showed that the growth of T. roseum spores was obviously inhibited by solid and liquid cultivation. With the extension of treatment time of antifungal peptide P-1, the number of T. roseum spores increased gradually. The treatment of antifungal peptide P-1 caused local damage to the spore wall and membrane structure of T. roseum, appeared some gaps and lead to massive outflow of cytoplasm and deformation of spores. The treatment of antifungal P-1 treatment reduced the ergosterol content of the mycelium, and it was 35% lower than the control group on 7th day. At the same time, the treatment of antifungal P-1 treatment significantly increased the uptake rate of N-phenyl-1-naphthylamine, relative conductivity. It was 24%, 35% higher than that of the control group on 7th day, respectively. In addition, intracellular was significantly increased by P-1 treatment (P<0.05), disrupted the balance of cellular antioxidant (SOD, CAT, POD) systems, aggravated lipid peroxidation and protein carbonylation, increased MDA content,and finally inhibited mycelium growth.