苹果梨是我国甘肃[1]、内蒙[2]和吉林地区[3]的特产水果，该果含糖丰富、质地酥脆，在国内外市场颇具盛誉[4]。由扩展青霉(Penicillium expansum，P.expansum)侵染引起的青霉病[5]和链格孢(Alternaria alternata，A.alternata)侵染引起的黑斑病[1,6]是苹果梨主要采后病害，给果实贮藏造成严重损失。P.expansum和A.alternata引起果实腐烂过程还常伴随展青霉毒素和交链孢霉毒素的积累，带来食品安全隐患[7]。因此，开发苹果梨采后病害控制策略将有利于产业健康发展。
杀菌剂可以控制P.expansum[8]和A.alternata[9]引起的采后病害，但存在药物残留、环境污染以及诱导病原菌产生抗药性等问题而受限。近些年越来越多研究表明，植物精油是替代杀菌剂控制采后病害的新型安全措施[10-12]。花椒为芸香科花椒属植物的成熟干燥果实，精油是其开发利用的重要方向[13]。研究发现花椒精油对引起马铃薯干腐病的硫色镰刀菌[14]和引起牧草和烟叶贮藏虫害的烟草甲[15]以及食品卫生指示菌大肠杆菌[16]具有较好抑制效果。但有关花椒精油控制苹果梨采后病害的研究鲜见报道。
本研究在筛选花椒精油体外控制引起苹果梨采后腐烂病菌A.alternata和P.expansum的基础上，进一步以精油控制效果更佳的P.expansum为研究对象，在单因素试验基础上，对精油浓度和熏蒸时间进行响应面优化，筛选精油体内控制苹果梨采后青霉病的最佳条件，并对使用后果实的感官和质地品质进行测定分析，以期为花椒精油的开发应用提供理论依据，也为苹果梨采后青霉病控制提供方法参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
试验材料：供试A.alternata和P.expansum分离自然发病果实，纯化后于实验室保存待用；花椒精油采用水蒸气蒸馏法提取备用[17]；苹果梨果实采自甘肃省条山农场，当天运抵实验室待用。
主要仪器：SW-CJ-2FD超净工作台，广州深华公司；BMJ-800C霉菌培养箱，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；YXQ-LS-50A高压蒸汽灭菌锅，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；TMS-PRO质构仪，美国FTC公司。
1.2 试验方法
1.2.1 病原物的筛选与体外抑菌率测定
采用滤纸片熏蒸法，配制一定浓度花椒精油溶液(吐温-80作为助溶剂)，稀释成可在培养皿内挥发之后含量达到50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μL/L的溶液[8]，助溶剂作为对照。将配置好的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar，PDA)分装到锥形瓶中进行灭菌，在超净工作台内将灭菌的PDA培养基用灭菌量筒量取25 mL分装到灭过菌的培养皿中。将直径6 cm灭菌的滤纸片置于培养皿盖上方中心固定，在滤纸片上滴加先前配制好的1 mL花椒精油溶液并使其均匀分布，在已经纯化且长势良好的带菌培养皿的同一直径范围内，用灭菌的打孔器打取生长一致的菌饼(直径为6.0 mm)，将菌饼置于培养基中心，盖上含有精油滤纸的玻璃皿盖，并立即用封口膜进行封口处理，置于28 ℃霉菌培养箱中正置培养72 h后用十字交叉法测量菌落直径[18]，每处理重复5次。通过公式(1)计算抑菌率，选取花椒精油对其抑制率高的病原菌进行下一步试验[19]。
抑菌率
(1)
1.2.2 对苹果梨病原菌生长抑制的工艺优化
1.2.2.1 单因素实验设计
参考韩艳丽等[10]的方法稍作修改。选择成熟度和大小一致，无病虫害，无机械损伤的苹果梨果实，用体积分数为70%的酒精对苹果梨果实进行表面消毒，先用灭菌后的铁钉在果实赤道部分等距离刺4个3 mm深的伤口，每个伤口内注入10 μL 1×106个/mL的孢子悬浮液，分别对花椒精油熏蒸时间(含量为10 μL/L的精油密闭熏蒸2、4、6和8 h)和(分别用10、20、30和40 μL/L的精油熏蒸2 h)进行单因素熏蒸处理后，打开密闭容器通风平衡24 h，最后放入(25±2) ℃、85%相对湿度(relative humidity，RH)条件下贮藏5 d，采用十字交差法测量果实的病斑直径，记录数据并分析，探讨熏蒸时间和不同含量的花椒精油对P.expansum的体内抑制效果，每次处理用果8个，重复3次。
1.2.2.2 响应面实验设计
在单因素实验结果的基础上，采用Central Composite Design设计[20]优化精油最佳处理方式。如表1所示，对熏蒸时间和精油含量两因素分别用A和B表示，每一自变量低、中、高实验水平分别以-1、0、1进行编码。
表1 响应面实验设计因素与水平
Table 1 Design factors and level of central composite
水平因素A(熏蒸时间)/hB(花椒精油含量)/(μL·L-1)-12504101615
1.2.3 花椒精油处理对苹果梨品质的影响
通过工艺优化得到花椒精油熏蒸苹果梨最佳时间和含量的组合，然后将成熟度和大小一致、无病虫害、无机械损伤的苹果梨果实在最佳的含量和时间条件下进行熏蒸，同时以助溶剂处理为对照，并将2组果实在(25±2) ℃、85%RH条件下贮藏，于处理当天(0 d)、1、7、14和21 d分别取果实测定感官和质地品质[21]，每次处理用果15个，重复3次。
1.2.3.1 感官分析评价
对苹果梨感官评定过程中，每次评定由每位评定成员单独进行评分记录，相互不接触交流，不同果实样品评定间隔期间用清水漱口。本试验感官评价中，每项满分为5分，选取色泽、味觉、质地、香气4项指标综合得到最后的总体得分[22]。单项指标的评判尺度及统计如下：
色泽：光鲜(5分)～暗灰(1分)；味觉：脆嫩(5分)～绵软(1分)；质地：汁液充分(5分)～干涩(1分)；香气：无花椒味，果实香气浓郁(5分)～花椒味浓，果实香气较淡(1分)。实验选取10位人员组成评定小组进行感官评价，评定结果去掉2个极值后取平均值为最终评价结果。
1.2.3.2 质地品质测定
先调试好质构仪，测定参数设定：测试速度为30 mm/min；下压形变量为10%；触发力为0.1 N[23]。在每个果实的阴面、阳面以及中间对称4个点的赤道部位分别切去一小块果实表皮，露出果肉(表面平整)，然后用质构仪进行测定。质构特性以硬度、黏着性、内聚性、弹性、胶黏性和咀嚼性等指标表示[24]。
1.3 数据统计分析
所有数据采用GraphPad Prism 5.0进行作图、方差分析以及显著性分析(P<0.05)，相关性分析采用SPSS 21.0软件进行分析。
2 结果与分析
2.1 花椒精油对P.expansum和A.alternaria体外抑菌效果
由图1可知，不同含量花椒精油对2种病原菌生长均有抑制作用，且抑制效果存在差异。精油对2种病原菌抑制率均随着含量增大而升高，当含量大于6.25 μL/L时，精油对2种病原菌抑制效果差异显著，对 P.expansum抑制率显著高于A.alternata，在含量为25 μL/L时，对P.expansum抑制率是对A.alternata抑制率的2.1倍。由此表明，花椒精油对2种病原均有抑制作用，其中对P.expansum抑制效果更明显。
图1 不同含量花椒精油对P.expansum和A.alternata的体外生长抑制率
Fig.1 Inhibitory ratio of essential oil of Zanthoxylum bungeanum on P.expansum and A.alternata in vitro
注：不同字母表示P<0.05水平的差异显著(下同)
2.2 控制苹果梨青霉病的花椒精油熏蒸时间和含量的单因素试验
2.2.1 熏蒸时间的单因素试验
根据2.1结果，以P.expansum为研究对象，进一步优化花椒精油控制果实采后青霉病的体内应用条件。图2看出，不同熏蒸时间均对P.expansum的体内生长存在抑制作用，但不同熏蒸时间之间存在差异，且损伤接种果实的病斑直径随熏蒸时间延长呈现先降低后增加趋势。当熏蒸时间为4 h，病斑直径达到最小值，为8.59 mm。因此，熏蒸时间优化取值确定为2、4和6 h。
图2 花椒精油熏蒸时间对病斑直径的影响
Fig.2 Effect of fumigation time of essential oil of Zanthoxylum bungeanum on lesion diameter
2.2.2 熏蒸浓度的单因素试验
花椒精油含量对损伤接种苹果梨青霉病控制效果不同，病斑直径随精油含量增加呈先减小后增加随后又略有减小趋势(图3)。当精油含量为10 μL/L时，病斑的直径最小，为11.19 mm，抑制效果最好。虽然精油含量在30 μL/L时，病斑直径又呈减小趋势，但处理的果实略有药害斑点发生。因此，含量应控制在30 μL/L以内为宜。故熏蒸果实精油含量的优化确定为5、10和15 μL/L。
图3 花椒精油含量对病斑直径的影响
Fig.3 Effect of fumigation concentration of essential oil of Zanthoxylum bungeanum on lesion diameter
2.3 控制苹果梨青霉病的花椒精油熏蒸条件优化
2.3.1 响应面实验结果与分析
以熏蒸时间(A)和花椒精油含量(B)为自变量，以损伤接种P.expansum的果实病斑直径为因变量(Y)，响应面-中心组合设计实验方案和结果见表2。采用软件Design-Expert 8.0.6 对实验结果进行二次多元回归拟合和方差分析，得到果实病斑直径对熏蒸时间及精油含量的回归方程为:
表2 Central composite实验设计及结果
Table 2 Central composite experimental design and results
实验号A(熏蒸时间)/hB(花椒精油含量)/(μL·L-1)Y(病斑直径)/mm11.1710.0011.6324.002.9312.6534.0010.0010.5344.0010.0010.7154.0017.0710.5066.8310.0010.3672.005.0012.2384.0010.0011.0894.0010.0010.98106.0015.0010.00116.005.0012.10124.0010.0010.70132.0015.0011.95
Y=10.08-0.48A-0.68B-0.45AB+0.17A2+0.46B2
由方差分析(表3)可知，二次多项式模型P=0.000 2<0.01，失拟项P=0.342 8>0.05，表明回归方程拟合度好，误差小，与实测值能够较好的拟合。复合相关系数R2=0.948 7，说明回归方程对病斑直径的预测值与实测值有较好的相关性；校正决定系数
表明91.20%的实验数据的变异性可用此回归模型来解释。故可用该回归方程对实验结果进行分析和预测。
表3 试验方差结果分析表
Table 3 Test variance results analysis table
差异源平方和自由度均方F值P值差异性模型7.9351.5925.88 0.000 2**A1.8811.8830.65 0.000 9**B3.6713.6759.95 0.000 1**AB0.8310.8313.52 0.007 9**A20.2010.203.23 0.115 2B21.4611.4623.900.001 8**残差0.4370.061失拟项0.2330.0761.500.342 8不显著纯差0.2040.050总和8.3612复相关系数 R2=0.948 7校正决定系数 R2Adj=0.912 0
注：表中**为达到极显著差异(P<0.01)
2.3.2 验证性实验
根据Central Composite实验设计得到抑制青霉病斑扩展的最佳参数为：熏蒸的时间为5.61 h，花椒精油的含量为14.24 μL/L，此条件下果实的病斑直径预测值为9.89 mm。为了验证模型的准确性，将处理条件修正为：熏蒸时间5.6 h，花椒精油含量14.2 μL/L，并进行3次验证性实验，实际测量出病斑直径为(10.04±0.23)mm，与理论值接近，说明模型的拟合程度较好，回归方程对处理条件进行分析和预测可靠，可以利用该条件对体内P.expansum的生长进行抑制，用于苹果梨的采后处理。
2.4 花椒精油处理对苹果梨贮藏品质的影响
2.4.1 花椒精油处理对苹果梨感官品质的影响
由图4可知，花椒精油处理苹果梨在贮藏期间果实色泽、味觉以及质地品质的影响整体趋势一致。在贮藏期间，随着贮藏时间延长，处理和对照之间果实色泽、味觉和质地品质均未出现显著差异；但贮藏前14 d的处理果实香气得分显著低于对照组，这是由于花椒精油本身的挥发性气味掩盖了果实香气所致，但在贮藏21 d时，处理与对照之间的香气评分(P=0.04<0.05)无显著差异。
A-色泽；B-味觉；C-质地；D-香气
图4 精油处理对苹果梨感官品质的影响
Fig.4 Effect of essential oil of Zanthoxylum bungeanum treatment on sensory evaluation of Pyrus bretchneideri cv. Pingguoli
2.4.2 果实质构指标间相关性分析
通过全质构分析，测定对照和处理在贮藏过程中的质构参数，并对质构参数用SPSS统计软件进行相关性分析，结果如表4所示，质构实验所得到的苹果梨的各项物性指标间相关性不同。以苹果梨的硬度指标作为参考，分析其他指标与其相关性，结果表明，脆度、弹性与硬度呈正相关，且达到显著水平；胶黏性、凝聚性、黏着性与硬度呈负相关，并且都达到显著水平。因此在本次测试中，脆度、弹性、胶黏性、凝聚性、黏着性指标能和硬度一起反映果实的质地变化情况。
表4 质构试验所得各项质地参数间的相关性(R)矩阵表
Table 4 Correlation (R) matrix table between texture parameters obtained from texture tests
指标相关硬度胶黏性脆度凝聚性弹性黏着性咀嚼性硬度 相关性1显著性胶黏性相关性-0.958*1显著性0.01脆度 相关性0.927*-0.987**1显著性0.0230.002凝聚性相关性-0.943*0.995**-0.996**1显著性0.01600弹性 相关性0.913*-0.947*0.978**-0.960**1显著性0.0310.0150.0040.009黏着性相关性-0.929*0.991**-0.994**0.999**-0.953*1显著性0.0230.0010.00100.012咀嚼性相关性0.729-0.6540.686-0.6450.807-0.6151显著性0.1620.2310.2010.240.0990.269
注：以上为对照和处理组贮藏时间苹果梨全体的评价结果表，相关系数R皆由两尾测验计算所得，*表示相关性显著(P<0.05)，**表示相关性极显著(P<0.01)
2.4.3 花椒精油处理对果实硬度、脆度和弹性的影响
如图5所示，随着贮藏时间延长，果实硬度、脆度与弹性均呈下降趋势；处理组与对照组之间的脆度、硬度与弹性在14 d之前均未出现显著差异(图5-A，图5-B)；在贮藏第21天时，处理组可显著抑制果实硬度与脆度的降低，处理组硬度和脆度分别比同期对照高25.5%和42.8%；然而，整个贮藏期间处理与对照之间的弹性值无显著差异。因此，精油处理抑制了贮藏后期果实硬度和脆度的下降。
A-硬度；B-脆度；C-弹性
图5 花椒精油处理对苹果梨果实硬度、脆度和弹性的影响
Fig.5 Effects of essential oil of Zanthoxylum bungeanum treatment on hardness, brittleness and springiness of Pyrus bretchneideri cv. Pingguoli
2.4.4 花椒精油处理对果实胶黏性、凝聚性和黏着性的影响
如图6所示，果实的胶黏性、凝聚性和黏着性随着贮藏时间的延长而呈现上升趋势；处理与对照之间的胶黏性在14 d之前均未出现显著性差异，在贮藏第21天时，处理可显著抑制果实胶黏性的升高，处理组比同期对照组低10.6%；黏着性在第14天时开始出现显著性差异，在第14、21天时处理组比同期对照组分别低48.2%和8%；而凝聚性在贮藏过程中并未出现显著性差异。因此，精油处理抑制了贮藏后期果实胶黏性和黏着性的升高。
A-胶黏性；B-凝聚性；C-黏着性
图6 花椒精油处理对苹果梨果实胶黏性、凝聚性和黏着性的影响
Fig.6 Effects of essential oil of Zanthoxylum bungeanum treatment on gumminess, cohesiveness and adhesiveness of Pyrus bretchneideri cv. Pingguoli fruit
3 讨论与结论
体外抑菌研究结果表明，花椒精油对P.expansum和A.alternata均有明显的体外抑制作用，且对P.expansum的抑制效果优于A.alternata，与花椒精油可抑制F.sulphureum体外生长的研究结果一致[14]。前人研究表明，柠檬烯、芳樟醇和α-蒎烯为花椒精油的主要成分[25-27]，且柠檬烯和芳樟醇均具有抑制禾谷镰刀菌和灰葡萄孢的体外生长能力[28]，α-蒎烯可抑制禾谷镰刀菌的体外生长[14]。因此，花椒精油对P.expansum和A.alternata的体外生长抑制可能与柠檬烯、芳樟醇和α-蒎烯等主要成分的抑菌作用有关。响应面优化试验得出含量14.2 μL/L的花椒精油、熏蒸5.6 h为体内控制苹果梨青霉病的最佳条件，与含量分数15 μL/L的肉桂精油熏蒸樱桃果实可显著延缓果实腐烂和品质下降的结果相似[7]。
花椒精油对贮藏过程中苹果梨果实的色泽、味觉和质地等品质无显著性影响，但花椒精油的刺激性气味显著影响了贮藏前期果实的香气，然而，随着花椒精油的挥发和果实香气的释放，贮藏后期精油未对果实香气品质造成显著影响，但如何降低花椒精油对果实香气品质的影响仍是今后应用的改进方向。果实质地是用来表示果实组织状态以及食用时口感的内在品质，也是果实商品性的重要评价指标[29]。与早酥梨质构多面性评价不同[24,30]，脆度、胶黏性、黏着性和硬度均可用于表示苹果梨质地品质的变化，且花椒精油可延缓贮藏后期苹果梨果实脆度和硬度下降，抑制后期果实胶黏性和黏着性的升高。因此花椒精油可用于苹果梨果实采后青霉病控制，研究结果可为苹果梨的采后贮藏保鲜提供新思路。
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