蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露,与自身分泌物混合后,经充分酿造而成的天然甜物质[1]。蜂蜜成分复杂,营养丰富,具有多种生物学活性,是一种传统的功能性食品[2]。根据蜜蜂采集的植物种类数量,蜂蜜可分为单花蜜和百花蜜,进一步按照采集的具体植物,单花蜜又可分为油菜蜜、洋槐蜜、枣花蜜、枇杷蜜等数十种；此外也可根据生产蜂蜜的蜜蜂种类来划分,由西方蜜蜂(Apis mellifera)生产的蜂蜜俗称为意蜂蜜或洋蜂蜜,由东方蜜蜂(Apis cerana)生产的蜂蜜俗称为中蜂蜜或土蜂蜜[3]。
除市场上常见的洋蜂蜜和近些年发展迅速的土蜂蜜外,我国自然分布的蜜蜂属(Apis genus)其他蜂种如大蜜蜂、黑大蜜蜂、小蜜蜂、黑小蜜蜂,以及无刺蜂属(Trigona genus)的蜜蜂也可以生产蜂蜜。但是由于这些蜜蜂种类处于野生状态,蜂蜜产量稀少,季节性也很强,市场上未大量流通。大蜜蜂(Apis dorsata)别名排蜂、马长蜂,主要分布于我国云南、广西、海南及周边的南亚和东南亚热带地区,主要在树上筑巢；黑大蜜蜂(Apis laboriosa)别名岩蜂、喜马拉雅排蜂、雪山蜜蜂,主要分布于我国的云南西北部、西藏及相邻的尼泊尔、不丹、缅甸等喜马拉雅山脉高海拔地区,主要在悬崖上筑巢[4]。大蜜蜂和黑大蜜蜂的个体较大,采集能力强,蜂巢也较大,因此在采蜜季节单群贮蜜量很大,且常常多个蜂群聚集分布。近年来,随着人们对野生蜂蜜和高端蜂蜜的追捧,大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜价格不断攀升,采蜜季节寻蜂取蜜的当地人也越来越多,逐渐形成了一定的市场规模。然而目前关于我国大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜的相关研究还很少。
国内外关于蜂蜜理化指标和抗氧化物质测定以及抗氧化性活性评价的研究较多[5]。著名的新西兰麦卡卢蜂蜜中含有多种多酚类物质,具有较强的抗氧化能力[6]。曹炜等[7]测定了10种蜂蜜的总酚酸含量和抗氧化活性,发现荞麦蜜的总酚酸含量较高,蜂蜜中总酚酸的含量与其抗氧化活性成正相关。郭夏丽等[8]对洋槐蜜等7种不同蜜源蜂蜜的总酚、总黄酮含量及抗氧化能力进行研究,发现蜂蜜颜色越深,总酚与总黄酮含量越高,其抗氧化能力越强。大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜的相关研究主要集中在国外。研究发现,尼泊尔大蜜蜂蜂蜜[9]和巴基斯坦大蜜蜂蜂蜜[10]的理化指标符合国际标准,泰国大蜜蜂蜂蜜[11]可能含有一种可以抑制某些细菌生长的抗菌肽。对马来西亚不同蜂种采集的不同单花蜜的理化指标和抗氧化活性比较分析发现,大蜜蜂蜂蜜具有最强的抗氧化活性[12]。本研究以我国主要分布区的大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜为研究对象,参照相关标准测定基本理化指标,测定蜂蜜中的抗氧化物质(总黄酮、总酚)及抗氧化能力(DPPH自由基清除能力、还原能力),同时与国内外相关研究对比分析,以期为我国主要野生蜂蜜的品质评价提供基础数据,同时有助于规范相关蜂蜜产业的发展。
1 材料与方法
1.1 样本采集
大蜜蜂蜂蜜样品采自我国大蜜蜂主要分布区的云南、广西和海南,其中4个云南样品采自云南西双版纳,5个广西样品采自广西崇左,5个海南样品采自海南五指山。黑大蜜蜂蜂蜜样品采自我国黑大蜜蜂主要分布区的云南和西藏,其中5个云南样品采自云南文山,4个西藏样品采自西藏日喀则。每个蜂蜜样品来自一个蜂群,采集后低温运输至实验室,-20 ℃保存备用。另外采集1个西方蜜蜂洋槐蜜和1个东方蜜蜂枇杷蜜做抗氧化对比分析。
1.2 实验方法
1.2.1 理化指标的测定
参照《中华人民共和国供销合作行业标准-蜂蜜》(GH/T 18796—2012)[3]进行测定。水分测定参照《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准-进出口蜂蜜检验规程》(SN/T 0852—2012),果糖、葡萄糖、蔗糖含量测定参照《食品安全国家标准 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》(GB 5009.8—2016),羟甲基糠醛测定参照《蜂蜜中羟甲基糠醛含量的测定方法 液相色谱-紫外检测法》(GB/T 18932.18—2003),淀粉酶值测定参照《蜂蜜中淀粉酶值的测定方法-分光光度法》(GB/T 18932.16—2003)。每个地区的蜂蜜样品以及不同蜂种的蜂蜜样品计算平均数和标准差。
1.2.2 总酚含量的测定
采用Folin-Ciocalteu 法[13],具体方法参考郭夏丽等[8]。吸取1 mL稀释后的蜂蜜水溶液(200 mg/mL),加入1 mL的Folin-Ciocalteu试剂,混匀,然后加入5 mL 1 mol/mL的Na2CO3溶液,用蒸馏水定容至10 mL,混合均匀,室温避光条件下放置1 h,于760 nm波长下测定其吸光值,平行测定3次。配制不同浓度的没食子酸溶液,采用相同方法绘制标准曲线。根据标准曲线计算样品中的总酚含量,以没食子酸的相对量表示(mg GAE/100 g honey)。
1.2.3 总黄酮含量的测定
蜂蜜中总黄酮含量的测定采用亚硝酸钠-硝酸铝法[14-15]。称取20 g蜂蜜,加入丙酮15 mL,超声萃取20 min后,回旋振荡5 min,重复提取3次,合并所得上清液,利用旋转蒸发仪45 ℃减压浓缩至干,用甲醇溶解定容至10 mL。取5 mL溶液,加入6 mL水,1 mL 25 g/L的NaNO2,摇匀静置6 min。加入1 mL 50 g/L的Al(NO2)3,摇匀静置6 min。加入10 mL 22 g/L的NaOH,加水稀释摇匀,静置15 min,于510 nm波长下测定其吸光值,平行测定3次。配制不同浓度的芦丁溶液,采用相同方法绘制标准曲线。根据标准曲线计算样品中的总黄酮含量,以芦丁的相对量表示(mg RE/100 g honey)。
1.2.4 DPPH自由基清除实验
DPPH自由基清除实验参考王海敏等[16]。现配0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液,分别加入0.004、0.008、0.012、0.016、0.02、0.024 g/mL的蜂蜜水溶液,混合均匀,室温避光静置反应30 min,于517 nm 波长处测定吸光度。测定空白对照的吸光度值。计算每个样品对DPPH自由基的清除率。再计算出IC50值。
1.2.5 还原能力的测定
参考曹炜等[17]的方法。在试管中分别加入不同质量浓度的蜂蜜样品(0.075、0.1、0.125、0.15 g/mL),磷酸盐缓冲溶液(0.2 mol/L,pH 6.6)和1 g/L的铁氰化钾溶液,混合均匀,置于50 ℃水浴中反应20 min,然后加入10 g/L的三氯乙酸溶液,摇匀。在700 nm波长处测定吸光度。吸光度增加表明还原力增强。
2 结果与分析
2.1 理化指标测定结果
各个地区大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜样品的主要理化指标见表1。
水分含量高低是决定蜂蜜成熟程度的主要指标。大蜜蜂蜂蜜样品的水分含量平均值为(21.25±0.87)%。黑大蜜蜂蜂蜜样品的水分含量平均值为(21.52±1.07)%。各个地区大蜜蜂蜂蜜和黑大蜜蜂蜂蜜样品的水分含量平均值在20%～24%，在23个蜂蜜样品中,仅1个大蜜蜂蜂蜜样品的水分含量低于20%。因此,大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜样品的水分含量均达到行业标准二级蜂蜜要求。已有研究表明,尼泊尔大蜜蜂蜂蜜的水分含量平均在23%左右[9],印度大蜜蜂蜂蜜的水分含量接近24%[18],巴基斯坦大蜜蜂蜂蜜的水分含量平均在22%左右[10],泰国大蜜蜂蜂蜜的水分含量接近23%[19],马来西亚[12]和泰国[19]的大蜜蜂蜂蜜的水分含量均高于西方蜜蜂蜂蜜和东方蜜蜂蜂蜜。大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜水分含量较高,可能与分布地区和筑巢习性有关。大蜜蜂主要分布在热带雨林地区,湿度和温度较高,黑大蜜蜂产蜜季节的降水量也很高,因此蜜蜂蒸发花蜜中的水分相对困难。大蜜蜂属于露天营巢,水分容易进入,而西方蜜蜂和东方蜜蜂通常在洞穴筑巢。
表1 大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜理化指标
Table 1 Physicochemical indexes of Apis dorsata honey and Apis laboriosa honey
样品数量水分/% 果糖/% 葡萄糖/% 蔗糖/% 羟甲基糠醛/(mg·kg-1)云南大蜜蜂蜂蜜420.54±0.9035.09±1.6830.84±2.972.21±0.860.84±0.09广西大蜜蜂蜂蜜521.45±0.9134.24±3.4030.30±2.853.04±2.761.11±0.50海南大蜜蜂蜂蜜521.61±0.5834.71±1.5330.69±1.481.83±0.121.16±0.26云南黑大蜜蜂蜂蜜520.82±0.7235.12±0.5031.70±0.771.79±0.030.70±0.10西藏黑大蜜蜂蜂蜜422.39±0.7133.40±2.4429.76±3.421.76±0.031.01±0.26大蜜蜂蜂蜜平均1421.25±0.8734.65±2.2530.59±2.292.37±1.681.05±0.34黑大蜜蜂蜂蜜平均921.52±1.0734.35±1.7830.83±2.401.77±0.030.84±0.24蜂蜜行业标准≤20(一级) ≤24(二级)果糖+葡萄糖≥60≤5≤40蜂蜜国家标准未要求果糖+葡萄糖≥60≤5未要求
我国蜂蜜行业标准和蜂蜜食品安全国家标准(GB 14963—2011)[1]均规定果糖和葡萄糖的总含量≥60%。结果显示,各个地区大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜样品,果糖平均含量在35%左右,葡萄糖含量在30%左右,二者总含量在65%左右,符合标准要求。所有23个样品中,除1个大蜜蜂和1个黑大蜜蜂蜂蜜样品,其他样品的葡萄糖和果糖总含量均>60%。我国蜂蜜行业标准和蜂蜜国家标准均规定蔗糖含量≤5%,测定结果显示各个地区大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜样品,除1个大蜜蜂蜂蜜样品,其他样品均符合标准,其中20个蜂蜜样品的蔗糖含量<2%。尼泊尔大蜜蜂蜂蜜的果糖含量在40%左右,葡萄糖在20%左右,蔗糖在20%左右[9]。马来西亚大蜜蜂蜂蜜的总还原糖含量接近62%,蔗糖含量为1.66%[12]。蜂蜜的糖类指标与植物来源相关[20],不同国家和地区蜜源植物的不同,使花蜜中的糖含量存在差异,从而会造成蜂蜜的糖含量及组成存在差异。尼泊尔大蜜蜂蜂蜜的蔗糖含量过高可能与附近甘蔗种植有关[9]。
蜂蜜中的羟甲基糠醛(hydroxymethylfurfural,HMF)含量主要反映了蜂蜜的新鲜度。新鲜蜂蜜中一般不含HMF,如果长期加热或贮藏,蜂蜜中的氨基化合物与葡萄糖发生Maillard反应或者蜂蜜中的还原糖发生脱水反应生成HMF[21]。测定结果显示所有样品的HMF质量分数在1 mg/kg左右,远优于蜂蜜行业标准(≤40 mg/kg)。已有研究显示,尼泊尔大蜜蜂蜂蜜的HMF在30.36～56.10 mg/kg[9],马来西亚大蜜蜂蜂蜜约为60 mg/kg[12],巴基斯坦大蜜蜂蜂蜜在30.44～89.93 mg/kg[10]。热带地区由于气温较高,HMF含量也通常较高[12]。本研究中所有样品的HMF含量较低,可能与本研究的样品贮存有关。为了测定抗氧化活性等其他指标,本研究的样品采集后即低温运输至实验室-20 ℃保存。目前我国大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜产量很低,价格很高,大多都是在采蜜季节通过直销的方式售卖,运输时间较短,所以HMF含量应该也较低。
蜂蜜中的淀粉酶值含量高低可作为判断成熟蜜与非成熟蜜、原蜜与加热蜜、新蜜与陈蜜的依据。未经充分酿造的蜂蜜,淀粉酶含量低,经高温加热处理或贮藏过久的蜂蜜,其淀粉酶会受到破坏[21]。我国蜂蜜行业标准规定,淀粉酶值≥4 [mL/(g·h)]。测定结果显示大蜜蜂蜂蜜样品中,8个样品的淀粉酶值<4,其余6个样品的淀粉酶值在4～7；黑大蜜蜂蜂蜜样品中,3个样品的淀粉酶值<4,其余6个样品的淀粉酶值在4～12。部分蜂蜜样品的淀粉酶值未达到标准要求,可能与蜂蜜的成熟度有关。目前大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜的人工取蜜方式粗放,无法保证蜂蜜的成熟度,因此淀粉酶值可能差异较大。
2.2 总酚和总黄酮测定结果
所有大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜样品的总酚和总黄酮含量测定结果见表2。
蜂蜜样品之间总酚含量差异较大。云南大蜜蜂蜂蜜在49.97～144.32 mg GAE/100 g honey,平均值为(100.52±39.57)；海南大蜜蜂蜂蜜在31.63～58.27 mg GAE/100 g honey,平均值为(41.94±12.17)；广西大蜜蜂蜂蜜在47.74～113.31 mg GAE/100 g honey,平均值为(82.96±23.64)；云南黑大蜜蜂蜂蜜在35.20～87.17 mg GAE/100 g honey,平均值为(49.60±21.56)；西藏黑大蜜蜂蜂蜜在73.77～117.66 mg GAE/100 g honey,平均值为(88.23±20.00)。大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜的总酚含量要明显高于中蜂枇杷蜜和西蜂洋槐蜜。总体上,云南大蜜蜂蜂蜜总酚含量最高,其次是西藏黑大蜜蜂蜂蜜和广西大蜜蜂蜂蜜,最后是云南黑大蜜蜂蜂蜜和海南大蜜蜂蜂蜜。在相同测定方法下,马来西亚大蜜蜂蜂蜜的总酚含量约为35 mg/100 g[12],低于本研究中的大部分蜂蜜样品,与海南大蜜蜂蜂蜜样品总酚含量比较接近。与相同测定方法的国内已有研究比较,本研究中的中蜂蜜和西蜂蜜的总酚含量接近我国神农架林区的中蜂蜜(20.69～31.71 mg/100 g)[22],大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜大部分样品的总酚质量分数高于迪庆中蜂百花蜜(56.4～72.1 mg/100 g)[23],也高于我国常见的荆条蜜(30.32 mg/100 g)[24]和椴树蜜(12.23～35.06 mg/100 g)[25]。
表2 大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜的总酚和总黄酮含量
Table 2 Contents of total phenols and flavonoids of
A.dorsata honey and A.laboriosa honey
样品 编码总酚/[mg GAE·(100 g honey)-1]总黄酮/[mg RE·(100 g honey)-1] 云南大蜜蜂蜂蜜1DD1144.32±0.171.12±0.01云南大蜜蜂蜂蜜2DD2113.94±0.170.69±0.01云南大蜜蜂蜂蜜3DD393.86±4.380.67±0.01云南大蜜蜂蜂蜜4DD449.97±0.101.39±0.00海南大蜜蜂蜂蜜1QD158.27±0.093.23±0.01海南大蜜蜂蜂蜜2QD234.00±0.141.34±0.00海南大蜜蜂蜂蜜3QD334.10±0.031.00±0.01海南大蜜蜂蜂蜜4QD431.63±0.130.42±0.03海南大蜜蜂蜂蜜5QD551.68±0.221.35±0.03广西大蜜蜂蜂蜜1GD178.56±0.214.36±0.02广西大蜜蜂蜂蜜2GD247.74±0.080.57±0.02广西大蜜蜂蜂蜜3GD390.02±0.090.65±0.01广西大蜜蜂蜂蜜4GD4113.31±0.130.38±0.03广西大蜜蜂蜂蜜5GD585.18±0.081.02±0.01云南黑大蜜蜂蜂蜜1DH187.17±0.000.74±0.01云南黑大蜜蜂蜂蜜2DH248.25±0.140.70±0.02云南黑大蜜蜂蜂蜜3DH338.02±0.141.57±0.04云南黑大蜜蜂蜂蜜4DH439.35±0.160.64±0.01云南黑大蜜蜂蜂蜜5DH535.20±0.251.00±0.03西藏黑大蜜蜂蜂蜜1ZH178.23±1.071.85±0.02西藏黑大蜜蜂蜂蜜2ZH2117.66±0.071.98±0.02西藏黑大蜜蜂蜂蜜3ZH383.26±0.101.26±0.01西藏黑大蜜蜂蜂蜜4ZH473.77±0.201.11±0.02中蜂枇杷蜜1PP132.16±0.150.60±0.01西蜂洋槐蜜1YH122.30±0.111.12±0.00
总黄酮含量在不同蜂蜜样品之间差异也较大。云南大蜜蜂蜂蜜在0.67～1.39 mg RE/100 g honey,平均值为(0.97±0.35)；海南大蜜蜂蜂蜜在0.42～3.23 mg RE /100 g honey,平均值为(1.47±1.06)；广西大蜜蜂蜂蜜在0.38～4.36 mg RE/100 g honey,平均值为(1.40±1.67)；云南黑大蜜蜂蜂蜜在0.64～1.57 mg RE /100 g honey,平均值为(0.93±0.38)；西藏黑大蜜蜂蜂蜜在1.11～1.98 mg RE /100 g honey,平均值为(1.55±0.43)。总体上,西藏黑大蜜蜂蜂蜜总黄酮含量最高,其次是海南大蜜蜂蜂蜜、广西大蜜蜂蜂蜜,然后是西蜂洋槐蜜、云南大蜜蜂蜂蜜和云南黑大蜜蜂蜂蜜,最后是中蜂枇杷蜜。相同测定方法的国内已有研究显示,苕子蜜的总黄酮含量在0.842～2.295 mg/100 g[16],新疆黑蜂、中华蜜蜂、喀尔巴阡蜂所产的百花蜜总黄酮含量分别约为1.3、0.5、0.6 mg/100 g[26]。大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜样品的总黄酮含量与这些研究结果相当。
不同地区的大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜的总酚含量和总黄酮含量差异较大,可能与不同地区的蜜源植物种类差异有关,与已有研究一致[12]。
2.3 抗氧化能力测定结果
DPPH自由基清除能力测定得到的IC50值如图1所示,不同蜂蜜样品之间差异较大。IC50值越小,说明蜂蜜对自由基的清除能力越强。西藏黑大蜜蜂蜂蜜的IC50较小,平均为(13.66±3.22)mg/mL,显示出较强的抗氧化能力。大部分广西大蜜蜂蜂蜜的IC50也较小,抗氧化能力较强。云南的黑大蜜蜂蜂蜜的IC50普遍较大,平均为(152.96±60.15)mg/mL,抗氧化能力较弱。
图1 大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜清除DPPH自由基的IC50
Fig.1 IC50 of A.dorsata honey and A.laboriosa
honey against DPPH free radicals
注:样品编码对应表2
中蜂枇杷蜜和西蜂洋槐蜜的IC50分别为(128.48±13.33)和(245.65±24.17)mg/mL,抗氧化能力也较弱。
还原能力测定结果如图2所示,不同蜂蜜样品也显示出不同的还原能力。总体来看,还原能力测定结果与DPPH自由基清除能力测定结果一致,DPPH自由基清除能力较强的西藏黑大蜜蜂蜂蜜和广西大蜜蜂蜂蜜还原能力也较强；DPPH自由基清除能力较弱的中蜂枇杷蜜和西蜂洋槐蜜的还原能力也较弱。
图2 大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜的还原能力
Fig.2 Reducing power of A.dorsata honey
and A.laboriosa honey
综合分析蜂蜜样品中总酚和总黄酮含量与抗氧化能力,西藏黑大蜜蜂蜂蜜总黄酮含量最高,总酚含量也较高,抗氧化能力最强；广西大蜜蜂蜂蜜的总酚和总黄酮含量较高,抗氧化能力也较强；中蜂枇杷蜜和西蜂洋槐蜜的总酚含量较低,抗氧化能力较弱。抗氧化能力与总酚和总黄酮的含量有一定的相关性,与已有研究结果一致[7,16,22]。
3 结论
本研究测定我国主要分布区的大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜的理化指标、抗氧化物质(总黄酮、总酚)及抗氧化能力(DPPH清除能力、还原能力)。各样品水分含量达到蜂蜜行业标准二级蜂蜜要求,果糖和葡萄糖总含量、蔗糖含量基本都达到蜂蜜行业标准和蜂蜜国家标准要求,羟甲基糠醛含量很低,部分蜂蜜样品的淀粉酶值未达到行业标准要求。蜂蜜样品间总酚、总黄酮含量差异较大,抗氧化能力差异也较大,可能与不同地区的蜜源植物种类差异有关。我国大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜的总酚含量高于马来西亚大蜜蜂蜂蜜,也高于我国常见的一些中蜂蜜和西蜂蜜,值得深入研究开发。未来需要对不同地区大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜的植物来源进行分析,同时开展安全性指标检测。
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