贝类属软体动物门,全球现有贝类品种11万种以上,是动物界中仅次于节肢动物的第二大门类[1]。贝类分布广泛,根据生活环境的不同,可以分为海水贝类、淡水贝类和陆生贝类,又以海水贝类居多,约占海水养殖总产量的80%。目前,我国已经成为全球最大的海水贝类养殖国,2019年,我国贝类产量达1 500万t[2]。我国现有海水养殖贝类约30多种,达到规模化生产水平的贝类主要有牡蛎、蛤、扇贝、蛏和贻贝等。
丰富的贝类品种,巨大的生物资源量为开发贝类生物活性物质提供了良好的原料基础。贝类种属、习性及生存环境的差异导致了贝类多糖组成及结构的复杂性,促成了贝类多糖生物活性和功能特性的独特性和多样性[3]。贝类多糖具有抗菌、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、延缓衰老等生物活性,以及降血压、降血糖、降血脂、溶血栓、缓解动脉硬化、降低肝脏损伤等药理作用。这些功效决定了贝类多糖可以成为功能性食品、特膳食品和创新药物的良好来源,具有广阔的开发利用前景。
本文综述了贝类多糖的制备、分离纯化、结构解析、生物活性和功能特性的研究进展,总结归纳了制备方法、结构及活性三者间的关系,以期为贝类多糖的开发利用提供参考。
1 贝类多糖的制备
常用制备方法主要有水提法、碱提法、酶解法和盐提法及超声波辅助提取法等,如表1所示。提取方法不同,贝类多糖的组成、结构、活性及应用等也不尽相同。贝类多糖的含量、得率等受原料的属性、采收时间、组织部位、储藏方式及预处理方法等因素影响。雄性鲍鱼内脏中所含的还原糖较雌性高；不同养殖场中缢蛏游离总糖含量差别较大,最大含量差约为40%,且随季节变化程度大[4-5]。冷冻和冷藏均会降低贝类多糖提取率,冷藏影响更大,扇贝裙边及柱中多糖提取率存在差异[6]。原料的生熟则会影响紫贻贝肉多糖含量,熟贝肉较生贝肉制得的多糖提取率高[7]。
表1 贝类多糖提取方式的对比
Table 1 Different extraction methods of shellfish
polysaccharides
提取方法优点缺点水提取法温和、成本低效率低,所得多糖蛋白含量高中性盐提取法条件温和破坏多糖所含硫酸基团碱提取法提取率高降低所得多糖分子量酶解提取法高效,能有效去除与糖相连蛋白成本略高超声波辅助提取法有利于多糖溶出破坏多糖结构电场辅助提取法有利于多糖溶出破坏多糖结构过氧化氢提取法反应迅速所得多糖分子量低
1.1 水提取法
水提法即以水为溶剂进行提取,包括冷水、热水提取法,条件简单、温和,成本低,无试剂残留,但多糖提取率明显低于其他方法,且花费时间长,与多糖相连的多肽链不易去除,适用于多糖含量高的组织提取。ADANE等[8]采用125.01 ℃的亚临界水提取牡蛎冻干粉中多糖,得率为18.66%,较常温水提牡蛎脱脂粉多糖得率高出2.56%[9]。
1.2 中性盐提取法
中性盐提取即以氯化钠、醋酸钠、磷酸盐等为溶剂进行提取,该方法较温和,但会破坏多糖的硫酸基团,含硫酸基团的多糖生物活性较中性多糖强,因此中性盐提取法不适用于含硫酸基团的多糖的制备。陈骏洪[10]采用中性盐提取法提取缢蛏粉多糖,结果表明在80 ℃、料液比1∶90(g∶mL)、提取2 h时,多糖得率最高,为1.43%。
1.3 碱提取法
碱提法主要通过碱溶液(主要是NaOH、KOH等)破坏糖与蛋白间的酯键,促进多糖溶于溶液,但也会对多糖的糖苷键造成一定破坏。QIN等[11]重复了不同实验中水提、KOH提取及酶解制备牡蛎多糖的最优条件,最终确定KOH提取时上清液中多糖含量最高。研究发现,多糖在强碱作用下易水解,碱提法在提取多糖后一般需要透析数天以清除盐残留,若操作不当,多糖易被分解,可采用膜分离技术有效脱除小分子杂质。研究发现,二价阳离子(Ca2+、Mg2+)对硫酸多糖有聚集作用,比一价阳离子(Na+、K+)影响大。因此,碱提法应该选取具有低价键的阳离子以防止硫酸多糖变性[12]。
1.4 酶解法
酶解法主要利用蛋白酶切断蛋白肽键使得多糖溶出,不破坏多糖结构,提取效率高,能够有效去除与多糖相连的肽链,实现脱蛋白。目前应用于贝类多糖制备的蛋白酶主要有木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶等。不同酶切割位点各不相同,部分可能重合,因此,多种酶同时使用时要考虑其是否具有更高的效率。刘志昌[6]通过响应面优化实验发现加酶量仅为鲜重的0.3%时酶解率即达到最高值,其他条件为料液比1∶3(g∶mL),时间5 h,提取率为7.49%,水提法提取率最高为4.22%,酶解制备多糖较水提法得率高出0.77倍,且耗时短,酶解所需温度低于水提。YUAN等[13]采用酶解法和水提法提取缢蛏多糖,在可见光及紫外可见光成像中可以明显观察到酶解制得的多糖量更多,在最佳条件下提取率最高可达到17.72%。
1.5 超声波辅助提取法
研究表明,超声波对组织结构的破坏是无差别的,超声波辅助提取法能够有效促进组织分离,加速多糖溶出,同时也会对多糖内部结构造成破坏,一般作为辅助提取方法使用。超声波辅助提取法制备多糖的得率较单独水提或酶解高,孙萍萍等[14]利用响应面优化法优化缢蛏的制取,发现超声波辅助提取法能够提高水提和酶解法的多糖提取率,多出约1 mg/g。
1.6 其他
此外,多糖的制备还有其他方法,微波辅助提取法会破坏多糖结构；超临界流体萃取法成本较其他方法高,但效率高、试剂残留少；H2O2辅助提取法适用于寡糖的制备[15]。
采用酶解法制备贝类多糖得率大于碱提,水提、酸提法得率次之,多种方法叠加或多种酶复合进行提取得率普遍较单一方法高。多种方法制取河蚌多糖时,酶解制多糖得率最高,其次是碱提,水提多糖得率最低,电场辅助酶解能够使其得率提高约1%[16]。碱提法制得的紫贻贝多糖得率最高,其次是水提法,酸提法得率远远低于其他2种方法[17]。
2 贝类多糖的脱蛋白
多糖脱蛋白的常用方法有Sevage法、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)法、盐酸法、酶解法、葡萄糖酸-δ-内酯(glucono-delta-lactone,GDL)法。酶解法多用于脱除蛋白含量高的多糖中蛋白。
Sevage法作用条件温和,但去除与多糖相连蛋白的效果差,需要重复数次,试剂毒性大,不利于操作及试剂的脱除[18]。
TCA法脱蛋白效果好且多糖损失率较Sevage法低,但高浓度、长时间处理会破坏多糖结构,试剂难以及时脱除,在使用酸法脱蛋白时要综合考虑溶液与酸接触时间,较Sevage法更适用于贝类多糖脱蛋白[19]。
GDL法脱蛋白率高,无毒,经济,耗时长。刘瑀等[20]比较了TCA法与GDL法用于虾夷扇贝多糖脱蛋白的效果。结果表明,GDL法脱蛋白率达到了99.06%,较TCA法高10.41%,试剂用量少,更经济,但需要加热,TCA法脱蛋白试剂用量较前者用量高出3～20倍,无需加热。
双水相萃取法是利用2种互不相溶的溶质在特定浓度或温度下形成不互溶富水相,以实现分离。CHEONG等[21]采用双水相萃取法,以去除牡蛎多糖所含蛋白,该方法易操作、无毒、低成本,多糖与蛋白不能单独存在于某一相中,单一溶质最多能够提取67.02%的多糖,所得多糖分子量较低。
反复冻融法可以使含疏水基团的蛋白变性、沉降,多次冷冻有利于蛋白的脱除,多糖得率有所下降。XIONG等[22]实验发现冻融法的蛋白脱除率与糖得率均高于Sevage法,处理不宜超过10次。
双醛纤维素(DAC)通过与蛋白结合达到脱蛋白目的,磁性壳聚糖微球(MCM)、树脂能够吸附蛋白,其中DAC法效果优于Sevage法,吸附法绿色可回收[23-25]。
除Sevage法外,目前大部分方法可以在脱蛋白的同时脱色。
3 贝类多糖的结构
3.1 贝类多糖的结构解析方法及基本结构
贝类多糖的单糖组成、支链结构、特征基团、连接方式等存在显著差异,如表2所示。
表2 贝类多糖的结构解析
Table 2 Structural analysis of shellfish polysaccharides
来源结构鉴定扁玉螺(Neverita didyma)软体BYL-S只含Glc;BYL-J1中Glc∶Man∶GalN∶GlcN∶Gal=23∶1.5∶1∶2.7∶4.9;BYL-J2中Glc∶Man∶GalN∶GlcN∶Gal∶Fuc=10.1∶1∶1.6∶4.7∶2.9∶8.7;BYL-J3中Glc∶GlcUA∶GalN∶GlcN∶Gal=10.2∶1∶11∶12.4∶4.9;BYL-S2以α→(1→4)为主链,以少量β→(1→3,4)和β→(1→3)为支链,属于吡喃型葡聚糖[26]福寿螺(Ampullarum crossean)肉主要以α-吡喃糖苷键连接的葡聚糖[27]牡蛎(Ostrea gigas Thunberg)肉由葡萄糖一种单糖组成[28]牡蛎(Ostrea gigas Thunberg)肉CGPs是一种具有α-(1→4)结构的D-Glc,平均分子质量为108kDa[8]牡蛎(Ostrea gigas Thunberg)肉以→4)-α-D-Glc-(1→为主链,含有→3,4)-β-D-Glc-(1→和→2,4)-β-D-Glc-(1→的吡喃葡聚糖[9]牡蛎(Ostrea gigas Thunberg)软体OG1 主要Rha和8.71% Man组成,平均分子质量为1 660 kDa;OG2中含有98.23% Glc,主链单糖∶支链=6.5∶1,平均分子质量为2 270 kDa;OG3中Rha∶Gal∶Xyl∶Fuc=14∶5.5∶3∶1,平均分子质量为2 330 kDa[11]缢蛏(Sinonovacula constricta)软体LPS-I以α-吡喃葡聚糖为主链[10]虾夷扇贝(Potinopecten yessoensis)裙边、柱含有糖醛酸及α吡喃环[6]翡翠贻贝(Perna viridis)软体构型为α-吡喃糖,PVPS-2A单糖组成主要为Xyl(30.77%)、Man(11.40%)、Glc(34.63%)、Gal(16.94%),PVPS-2A单糖组成主要为Xyl(24.55%)、Man(14.44%)、Glc(33.52%)、Gal(20.84%)[29]贻贝(Mytilus coruscus)肉α-D-Glcp-(1→4)为主链,1→6键连接支链α-D-Glcp[30]紫贻贝(Mytilus edulis Linnaeus)肉HWS以(1→4)-α-D-Glcp为主链,少量的→2,4)-Glcp-(1→和→6)-β-Glc-(1→为分支的葡聚糖,主链单糖∶支链=6∶1[31]紫贻贝(Mytilus edulis Linnaeus)肉MT0-A1含有α-D-GalNAcp、β-D-GlcNAcp、α-D-Manp、α-D-Galp、α-L-Fucp等,其中主链部分主要由→2)Galp-(1→,→3)Manp-(1→,→3)Galp-(1→组成,侧链主要由Manp-(1→,Fucp-(1→组成[32]文蛤(Meretrix meretrix)肉MMPX-1以(1→4)-β-Gal、(1→4)-β-Glc、(1→4)-β-Man为主链,α-Glc及α构型末端Glc为支链,与主链Gal相连。MMPX-2以(1→4)-α-Glc为主链,支链为(1→3)-β-Glc和β构型末端Gal[33]文蛤(Meretrix meretrix)软体MMP-2和-3分别是葡甘露聚糖和半乳糖,平均分子质量为272和257 kDa,α(1→4)葡聚糖的分支甘露糖和半乳糖通过β(1→6)连接[34]河蚬(Corbicula fluminea)软体CFPS1以GlcN、Glc、Fuc为主,Man、GlcUA、GalN、Gal 7种单糖组成[35]河蚬(Corbicula fluminea)软体CFPS-1以α-D-Glcp、α-D-Manp为主链,比例8∶1,α-D-Glcp为支链连接于Manp;CFPS-2以α-D-Glcp、α-D-Glcp-NAc、β-D-GlcpNAc为主链,α-L-Fucp为支链[36]
结构决定性质,性质反映结构,开展贝类多糖结构的解析有利于探究其作用机理。贝类多糖主链中含有吡喃葡萄糖和甘露糖,其他单糖糖种类及含量不固定,主要含有葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、果糖,及多种糖胺、糖醛酸,支链结构多样,支链平均间隔6～7个主链单糖。LIU等[3]分析了5种贝类所含糖醛酸,结果表明甘露糖醛酸与其他3种非甘露糖醛酸具有组织及物种特异性,仅存在于部分贝类中,贝类所含糖醛酸种类与亲缘关系相关。曹九零[37]分析了20种海洋贝类多糖,结果表明其中性及硫酸多糖含量与种属间无显著关系。由于目前多糖研究涉及的贝类种类较少,结构解析尚缺乏种间、活性间的相关分析,也无法针对贝类多糖的结构与种间关系进行系统性分析。已有信息表明,淡水螺较海水螺单糖组成简单,双壳贝类较单壳贝类支链组成更为复杂。
3.2 影响贝类多糖结构的因素
冷水提和热水提较酶解获得的多糖单糖组成简单,高温、萃取剂、碱会破坏多糖结构降低其分子质量。酶解获得的紫贻贝多糖MT0-A1单糖组成较复杂,含有α-D-GalNAcp、β-D-GlcNAcp、α-D-Manp、α-D-Galp、α-L-Fucp等,其中主链部分主要由→2)Galp-(1→,→3)Manp-(1→,→3)Galp-(1→组成,侧链部分主要由Manp-(1→,Fucp-(1→组成,冷水提取的多糖LTS1-A在所有提取所得多糖中含糖量最高,高达79.4%,单糖组成最简单,仅主要由Glc单糖构成。另外一种冷水提多糖由多种单糖组成,但该多糖所占比例较小,热水提所得的多糖单糖组成较单一,主链主要是(1→4)-α-D-Glcp,主链单糖∶支链=6∶1,支链由不同键连接的葡聚糖构成[7]。因此,酶解法制得的多糖较水提法制得的多糖单糖组成更全面,结构更为完整,更具研究价值。
亚临界水提取牡蛎多糖(CGPs)的平均分子质量为108 kDa,低于热水萃取法,高于双水相萃取法,后两者所得多糖平均分子质量分别为6 500 kDa、3.48 kDa,其活性各有特点[7]。高蒙蒙[9]采用常温、热水、碱提取的牡蛎多糖其分子量、糖及蛋白含量各不相同,分子质量分别为2 100、2 000、980 kDa,其中碱提法制得多糖蛋白含量最高(47.7%)。在制备高纯度、结构完整的多糖时不建议采用双水相萃取法、碱提法。
4 贝类多糖的生物活性
4.1 贝类多糖的主要生物活性
由表3可知，贝类多糖普遍具有抗氧化、抗红细胞溶血的活性,部分具有抑菌、提高免疫细胞活性、抑制癌细胞生长的活性,对多种急慢性疾病具有显著疗效,能够抗疲劳、降三高、护肝、溶解血栓、延缓衰老,某些贝类多糖还具有抗流感病毒、HIV、HSV、HBsAg的能力。贝类多糖生物活性多样,无毒副作用,部分活性强的多糖可以药用,以减少机体损伤。
表3 贝类多糖的生物活性
Table 3 Biological activities of shellfish polysaccharides
主要功效来源活性抗氧化背角无齿蚌(Anodonta woodianawoodiana)·O-2、H2O2、·OH、DPPH自由基清除能力、还原能力[16]河蚬(Corbicula fluminea)ABTS阳离子、DPPH自由基清除能力,但效果低于VC[35]扁玉螺(Neverita didyma)DPPH清除能力、还原力、Fe2+螯合活性[26]缢蛏(Sinonovacula constricta)·O-2清除能力、抗氧化溶血、LPO清除能力[10]虾夷扇贝(Potinopecten yessoensis)裙边、柱DPPH、ABTS阳离子、·OH、·O-2、SO3清除能力、铁还原能力[6]增强免疫细胞活性牡蛎(Ostrea gigas thunberg)·OH、·O-2清除能力、抗肝组织脂质过氧化、增加小鼠脾淋巴细胞和碳廓清活力[28]扇贝(Pectinidae)性腺SGP具有DPPH自由基、·OH清除能力,可明显改善 tBOOH 致 RAW264.7 细胞的氧化损伤,显著提高脾淋巴细胞活性[39]福寿螺(Ampullarum crossean)·OH、·O-2清除能力、抗氧化溶血、增强小鼠巨噬细胞吞噬能力[27]文蛤(Meretrix meretrix)增加脾细胞增殖,增加淋巴细胞分泌作用[34]抑制癌细胞贻贝(Mytilus coruscus)MJPs-1能够显著促进小鼠T、B淋巴细胞增殖,MJPs-2能够促进小鼠T淋巴细胞增殖,抑制B淋巴细胞,两者均具有抑制Raji细胞增殖的活性[40]翡翠贻贝(Perna viridis)抑制Hela肿瘤细胞[41]泥螺(Bullacta exarata)BEP3的抗氧化活性强于BEP1和BEP2,BEP3对Bcap37乳腺癌细胞、SW1990胰腺癌细胞和HeLa宫颈癌细胞生长均有明显抑制作用,IC50分别为135.3、147.5和172.6 μg/mL,BEP1和BEP2对3种癌细胞的最高抑制率约为10%[42]褶纹冠蚌(Cristaria plicata)抑制EAC腹水瘤、S180肉瘤[43]西施舌(Coelomactra antiquata)提高体外培养细胞的抗氧化性,能够抑制人食管癌细胞EC-9706增殖[44]促进酶活贻贝(Mytilus coruscus)降低转氨酶水平,增加肝脏超氧化物歧化酶活性,减少肝脏损伤[30]抑菌皱纹盘鲍(Haliotis discus Hannai Ino)内脏强抗氧化能力,有效抑制Staphyloccocus aureus、Salmonella typhimurium、Escherichia coli、Pseudomonas aeruginosa[45]溶解血栓、抗疲劳鲍鱼(Abalone)性腺降低血乳酸水平,提高组织糖原及血红蛋白含量和乳酸脱氢酶活性,体外溶栓[46]降血脂翡翠贻贝(Perna viridis)提高酶活,降低胆固醇值,显著降血脂[47]降血糖鲍鱼(Abalone)抗氧化、提高酶活、降低血糖值、修复损伤细胞[48]牡蛎(Ostrea gigas Thunberg)体外抗氧化、降血糖、抗高血压[8]降血压长牡蛎(Crassostrea gigas)抗高血压作用,效果与captopril相当[49]治疗过敏性炎症牡蛎(Ostrea gigas Thunberg)减弱与食物过敏相关的肠胃炎症[50]降低基因毒性牡蛎(Ostrea gigas Thunberg)降低环磷酰胺诱导的小鼠基因毒性和肝损伤[51]护肝牡蛎(Ostrea gigas Thunberg)降低小鼠急慢性肝损伤[38]缓解动脉粥样硬化方形环梭螺(Bellamya quadrata)稳定动脉粥样硬化斑块[38]抗病毒圆田螺(Cipangopaludina chinensis)抗HBV活性[53]
研究表明,多糖具有保湿、美白、修复受损皮肤等功效,安全性高,特别是来源于动物的透明质酸(酸性黏多糖)保湿效果更佳,能够有效阻隔紫外线、细菌侵袭,并渗入皮肤细微改变皮肤状态。现有的多糖口服液多以植物原料为主,水产品中海参多糖口服液具有保健滋补功效,可知贝类多糖产品仍具有广阔应用前景。企鹅珍珠贝、马氏珠母贝多糖具有一定的保湿能力,但效果弱于牡蛎、翡翠贻贝多糖,可以用于以保湿为目的的化妆品原料,其他功能方面仍有待研究[29]。贝类多糖活性多样、来源广泛、效果显著,对其功能的深入研究将有利于化妆品、特膳食品、医药等的研发。
4.2 影响贝类多糖生物活性的因素
4.2.1 原料及制备方法
贝类的组织部位及制备方法等均会影响多糖种类及结构,进而影响其生物活性及稳定性。酶解制得的多糖结构更为完整,更有利于结构解析及活性的保持,酸性环境不利于贝类多糖维持其活性,高温会造成贝类多糖活性的损失。刘志昌[6]提取的扇贝裙边多糖与扇贝柱多糖相比,清除自由基、超氧阴离子、亚硫酸根能力及铁还原能力更高,酶解法较水提法制得的多糖活性高。程仕伟等[17]研究了采用不同方法制备的紫贻贝多糖的抗氧化活性,水提和碱提法制备的多糖·OH、超氧阴离子、亚硝酸根清除能力较酸提多糖强。此外,不同干燥方式也会影响贝类多糖的生物活性,如真空冷冻干燥处理,多糖的DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、·OH清除能力强于真空干燥处理多糖,两者自由基清除能力均强于热风干燥处理多糖[54]。
4.2.2 多糖分子质量及组成
研究表明,分子质量不同的贝类多糖生物活性存在差异,具有抗氧化活性的贝类多糖多以α-吡喃葡聚糖为主要成分,糖蛋白具有抗肿瘤的生物活性。YANG等[54]研究发现,褶纹冠蚌分子质量大于30 kDa的糖蛋白对小鼠S180肉瘤、EAC腹水瘤抑制效果明显且无毒害作用,小于30 kDa的多糖基本无抑制作用。ZHONG等[55]将低分子质量的牡蛎多糖LMW-OPS(主要成分为α-D-葡萄糖醛酸,分子质量为1 980～2 630 Da)注射到小鼠腹腔,能够抑制其体内的CMT93和CT26肿瘤细胞生长,但并不直接抑制2种细胞的增殖,而是通过缓解肿瘤细胞对骨髓源性树突细胞功能的抑制作用,激发树突状细胞活性,增强其免疫调节活性,进而起到抗肿瘤作用。SHI[38]等研究发现牡蛎多糖CGPS-1(分子质量约为6.50×106 Da的葡萄糖聚合物)能够降低AST、ALT、MDA含量,提高SOD活性,进而改善肝损伤。雷晓凌等[56]对酶解获得的糖胺聚糖SG1(含氮2.7%)进行体外抗HL260细胞实验,结果表明,不同剂量SG1对HL260细胞均有抑制作用,且抑制作用随着用量的增加而增强,脱蛋白的缢蛏多糖具有多种抗氧化活性,暂时还没有关于高纯度缢蛏多糖免疫及抗肿瘤活性的报道。
4.2.3 改性
为了获得目标生物活性或功能特性更强的多糖,研究人员开展了多糖的改性研究。目前,贝类多糖的改性主要以硫酸化为主,能够显著增强其免疫活性,赋予其抑制癌细胞增殖的活性。TAWUT等[57]将硫酸化的紫贻贝多糖SP作用于野生贻贝,探究其免疫应答效应,实验发现SP会增加贻贝血细胞活性,溶菌酶活性也有所提高。硫酸酯化后的青蛤多糖对人胃癌细胞增殖具有显著抑制作用[58]。硫酸酯化的牡蛎多糖CT-S2具有增强凝血效果的作用,并且对HCT-116、HL-60、A-549细胞也具有抑制作用[9]。牡蛎C6取代的硫酸化多糖SOG较C2和C3取代的SOG1刺激淋巴细胞增殖的效果更明显,因此,取代基团的位置也会影响改性多糖的活性[59]。
5 结语
本文综述了贝类多糖的制备、分离纯化方法、结构特征、生物活性和功能特性,分析了影响贝类多糖组成、结构及活性的内在和外在因素,探究了贝类多糖的构效关系,探讨了其在化妆品、保健品和医药领域的应用,期望能够为贝类多糖的深度利用提供基础信息。未来,不同种类的贝类多糖、结构、功能及机理研究还有待深入和拓展,期望本文能够为贝类多糖的深度开发利用提供参考。
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