药用陈皮(Citri retriculatae pericarpium)标准现收载于《中国药典》2015 年版一部,为芸香科植物橘(Citrus reticulata Blanco)及其栽培变种的干燥成熟果皮,具有理气健脾、燥湿化痰的功效,可分为广陈皮和陈皮[1]。广陈皮主产于广东新会一带,乃“广东三宝”之首和“广东十大中药”之一。目前市场上的普通陈皮以湖北蜜桔陈皮和福建芦柑陈皮为主。广陈皮和普通陈皮在临床和日常食用中均应用十分广泛。
挥发油是陈皮的主要成分之一,目前陈皮挥发油中分离鉴定的化合物多达160多种[2],包括单萜(烯)、倍半萜(烯)和含氧化合物(酸、酯、醛、酮类化合物),以单萜类和倍半萜类化合物为主。作为陈皮活性的重要来源,陈皮挥发油具有抗氧化和抗菌活性[3],且可延长水产品的保质期[4-5]。但是目前有关挥发油活性的研究主要集中在混合物的抗氧化性研究方面,对其主要的抗氧化活性组分研究知之甚少。本文拟在分析广陈皮和普通陈皮挥发油组分的基础上,测试陈皮挥发油单体对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2, 2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS)阳离子自由基清除能力和还原能力,以探索陈皮挥发油中抗氧化性的关键组分,完善陈皮挥发油的抗氧化活性研究。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
陈皮样品采自2019年新会茶枝柑和福建南平芦柑果皮,自行晾晒制备。
无水硫酸钠、无水乙醇(均为分析纯),天津市大茂化学试剂厂；正己烷、甲醇(均为色谱纯),MREDA；β-蒎烯、α-松油烯、p-伞花烃、D-柠檬烯、γ-萜品烯、萜品油烯、芳樟醇、4-萜烯醇、α-松油醇、癸醛、紫苏醛、香芹酚、邻甲氨基苯甲酸甲酯、DPPH、ABTS、K2S2O8、2,4,6-三吡啶基三嗪盐酸溶液(2,4,6-Tri(2-pyridyl)-1,3,5-triazine,TPTZ)、L-抗坏血酸(维生素C,VC),阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
Aglient 8890/7000D气相色谱串联质谱仪,美国Agilent 公司；TECAN Spark®多功能微孔板检测仪,瑞士Tecan公司；FW100高速万能粉碎机,天津市泰斯特仪器有限公司；DF-101S集温式恒温加热磁力搅拌器,德祥科技有限公司；FA2140电子分析天平,上海民桥精密科学仪器有限公司；KQ-400DE数控超声波清洗器,昆山声仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 陈皮挥发油的提取
采用2015版《中国药典》挥发油测定法进行提取测定。具体步骤：准确称取适量陈皮,置于高速万能粉碎机中粉碎,过40目筛,避光密封保存备用。在电子天平上准确称取15 g陈皮粉末,加入到250 mL圆底烧瓶中,按料液比1∶10 (g∶mL)加入150 mL水浸泡1 h,然后放入玻璃珠,振荡混匀,连接挥发油测定器和回流冷凝管,置于油浴锅中进行水蒸气蒸馏提取,直至测定器油量不再增加(5 h),停止蒸馏。放置片刻,读取挥发油量,并计算陈皮中挥发油的含量(mL/g 陈皮样品量)。读取挥发油量后收集上层挥发油,使用无水硫酸钠干燥脱水,于4 ℃避光保存备用。
1.3.2 陈皮挥发油的组成分析
将脱水后的挥发油加正己烷稀释10倍,过0.22 μm微孔有机滤膜过滤,待GC-MS分析。GC-MS分析条件：Aglient HP-5MS 石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)；载气为高纯度氦气(99.999%)；程序升温条件为柱温60 ℃,维持3 min,以1 ℃/min 升温至80 ℃,维持3 min,再以5 ℃/min升温至250 ℃,溶剂延迟3 min；进样量1 μL；分流比为200∶1；电离方式为EI,电子能量70 eV,离子源温度为230 ℃,四级杆温度150 ℃,扫描范围m/z：30～450。
样品经上述条件进行分析后,通过谱库检索和标准品图谱比对鉴定挥发油组分,用面积归一化法初步测定挥发油各组分的相对质量分数。
1.3.3 陈皮挥发油和单体化合物的DPPH自由基清除能力测定
根据文献测定陈皮挥发油和单体对DPPH自由基的清除活性并稍做修改[6]。首先用无水乙醇配制0.13 mmol/L 的DPPH自由基溶液,然后取100 μL不同浓度的样品甲醇溶液,加入300 μL上述配制的DPPH自由基溶液,混合均匀,室温避光放置1 h,于517 nm波长处测定其吸光度。按公式(1)计算DPPH自由基清除率：
DPPH自由基清除率
(1)
式中:A0表示用甲醇代替样品所测得的吸光度；A1表示样品所测得的吸光度。
1.3.4 陈皮挥发油和单体化合物的ABTS阳离子自由基清除能力测定
根据文献测定陈皮挥发油和单体对ABTS阳离子自由基的清除活性并稍做修改[6]。首先用蒸馏水配制7.4 mmol/L ABTS和2.6 mmol/L K2S2O8的储备液,然后将ABTS和K2S2O8溶液等体积混合,室温避光静置12 h,用蒸馏水稀释20倍后待用。取不同浓度的样品甲醇溶液50 μL,加入1 mL 上述配制的ABTS工作液,混合均匀,室温避光放置1 h,于734 nm处测定其吸光度。按公式(2)计算ABTS阳离子自由基清除率：
ABTS阳离子自由基清除率
(2)
式中:A0表示用甲醇代替样品所测得的吸光度；A1表示样品所测得的吸光度。
1.3.5 陈皮挥发油和单体化合物的还原能力测定
根据文献[7]测定陈皮挥发油和单体还原Fe3+的能力并稍做修改。首先用蒸馏水配制0.3 mol/L 醋酸缓冲溶液(pH 3.6)、10 mmol/L TPTZ溶液和 20 mmol/L FeCl3溶液,按体积比10∶1∶1配制铁还原/抗氧化能力(ferric reducing/antioxidant power，FRAP)工作液,现用现配。分别取 0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L FeSO4 各50 μL,加入1.45 mL FRAP工作液,混合均匀,37 ℃水浴30 min,以蒸馏水为参比,采用酶标仪于593 nm处测定吸光度,然后以吸光度为纵坐标和FeSO4浓度为横坐标绘制标准曲线,得回归方程为 y=0.439 36x-0.001 04(R2=0.999 9)。分别取50 μL不同浓度的样品甲醇溶液,以甲醇为参比,采用上述方法处理后测定其在593 nm处吸光度。样品的抗氧化能力FRAP值以Fe2+(相当于FeSO4)表示(mmol/L)。
1.3.6 数据统计分析
采用SPSS Statistics 20软件对实验结果进行差异显著性分析,每组实验均进行3次平行试验,结果用mean±SD表示。
2 结果与分析
2.1 陈皮挥发油的提取和组成分析
2.1.1 陈皮挥发油的提取
对所采摘和制备的陈皮样品(新会茶枝柑、福建南平芦柑)采用水蒸气蒸馏法提取挥发油,其平均得率和挥发油颜色见表1。在提取过程中发现,加NaCl并不能改善挥发油的提取,且陈皮粉碎后需要立即提取挥发油,否则严重影响挥发油提取率。由表1可知,新会陈皮的挥发油得率较高,为0.12 mL/g；福建产地陈皮的挥发油含量为0.07 mL/g。这与文献报道的大多数陈皮的挥发油含量在0.03%～8.00%较为一致[8-10]。挥发油一般贮存于果皮油胞中,果皮中的油胞数量直接影响挥发油含量和颜色。前期调研显示新会陈皮相比其他产地陈皮具有大量油胞是其特色之一。挥发油颜色的差异提示不同产地陈皮挥发油在组成上存在差异。
表1 不同产地陈皮挥发油平均得率
Table 1 Yield of volatile oil in Citri retriculatae pericarpium
from different samples
陈皮产地品种得率/(mL·g-1)提取颜色新会茶枝柑0.12±0.015a无色福建南平芦柑0.07±0.005b黄绿色
注：不同字母表示组间差异达显著水平(P<0.05)
2.1.2 陈皮挥发油的组成分析
本文进一步对新会茶枝柑和福建芦柑2种陈皮的挥发油进行 GC-MS 鉴定分析,谱图如图1所示,结合谱图检索和标准品比对共鉴定出23种挥发油成分,其面积归一化分析结果见表2。
1-α-侧柏烯；2-α-蒎烯；3-桧烯；4-β-蒎烯；5-β-月桂烯；6-α-松油烯；7-p-伞花烃；8-D-柠檬烯；9-γ-萜品烯；10-萜品油烯；11-芳樟醇；12-4-萜烯醇；13-α-松油醇；14-癸醛；15-紫苏醛；16-香芹酚；17-邻甲氨基苯甲酸甲酯；18-β-丁香烯；19-α-石竹烯；20-右旋大根香叶烯；21-金合欢烯；22-杜
松烯；23-大根香叶烯B
图1 陈皮挥发油的GC-MS谱图
Fig.1 The GC-MS chromatogram of volatile oil in Citri retriculatae
pericarpium from Xinhui and Fujian
表2 新会和福建陈皮挥发油的组成及其面积归一化结果
Table 2 Chemical composition and peak area normalization
of volatile oil in Citri retriculatae pericarpium
from Xinhui and Fujian
序号化合物名称RT/min新会陈皮挥发油福建陈皮挥发油峰面积峰面积百分比/%面积峰面积百分比/%1α-侧柏烯8.41733 185 5660.5213 929 4110.122α-蒎烯8.74393 536 5641.4868 092 4920.583桧烯10.85613 075 9220.2112 549 4350.114β-蒎烯11.01771 439 5661.1340 897 8220.355β-月桂烯11.967102 930 8341.63186 270 6561.606α-松油烯13.64529 040 3670.4620 566 1700.187p-伞花烃14.23766 658 1801.0566 068 6290.578D-柠檬烯14.6974 282 952 94167.629 311 124 29079.919γ-萜品烯16.9941 295 767 27820.461 017 525 1538.7310萜品油烯19.46068 447 5261.0858 762 7600.5011芳樟醇20.67310 131 3950.1659 876 3650.51124-萜烯醇28.23917 100 7130.2714 516 1470.1213α-松油醇29.35131 055 7180.4932 023 5150.2714癸醛30.64614 043 3550.2226 275 6410.2315紫苏醛34.0915 781 7270.0912 660 4460.1116香芹酚35.06518 686 4400.30--17邻甲氨基苯甲酸甲酯39.144121 345 3841.93--18β-丁香烯39.53512 139 2060.1927 388 4200.2419α-石竹烯40.5781 209 0440.0244 524 7000.3820右旋大根香叶烯41.400930 8830.01146 620 6551.2721金合欢烯42.09441 124 9830.65382 907 5893.3122杜松烯42.5443 357 5020.0584 383 3520.7323大根香叶烯43.463--25 397 3250.22
注：“-” 表示未检出
从表2可以看出,陈皮挥发油的主要成分是单萜烯(通式为C10H16)、倍半萜烯(通式为C15H24)和含氧化合物。陈皮挥发油中,单萜烯以D-柠檬烯和γ-萜品烯为主,还含有少量的α-侧柏烯、α-蒎烯、桧烯、β-蒎烯、β-月桂烯、α-松油烯和萜品油烯,单萜烯分别占新会陈皮和福建陈皮挥发油总量的94.58%和92.08%。从表2和图1也可以看出，新会陈皮挥发油较福建陈皮挥发油含有相对降低的D-柠檬烯和相对较高的γ-萜品烯,进一步计算D-柠檬烯/γ-萜品烯比值可以得出新会陈皮挥发油和福建陈皮挥发油中该比值分别为3.30和9.15,这与文献报道基本一致[9-15]。新会陈皮挥发油中D-柠檬烯/γ-萜品烯比值在9以下,而非新会陈皮挥发油中D-柠檬烯/γ-萜品烯值在9以上,提示陈皮挥发油中的D-柠檬烯与γ-萜品烯的含量比值可作为新会陈皮的鉴定依据之一。陈皮挥发油中检测到的倍半萜烯有金合欢烯、右旋大根香叶烯、杜松烯、石竹烯、丁香烯和大根香叶烯,倍半萜烯分别占新会陈皮和福建陈皮挥发油总量的0.93%和6.10%；从图1也可以看出,福建陈皮挥发油较新会陈皮挥发油含有较多的倍半萜烯。
陈皮挥发油中检测到的含氧化合物主要有醇类(芳樟醇、4-萜烯醇、α-松油醇)、醛类(癸醛、紫苏醛)和酚类(香芹酚)化合物,其中邻甲氨基苯甲酸甲酯作为检测到的唯一一种含氮化合物仅在新会陈皮挥发油中有检出,和文献报道一致[12,16-17],可用于鉴定区分新会陈皮与其他产地陈皮。值得注意的是,除邻甲氨基苯甲酸甲酯,香芹酚在本文中也仅在新会陈皮中检出,文献报道[18]香芹酚的同分异构体百里香酚在福建陈皮(购自中药店)中有检出,而本文中未检出,提示陈皮挥发油中酚类化合物的存在与陈皮的品种和产地均有关,不是新会茶枝柑陈皮的特有化合物。
2.2 陈皮挥发油的抗氧化性
为进一步比较不同陈皮挥发油的抗氧化性,本文比较了新会茶枝柑和福建芦柑陈皮挥发油的DPPH自由基清除率、ABTS阳离子自由基清除率和还原能力。由图2可以看出,新会和福建陈皮挥发油均具有DPPH、ABTS阳离子自由基清除能力和还原能力,且自由基清除能力和还原能力在测试质量浓度范围内具有明显的量效关系：随着样品质量浓度的增加而增强,其中新会茶枝柑相比福建芦柑陈皮具有较强的还
原Fe3+能力。在样品质量浓度为 100 mg/mL时,新会挥发油的还原能力为(3.299±0.025)mmol/L,而福建挥发油的还原能力仅为(1.706±0.025) mmol/L。但两者自由基清除活性相当,在样品质量浓度为80 mg/mL时,2种陈皮挥发油的自由基清除活性接近,其DPPH、ABTS阳离子自由基清除活性最高分别达到87.78%、90.28%和87.70%、87.28%；在低质量浓度范围内(15～80 mg/mL),新会茶枝柑陈皮挥发油的DPPH自由基清除能力弱低于福建芦柑陈皮,ABTS阳离子自由基清除能力与福建芦柑陈皮相当。通过线性回归可计算出新会茶枝柑和福建芦柑陈皮挥发油清除DPPH、ABTS阳离子自由基能力的IC50值分别为31.64、15.63 mg/mL和19.14、13.75 mg/mL。
2.3 陈皮挥发油单体化合物的抗氧化性
基于上述新会茶枝柑和福建芦柑陈皮挥发油的组成和抗氧化性差异,本文进一步测试了挥发油单体的DPPH自由基清除率、ABTS阳离子自由基清除率和还原能力以初步探索陈皮挥发油中抗氧化性的关键组分。结合GC-MS测定结果和可购买得到的单体化合物,本文选择测定了13种单体(β-蒎烯、α-松油烯、p-伞花烃、D-柠檬烯、γ-萜品烯、萜品油烯、芳樟醇、4-萜烯醇、α-松油醇、癸醛、紫苏醛、香芹酚、邻甲氨基苯甲酸甲酯)的抗氧化性。
a-DPPH自由基清除活性；b-ABTS阳离子自由基清除活性；c-还原能力
图2 新会和福建陈皮挥发油的抗氧化性
Fig.2 Antioxidant activity of volatile oil in Citri retriculatae pericarpium from Xinhui and Fujian
由于初步预实验发现D-柠檬烯、α-松油醇、4-萜烯醇、癸醛和p-伞花烃以纯品测试其自由基清除率时仍较低(自由基清除率<50%),故图3和图4未进一步开展这几种化合物的量效关系研究,表3只显示了这几种化合物纯品的自由基清除率,结合这几类化合物在陈皮挥发油的含量可说明芳香烃类化合物与与醛醇类含氧化合物对陈皮挥发油的抗氧化性贡献可忽略。值得注意的是,D-柠檬烯的ABTS阳离子自由清除率呈较大的负值,提示其具有较强的促进ABTS阳离子自由基生成能力,有待进一步研究。
由图3和图4可见,紫苏醛、芳樟醇、4种单萜烯(α-松油烯、β-蒎烯、γ-萜品烯和萜品油烯)和香芹酚的DPPH自由基清除活性随着质量浓度的增加均增强；邻甲氨基苯甲酸甲酯、3种单萜烯(α-松油烯、γ-萜品烯和萜品油烯)和香芹酚的ABTS阳离子自由基清除活性随着质量浓度的增加也呈增加趋势。有趣的是,邻甲氨基苯甲酸甲酯无显著的DPPH自由基清除活性,但在1～10 mg/mL内具有较强的ABTS阳离子自由清除活性,且呈量效关系,在10 mg/mL时清除率为68%。通过图3进一步计算这些化合物的IC50值(见表3),得出DPPH自由基清除能力强弱排序为：香芹酚>萜品油烯>γ-萜品烯>α-松油烯>紫苏醛>β-蒎烯>芳樟醇；ABTS阳离子自由基清除能力强弱排序为：香芹酚>α-松油烯>邻甲氨基苯甲酸甲酯>萜品油烯>γ-萜品烯。
图3 挥发油单体化合物的DPPH自由基清除能力
Fig.3 DPPH radical scavenging activity of individual compounds in Citri retriculatae pericarpium volatile oil
图4 挥发油单体化合物的ABTS阳离子自由基清除能力
Fig.4 ABTS radical scavenging activity of individual compounds in Citri retriculatae pericarpium volatile oil
在所有分析的单萜烯(萜品油烯、γ-萜品烯、α-松油烯、β-蒎烯、D-柠檬烯)化合物中,D-柠檬烯作为陈皮挥发油中含量最高的成分具有最低的自由基清除活性,萜品油烯和α-松油烯分别呈现最高的DPPH自由区清除能力(IC50=14.68 mg/mL)和ABTS阳离子自由基清除能力(IC50=3.755 mg/mL)。不同单萜烯抗氧化性的差异提示单萜烯中双键位置的差异对其抗氧化性影响较大,其构效关系值得进一步探讨。作为陈皮挥发油中含量最高的2种化合物D-柠檬烯和γ-萜品烯,目前已有文献报道[19-20],γ-萜品烯具有显著强于D-柠檬烯的DPPH自由基清除活性,且含γ-萜品烯越多的挥发油其DPPH自由基清除活性越强。结合3.2小节陈皮挥发油的组成含量可发现,新会陈皮相比福建陈皮挥发油具有相对较高的γ-萜品烯,但并不具有相对较高的自由基清除活性,提示陈皮挥发油的抗氧化性不仅仅与γ-萜品烯含量有关,还与其他化合物有关。作为仅在新会陈皮中检出的酚类化合物香芹酚,其DPPH和ABTS阳离子自由基清除率在所有分析的化合物中活性最强,其IC50值分别低至0.638 7 mg/mL和0.081 88 mg/mL,其中ABTS阳离子自由基清除率与VC相当。结合表2数据可看出,虽然香芹酚在陈皮挥发油中的含量很低(0.30%),但其强抗氧化性对陈皮挥发油的抗氧化性贡献不可忽略。
表3 挥发油单体化合物的自由基清除活性
Table 3 Radical scavenging activity of individual compounds
in Citri retriculatae pericarpium volatile oil
化合物DPPH自由基清除活性ABTS阳离子自由基清除活性IC50/(mg·mL-1)纯品自由基清除率/%IC50/(mg·mL-1)纯品自由基清除率/%VC (阳性对照)0.031 330.085 19香芹酚0.638 70.081 88萜品油烯14.6863.82γ-萜品烯61.5484.90α-松油烯138.40.274 1紫苏醛143.180.19±0.7635.20±0.51β-蒎烯458.012.19±3.40芳樟醇729.570.06±0.372.04±0.21D-柠檬烯46.21±0.62-976.7±140.1α-松油醇23.68±3.635.59±0.534-萜烯醇12.39±1.6910.75±0.46邻甲氨基苯甲酸甲酯12.19±0.743.755癸醛8.91±0.45-3.21±0.85p-伞花烃4.49±0.3910.82±0.68
图5显示了7种单体化合物(紫苏醛、β-蒎烯、萜品油烯、γ-萜品烯、邻甲氨基苯甲酸甲酯、α-松油烯、香芹酚)在一定浓度范围内的还原能力。其他6种单体化合物(p-伞花烃、D-柠檬烯、芳樟醇、4-萜烯醇、α-松油醇和癸醛)以纯品测试其还原能力时其FRAP值基本都为零,故未进一步测试。由图5中各图的横纵坐标可知,在所测试的单体化合物中,单体化合物的还原能力均随浓度增加而增强,但浓度范围有所差异；香芹酚具有最强还原能力,其FRAP值在同浓度下弱低于阳性对照VC,与VC具有可比性；邻甲氨基苯甲酸甲酯的还原能力其次；接下来是单萜烯,不同单萜烯的还原能力顺序有：α-松油烯>萜品油烯>γ-萜品烯>β-蒎烯。结合3.2节陈皮挥发油的组成含量(香芹酚和邻甲氨基苯甲酸甲酯仅在新会陈皮挥发油中检出,单萜烯(α-松油烯、萜品油烯、γ-萜品烯和β-蒎烯)在新会陈皮挥发油中的相对含量均高于福建陈皮挥发油)可推测,新会陈皮相比福建陈皮挥发油具有相对较高的还原能力可能与新会陈皮挥发油中含有一定量的香芹酚、邻甲氨基苯甲酸甲酯,以及含有相对含量较高的还原能力较强的单萜烯类化合物有关。
图5 陈皮挥发油单体化合物的还原能力
Fig.5 Ferric reducing/antioxidant activity of individual compounds in Citri retriculatae pericarpium volatile oil
3 结论
本文利用水蒸气蒸馏法提取新会茶枝柑和福建南平芦柑陈皮中的挥发油,并对其组分进行GC-MS分析,共鉴定出23种成分,单萜烯类含量最多,主要成分为D-柠檬烯,其次是γ-萜品烯；新会茶枝柑陈皮挥发油相比福建南平芦柑陈皮挥发油具有相对较低的D-柠檬烯/γ-萜品烯值,福建陈皮挥发油相比福建陈皮挥发油具有相对较高含量的倍半萜烯,同时邻甲氨基苯甲酸甲酯和香芹酚仅在新会陈皮挥发油中检出。抗氧化性测定结果显示新会茶枝柑陈皮挥发油相比福建芦柑陈皮挥发油具有相当的自由基清除能力和较强的还原能力；单体中香芹酚的抗氧化性最高,弱低于阳性对照VC,单萜烯(萜品油烯、γ-萜品烯和α-松油烯)抗氧化性其次,D-柠檬烯与醛醇类含氧化合物的抗氧化性较低,邻甲氨基苯甲酸甲酯无显著的DPPH自由基清除活性,但具有较强的ABTS阳离子自由清除活性和还原能力。结合陈皮挥发油组成和其单体化合物的抗氧化性测试表明单萜烯(萜品油烯、γ-萜品烯和α-松油烯)、香芹酚和邻甲氨基苯甲酸甲酯对挥发油的抗氧化性贡献较大,醛类和醇类含氧化合物对挥发油的抗氧化性可忽略。此外,单萜烯中双键位置的差异对其抗氧化性影响较大,其构效关系值得进一步探讨,同时单萜烯和酚类化合物的抗氧化性是否存在相互影响也值得进一步探讨。
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