苯甲酸(benzoic acid)又叫安息香酸,常常在食品中作为防腐剂使用[1]。GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[2]中规定了其在各类食品中允许使用的限量要求,如在食品中超范围或超限量使用会对人体肝脏产生危害,甚至致癌。但在日常检验过程中发现，部分食品中天然存在苯甲酸,因此,内源性的苯甲酸为食品的日常监管检验产生一定的困扰。孙屏等[3]研究发现，新疆红枣中天然苯甲酸平均值为84 mg/kg；张青云等[4]报道了蜂蜜中含有不超过15 mg/kg的苯甲酸；SIEBER等[5]的研究发酵乳的苯甲酸含量能达到50 mg/kg。一般来说,内源性苯甲酸产生有以下3种途径[6-8]:马尿酸水解、苯丙氨酸代谢、苯甲醛氧化。国家标准中规定发酵乳中不允许使用苯甲酸[2],但在实际检测中,由于原料乳在乳酸菌的作用下,马尿酸脱甘氨酸产生苯甲酸[9],因而发酵乳中经常被检出苯甲酸天然残留。随着消费者越来越关心饮食安全,为降低发酵乳中内源性苯甲酸的含量,保障百姓尤其儿童身体健康[10],本论文通过研究不同浓度的全脂乳粉、发酵温度、时间、pH、乳酸菌种类对发酵乳中苯甲酸产生的影响,初步探究发酵乳中苯甲酸产生的规律,为乳品质量控制提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 实验材料
全脂乳粉,新西兰恒天然集团；白砂糖,广西上上糖业有限公司；嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌,普尔斯(天津)国际贸易有限公司；发酵乳,超市。
马尿酸标准品、苯甲酸标准品,中国计量科学研究院；甲醇(色谱纯),美国Hipure Chem 公司；乙酸锌(分析纯),天津市福晨化学试剂厂；亚铁氰化钾(分析纯)、氢氧化钠(分析纯)、硫酸(优级纯)、冰乙酸(分析纯),天津市风船化学试剂科技有限公司；乳酸(分析纯),北京纯奇商贸有限责任公司；碳酸氢钠(分析纯),天津市风船化学试剂科技有限公司。
1.1.2 仪器设备
Shimadzu LC-20AT高效液相色谱仪、CNW C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),日本Shimadzu公司；WTL-4K离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；KQ-800DE超声仪,昆山市超声仪器有限公司；PHS-3C型pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 发酵乳的制备
水预热(50 ℃)→复原乳[10%全脂乳粉，6%白砂糖，均为质量分数(下同)]→杀菌(85 ℃,20 min)→冷却降温(40 ℃)→接入发酵剂(0.04%嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌混合发酵剂)→搅拌(10 min)→ 保温发酵(42 ℃,5 h)→冷藏保存(4 ℃)[11]
1.2.2 样品前处理
称取 20 g 样品(精确至 0.01 g)于100 mL 容量瓶中,加入 25 mL 0.1 mol/L NaOH溶液,混合后置于超声波水浴或 70 ℃水浴中处理15 min。冷却后,用 0.5 mol/L H2SO4溶液调pH到8,分别加入 2 mL 92 g/L亚铁氰化钾溶液和183 g/L 乙酸锌溶液。剧烈振摇,静置 15 min,混合后冷却到室温,甲醇定容,静置 15 min,4 000 r/min 离心,上清液经 0.22 μm 滤膜过滤。收集滤液,用于高效液相色谱仪测定样品中马尿酸和苯甲酸含量[12]。
1.2.3 全脂乳粉添加量的确定
分别以6%、8%、10%、12%、14%的全脂乳粉添加量进行发酵乳制作。
1.2.4 发酵初始酸度确定
按照1.2.1小节的方法进行发酵乳制备,在发酵前分别用乳酸调节复原乳pH至3、4、5和6,用碳酸氢钠溶液调节pH至7,然后进行发酵。
1.2.5 发酵温度确定
按照1.2.1小节的方法制备发酵乳,分别控制发酵温度为25、35、42、45和50 ℃。
1.2.6 发酵时间控制
按照1.2.1小节制备发酵乳,每隔1 h进行发酵乳的采集,直至发酵6 h。
1.2.7 乳酸菌种类控制
按照1.2.1小节制备发酵乳,改变发酵剂类型,分别以嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌作为发酵剂进行发酵。
1.2.8 色谱条件
高效液相色谱柱温箱柱温为40 ℃,进样量10 μL,以0.4%乙酸和甲醇为流动相,流速1 μL/mL,进行等度洗脱,检测波长为240 nm。
1.2.9 数据分析
全部数据用SPSS 23.0分析,采用Origin 9.5 以及Office 2019绘制图表。
2 结果与讨论
2.1 苯甲酸与马尿酸HPLC方法验证
2.1.1 线性范围、线性方程以及检出限
配制质量浓度为0、0.1、0.5、1、5、10、20 μg/mL的马尿酸和苯甲酸标准溶液,上机检测,10 μg/mL标准溶液谱图如图1所示。结果表明,在0～20 μg/mL质量浓度范围内有着比较好的线性关系,马尿酸和苯甲酸的相关系数分别为0.999 8和0.999 7,线性方程、线性范围、相关系数、检出限[13](3 S/N)、定量限[13](10 S/N)如表1所示。发酵乳样品色谱图见图2。由实验结果可知该方法对马尿酸和苯甲酸有着较高的分离度,且灵敏度好。
表1 马尿酸与苯甲酸检测的线性方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限
Table 1 Linear equation,linear range,correlation coefficient,detection limit and quantification
limit for hippuric acid and benzoic acid
组分线性方程线性范围/(μg·mL-1)相关系数(R2)检出限/(μg·mL-1)定量限/(μg·mL-1)马尿酸y=31 192.7x+207.050～200.999 80.0220.076苯甲酸y=40 531.9x-248.9760～200.999 70.0460.154
图1 不同浓度马尿酸、苯甲酸标准品液相色谱图
Fig.1 Liquid chromatograms of different concentrations of
hippuric acid and benzoic acid standards
图2 发酵乳样品液相色谱图
Fig.2 Liquid chromatogram of fermented milk sample
2.1.2 回收率和精密度
取发酵乳样品,分别对其做1、5和10 μg/mL的加标回收实验(表2),样品按照1.2.2和1.2.3小节的方法进行处理。马尿酸和苯甲酸的回收率分别为97.46%、98.67%。
表2 发酵乳样品马尿酸与苯甲酸的回收率
Table 2 Recovery of hippuric acid and benzoic acid in
fermented milk
组别加标量/(μg·mL-1)测定值/(μg·mL-1)回收率/%平均回收率/%10.982±0.00598.17±0.49马尿酸54.638±0.02095.26±0.4097.46±1.72109.896±0.02198.96±0.2110.989±0.00898.86±0.76苯甲酸54.924±0.02698.06±0.5298.67±0.68109.908±0.04099.08±0.40
选取一个发酵乳样品,进行7次平行实验,测定相应的峰面积(表3)。结果表明,马尿酸与苯甲酸的RSD分别为0.405%和1.298%,均小于15%,该方法有较好的重复性和准确性[14]。
表3 发酵乳样品马尿酸与苯甲酸的精密度测定
Table 3 Repeatability analysis of hippuric acid
and benzoic acid in yogurt
组别测定值/(μg·mL-1)1234567平均值/(μg·mL-1)RSD/%马尿酸5.7545.7585.7495.7835.7685.7125.7325.7510.405苯甲酸0.8530.8230.8410.8480.8470.8570.8460.8451.298
2.2 发酵乳中苯甲酸产生的影响因素
2.2.1 全脂乳粉含量的影响
分别添加6%、8%、10%、12%、14%的全脂乳粉,0.02%嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌混合发酵剂,发酵温度40 ℃,发酵6 h制备发酵乳。测定发酵完成的样品中马尿酸和苯甲酸含量,结果如图3所示。
图3 不同全脂乳粉浓度发酵乳中马尿酸和苯甲酸含量
Fig.3 Contents of hippuric acid and benzoic acid in fermented
milk with different whole milk powder concentration
随着乳粉含量的增加,发酵乳中马尿酸的含量也相应提高。全脂乳粉在6%～14%的范围内,发酵前发酵乳中马尿酸含量为23.732～55.667 μg/mL,发酵后马尿酸含量明显降低,其范围在20.402～35.997 μg/mL;苯甲酸在全脂乳粉含量为14%的发酵乳中含量最高,为(12.078±0.135)μg/mL。结果表明发酵乳中苯甲酸的含量与原料乳中马尿酸水平呈正相关。
2.2.2 发酵初始酸度的影响
发酵乳发酵前加入乳酸调节pH(3～7),观察初始pH对发酵乳中苯甲酸产生的影响。发酵条件与1.2.1小节一致,实验结果如图4所示。在发酵过程中,当初始pH<6时,随着pH值的升高,苯甲酸的含量逐渐递增,同时,马尿酸的含量逐步降低。当pH值>6时,发酵乳中苯甲酸含量呈下降趋势。乳酸菌最适生长pH为5.5～6.5[15-17],当初始pH<4时,样品中马尿酸转化成苯甲酸的能力较弱,苯甲酸含量较低。
图4 不同pH对发酵乳中马尿酸和苯甲酸的影响
Fig.4 Effects of different pH on hippuric acid and
benzoic acid in fermented milk
2.2.3 发酵温度的影响
观察在25、35、40、45、50 ℃下发酵乳中马尿酸和苯甲酸的变化规律。40 ℃下,苯甲酸含量达到最高值,为(10.448±0.576)μg/mL。高于40 ℃时,苯甲酸含量随着发酵温度的升高,呈下降趋势(图5)。
图5 发酵温度对发酵乳中马尿酸和苯甲酸的影响
Fig.5 Effects of temperature on hippuric acid and
benzoic acid in fermented milk
文献表明苯甲酸产生的最佳温度分别为40 ℃以及38.12 ℃[18-19],与本实验结果较为一致。当发酵温度为40 ℃时,乳酸菌处于最佳的代谢温度,代谢强度也达到较高的水平,从而促进了马尿酸的水解,产生更多的苯甲酸。
2.2.4 发酵时间的影响
在发酵过程中,每隔1 h取1次样品,进行发酵乳中马尿酸和苯甲酸检测,观察在发酵过程中马尿酸和苯甲酸的转化规律。随着发酵时间的延长,苯甲酸含量呈现上升趋势,马尿酸含量与之相反,且在2～4 h内苯甲酸含量增加较快(图6),之后趋于平缓。SIGITA等[20]报道乳酸菌处于生长对数期时,马尿酸转化苯甲酸的速度较快。
图6 发酵过程中苯马尿酸和苯甲酸的变化
Fig.6 Changes of benzoic acid and benzoic acid during
fermentation
2.2.5 乳酸菌种类的影响
以不同的乳酸菌作为发酵剂制备发酵乳,比较不同菌种之间产生苯甲酸的差异。在选取的5种发酵剂中双歧杆菌产生的苯甲酸含量最低(0.238 μg/mL),以鼠李糖乳杆菌作为发酵剂的样品中苯甲酸含量最高(10.355 μg/mL)。作为发酵乳中常用的保加利亚乳杆菌,也产生较高浓度的苯甲酸(图7)。
图7 发酵乳中不同发酵剂对苯甲酸含量的影响
Fig.7 Effects of different starter on benzoic acid
content in fermented milk
在YU等[19]的研究中,当发酵24 h时,鼠李糖乳杆菌发酵的发酵乳苯甲酸含量为13.89 μg/mL,由双歧杆菌产生的苯甲酸为1.43 μg/mL。实验结果表明,发酵乳中苯甲酸的产生受到发酵剂类型的影响。
2.3 市售发酵乳中苯甲酸含量的检测
从超市购买12个不同品牌的发酵乳,分析不同发酵乳中苯甲酸之间的含量差异,结果见表4所示。所有样品中均有苯甲酸的检出,含量范围为0.73～7.373 μg/mL,平均值为2.692 μg/mL,与谭连英等[21]报道的保质期内发酵乳的苯甲酸含量接近。市售酸奶中不同品牌间苯甲酸存在差异(P<0.05),分析其原因:一是不同品牌的发酵乳配料及含量存在差异,尤其是原料乳方面；二是不同厂家使用的发酵剂的类型不一,不同乳酸菌之间产苯甲酸能力不同；三是不同发酵乳之间的发酵时间存在差异。
表4 不同市售发酵乳中马尿酸和苯甲酸含量差异
Table 4 Difference of hippuric and benzoic acid contents
in various market fermented milk
样品名称马尿酸/(μg·mL-1)苯甲酸/(μg·mL-1)样品名称马尿酸/(μg·mL-1)苯甲酸/(μg·mL-1)18.277±0.074e0.912±0.104AB79.227±0.384f1.103±0.127BC20.505±0.062a7.373±0.196G80.332±0.013a4.387±0.148F34.850±0.245c1.238±0.072C9ND3.630±0.057E4ND4.287±0.141F105.691±0.274d1.027±0.055BC55.442±0.055d2.178±0.161D115.777±0.181d0.730±0.012A62.630±0.032b4.318±0.118F128.882±0.139f1.117±0.044BC
注：ND表示未检测到;不同角标字母之间存在显著性差异(P<0.05)
3 结论
通过研究不同含量的全脂乳粉、发酵温度、发酵时间、pH、乳酸菌种类5个因素，了解发酵乳中苯甲酸产生的影响因素。结果表明,所有发酵乳中均有苯甲酸的检出,以上5个因素对发酵乳中苯甲酸产生均有一定的影响。在不同含量的全脂乳粉中,发酵乳中苯甲酸的含量与原料乳中马尿酸水平呈正相关；在发酵过程中,当初始pH<6时,随着pH值的升高,苯甲酸的产生逐渐递增；在发酵温度40 ℃下,产生苯甲酸的含量达到最高值；乳酸菌处于生长对数期时,马尿酸转化苯甲酸的速度较快；在选取的5种不同发酵剂中,双歧杆菌产生的苯甲酸含量最低。本研究为发酵乳中苯甲酸的监管检验提供了科学参考。
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