随着经济的发展,生活水平的提升,人们对饮食的需求从“吃得饱”向“吃得好”转变,食品的营养健康越来越受人们重视,肉类作为人们日常饮食中蛋白质的主要来源之一,是现代人餐桌上必不可少的食物。然而,世界人口不断增加,加剧了肉类需求的增长。2018年8月之后,随着非洲猪瘟肆虐,猪肉供应量锐减,导致整体肉类价格急剧飙升,肉类生产成为人们关注的焦点之一。然而,传统畜牧业存在生产效率较低,生产中会产生大量的CO2、CH4以及NO2等废气,并存在占用大量土地以及水资源和能源的大量消耗等问题[1]。此外,养殖畜禽肉还存在抗生素、兽药残留超标,人畜共患病等公共安全卫生隐患[2]。肉类需求的增长、环境的极限承受能力以及公共安全卫生隐患等,为人造肉的产生发展创造了机会和条件[3]。人造肉相比传统畜牧肉具有高效节能、卫生安全、环境友好、动物减负等可持续性特点,受到了人们的广泛关注[4]。
人造肉根据其生产形式可分为两类,一类是以植物蛋白为基础的植物基肉,另一类是以细胞培养技术为基础的培养肉[5-6]。美国上市公司Beyond Meat以植物蛋白为原料生产植物基肉，一经上市就吸引了大量资本的投入,与肯德基合作推出的素食炸鸡首次上市仅5 h即售罄,可见消费者对人造肉有一定的需求和接受基础。然而,植物基肉在颜色、味道、口感以及营养成分等方面与传统肉还存在很大的差距。1932年WINSTON首次提出细胞培养肉的概念,但受到各方面限制,其发展速度缓慢[4]。2013年8月,荷兰马斯特里赫特大学的科学家在伦敦展示了第1个由实验室培养的牛肉汉堡[7],展示的汉堡不仅在颜色、外形与真的汉堡很相似,在味道上与真正的汉堡差异也很小,经过2年的发展,人造汉堡肉饼的成本已由32.5万美元降到了11美元左右,且随着技术的发展生产成本仍有大幅度降低空间,这增加了人们对培养肉商业化的信心[8]。细胞培养肉是通过提取可高效增殖的干细胞或组织,放入培养皿中增殖,进而分化成肌肉组织的原始纤维而形成的肉[9]。其在营养、口感和风味方面更接近真实肉制品,是未来人造肉的主要研究发展方向。然而,目前细胞培养肉的研究尚处于起步阶段,其在规模化商业化的道路上还有许多技术性难题需要解决。本文通过对细胞培养肉的研究现状、规模化与市场化面临的技术问题进行了阐述,并对其可能的解决策略和发展前景进行了探讨。
目前以细胞培养为基础的动物组织工程研究在生物学和医学方面得到了广泛应用,而细胞培养技术在规模化培养肉生产中的应用却鲜见报道,组织工程的研究为细胞培养肉大规模生产奠定基础,提供了可行性方案。在20世纪50年代白鼠的成纤细胞以及白鼠的肾脏细胞已经成功应用到医学的毒理学研究。直到2002年,科学家BENJAMINSON及其团队从金鱼细胞中培养出了可食用的肌肉蛋白,细胞培养肉才得以开展研究[10]。近年来美国和荷兰投入了大量资源开展相关研究,已经取得了突破性进展。美国南卡罗来纳医科大学的研究人员从火鸡中提取肌细胞,并将细胞培养于牛血清营养液中,得到了条型的火鸡肉[11],但由于缺乏脂肪及血液供应,培育出的火鸡肉口感较差。荷兰马斯特里赫特大学的POST教授利用成肌干细胞培养实现了人造牛肉汉堡在实验室层面上的生产[12]。2019年3月,日本著名的食品企业日清食品控股公司宣布与东京大学合作,通过人工培育牛肌肉细胞成功制成约1 cm3的肌肉组织[13]。南京农业大学周光宏教授团队使用猪肌肉干细胞培养20 d后,获得了中国第1块质量为5 g的细胞培养肉[14]。关于细胞培养肉的专利目前国内相对较少,主要细胞来源有禽类、鱼类、家畜类以及小鼠和人类的肌细胞。总体来说,关于细胞培养肉相关研究的报道还较少,且集中在细胞培养与诱导分化上[13]。目前的细胞培养主要是针对疾病治疗的医学研究以及动物育种,仅能在实验室进行少量的培养。
细胞培养肉的生产是离体细胞(种子细胞)在适宜的培养环境中(培养基),如温度、氧气、营养物质和生长因子,通过生长增殖形成多核肌管,肌管成熟后形成肌肉纤维,肌肉纤维进一步生长最终成为一种模仿肉的产品。细胞培养过程中的种子细胞选择、细胞增殖与分化、培养基种类、反应器和支架系统等关键点是限制其规模化培养的重要环节。
在细胞组织培养过程中,种子细胞的选择一直是研究的重点和难点之一[6]。理论上种子细胞的选择范围非常广泛,无论是猪、牛、羊等哺乳动物细胞,鸡、鸭、鹅、鱼、昆虫等非哺乳动物,还是其他任何可食用的动物细胞,只要具有可靠的健壮连续细胞系,都可以在规模反应器中培养动物肌肉或器官细胞生产肉类。然而如何获得大量均一种子细胞并进行持续高效稳定地增殖分化,并实现规模化生产仍然面临着严峻的挑战[15]。
目前,动物组织工程研究中主要使用2种种子细胞。一种是以原始组织或细胞株为原料,利用基因工程或化学物理方法诱导突变,筛选无限增殖细胞。持续增殖的细胞可以减少对新鲜组织样本的依赖,增加细胞增殖和分化的速率。该过程通常是通过表达病毒癌基因、端粒酶逆转录以及两者结合使用来实现,然而培养过程中的基因表达以及逆转录过程易发生识别错误,进而导致遗传和表型不稳定[16]。此外,通过基因工程对细胞进行无限增殖培养可能会造成染色体不稳定,比如在传代之后造成不可逆的关键基因或者性状的丢失。目前,虽然转基因植物产品正在逐步被大众所接受,但是转基因动物细胞培养仍存在未知的风险,其食用安全性也是限制其发展的重要因素。另一种来源是从组织中分离出干细胞,如胚胎干细胞、肌肉干细胞或间充质干细胞。从理论上讲,各种干细胞可以无限增殖,但是在增殖过程中细胞突变的积累往往会影响扩展能力,造成细胞衰老。目前科研工作者从细胞自身基因和外界刺激因素,寻找方法培育可以长期传代培养、无限分裂增殖的细胞系[15]。YANG等[17]以猪成肌细胞为试验材料,成功诱导成肌细胞分化为肌管。王红娜等[18]采用胶原蛋白酶I消化绵羊胎儿细胞分离成肌细胞,成功地获得了高纯度绵羊成肌细胞系。陈凯凯等[19]利用I型胶原酶消化鸡胚胸肌,成功分离培养了肉鸡成肌细胞。周学亮等[20]诱导重编程三黄鸡体细胞,优化了诱导多功能干细胞的培养条件,使体细胞保持良好的生长状态。但诱导多功能干细胞目前仍处于起步阶段,存在诱导成功率低,诱导细胞纯度低以及基因漂移等问题。
细胞增殖的目的是使种子细胞获得最大的细胞数量,即最大限度地增加细胞的增殖倍数。细胞培养肉的生产需要细胞大量高效的增殖才能获得足够多的产品。为保证肉类生产的安全性和高效性,在细胞培养生过程中,需要严格控制成千上万的变量,这些变量会直接影响到种子细胞的增殖。目前最大的挑战是定义每一个变量的水平,例如营养液的成分比例、生理生化条件等,以及各变量之间的相互作用[21]。这些变量以及变量之间的相互影响主要是通过反复实验获得,随着研究的进行,生产细胞培养肉的系统方法逐步建立完善。
研究已经证实,通过体外补充营养液,可以维持细胞正常的生长繁殖以及有限次数的增殖,然而要维持细胞多次的传代分裂仍然面临着巨大挑战。不同的种子细胞的体外增殖能力不同,利用理化刺激、基因突变、病毒感染等外界刺激促使细胞体外无限增殖的不衰老细胞株建立永生化细胞系[22]。通过诱导多能干细胞,可以诱导体细胞的重编程而获得可不断自我更新且具有多向分化潜能的细胞,从而实现类似于胚胎干细胞的无限增殖[23]。大多数成体干细胞分裂能力是有限的,生理条件下的细胞增殖极限(海弗里克极限)是50～60次,但实际上体外培养的细胞远远达不到这个分裂潜能[6]。突破细胞增殖限制是增强细胞持续增殖的有效途径。
细胞培养肉不仅需要大量的细胞数量,还需要大量分化的肌肉细胞来形成组织。为了更好的模拟真实肉类的结构,HOCQUETTE等[22]通过肌肉细胞和脂肪细胞共同培养发现：通过调节细胞生长环境调控脂肪细胞的含量,可以控制肉类的纹理。因此,通过精确调整培养条件,引导细胞的分化方向,可实现不同蛋白含量细胞培养肉的定制生产。但细胞分化受多种因素影响,不同种类来源的细胞分化条件不同,引导细胞分化的条件因素仍需探索,以便掌握精确控制细胞分化的方向和节点。
选择合适的培养基是细胞培养肉面临的另一挑战。细胞培养肉对培养基有3个基本要求:首先,培养基能够维持和促进细胞的正常生长；其次,培养基材料应安全可食用,符合食品安全要求;此外,培养基能够规模生产、大量供应且成本低。体外培养的细胞通常采用的是合成培养基,合成培养基常需要添加一些生物提取液才能维持细胞的正常生长分裂。小牛血清因其来源丰富易保存而成为常用的合成培养基添加物,其成分主要包括生长因子、黏附因子、结合蛋白、维生素、矿物质、激素以及部分未知成分等真核细胞生长所必需的物质。然而,由于血清来源于动物体内,依然是病原体的潜在载体,且采集过程中存在杂质污染风险,不同批次质量差异较大等风险,影响细胞生长,采集血清还可能引起伦理等问题。因此,标准化的培养基和完全不含动物源性成分的无血清培养基研究和应用日益受到重视[8,24]。
无血清培养基是成分完全明确的血清替代品,相比血清培养基,无血清培养基具有质量稳定可控、可调,安全性高,有利于细胞分化纯化等特点[25]。随着研究的深入以及无血清培养基配方的调整,目前无血清培养基在细胞生长速率、细胞密度以及转化率都不亚于血清培养基[26-27],并且通过改变无血清培养基组分可定向改变细胞增殖分化方向[28]。鉴于上述种种优势,随着技术的逐步成熟,无血清培养基可替代一部分血清培养基。但是无血清培养基并不是完美的,每类型的细胞需要一种培养基配方,培养基对细胞系有一定的选择性,因血清中可能有保护、解毒杀菌的蛋白,在无血清的环境下对无菌要求更高。根据目前的实验,虽然无血清可以培养细胞正常增殖生长,但存在细胞生长缓慢,传代次数减少的现象。因此,无血清培养技术仍然存在适应性窄、易受理化因素影响、难保存等不足之处,需要进一步研究攻克这些难题,随着生物学、生物材料科学以及微生物学的快速发展,无血清培养技术将逐步完善,推动细胞培养肉研究进展。
反应器是根据细胞的生长特性,利用酶或生物体所具有的生物功能,模仿天然组织结构的生长环境,实现体外细胞规模化培养的关键设备[28-29]。因动物细胞培养大多具有贴壁生长的特性,只有足够大的表面积才能生产大量的细胞,因此,细胞培养肉的生产常需要中大型生物反应器进行大规模分化增殖培养。当然小型的反应器也具备中大型反应器所不具备的优势：如多个小单元反应器具有更大的灵活性,能够应对市场需求的波动；此外,当反应体系出现污染时,能及时阻断污染扩散,更容易控制损失,小型反应器也是细胞培养器的首选[6]。进行体外细胞培养时除了考虑反应器的大小,还应考虑反应器的传热、传质效率。良好的反应器不仅具有较高的传质传热效率,还应在保持培养液低剪切力的前提下,保证大体积灌注的均匀性[30-31]。体外细胞培养不仅对反应器本身设计要求高,对反应器控制系统要求也极其严格。目前,反应器控制系统技术主要受限于微机电技术以及微流控技术的发展,模拟真实的体内生长环境仍有距离。大规模细胞培养仍未出现,这可能是反应器技术受限以及细胞培养肉规模扩大产生的效应问题。
支架系统作为反应器的重要组成部分,灌注在培养基中,为胚胎成肌细胞或骨骼肌卫星细胞增殖分化提供必要的附着体和载体[32]。为了优化肌肉细胞和组织形态结构,不同支架系统在形状、组织和特征上各不相同。支架系统根据其材料可食用性分为可食用和不可食用支架。可食用的材料一般是采用一些天然材料,因为其可食用性培养后无需拆除。不可食用的材料可以是一些具有特殊功能特性的新生物材料,如促进细胞的增殖分化、蛋白合成、骨骼肌收缩等,但其培养后需要与培养肉进行分离[33]。理想的支架系统应有一个大的生长和附着表面积,为细胞提供足够的生长空间。由于成肌细胞具有自发收缩的特性,因此,支架材料应有一定的收缩特性,能够灵活地适应肌肉收缩运动,最大限度的使培养基扩散,并且不可食用材料应易于从培养肉中分离[30]。细胞培养技术要求支架可以模拟体内环境,成肌细胞增殖分化才能达到最佳状态[31]。所以,支架系统的研究方向是开发出可食用(或者不可食用但易于剥离的)、具有柔性、可机械拉伸且可被细胞附着的材料。
目前,适用于构建网络分支的支架系统的可食用材料较少。MACQUEEN等[34]在交联明胶纤维支架上成功培养了牛主动脉平滑肌细胞和兔骨骼肌成肌细胞。交联明胶纤维是动物源性的可食用材料,与其他常用材料如聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸等相比具有明显优势,但是目前的实验室产品肌肉纤维含量偏低,成熟度有待提升,对体外细胞培养肉来说肌肉纤维和脂肪细胞合理搭配仍然存在巨大挑战。不可食用的支架系统主要技术挑战是支架与培养肉的分离,培养细胞片通常以机械或酶法进行分离,但这2种方法通常会损害细胞和细胞外基质。DA SILVA等[35]设计出一种热响应涂层,该涂层在较低的温度下会从疏水性变为亲水性,并在冷却后释放完整的培养细胞和细胞外基质薄片,为堆叠法生产培养肉带来了希望。然而,该技术目前仍然只能培养出简单的细胞薄片,制造具有类似组织形状的复杂几何结构的细胞片仍然面临巨大挑战。
此外,支架系统还应该具有较好的传质特性。为了加快营养介质的交换,可以加快营养介质流速和扩大支架材料孔径,但随着流速的提升,剪切应力也显著增大,剪切应力的增大将影响细胞、组织以及机体的正常生理状态,因此需要控制适宜的流速维持细胞的正常增长[36]。受限于细胞的大小,支架材料孔径大小提升同样受到限制。为了更好地提供传质性,LEVEBBERG等[37]将成肌细胞,胚胎成纤细胞和内皮细胞在可降解支架上共培养,成功地在骨骼肌组织构造形成内皮血管网络,使正在生长的组织血管化。但在培养过程中需要使用化学或生长因子等诱导剂,存在致畸致癌风险以及病毒引入等不利食品安全的因素,因此安全高性仍有待提升。目前支架系统技术仍在起步阶段,大规模细胞培养的支架系统仍受很多技术限制,大规模商用仍然需要新生物材料的研发。
目前大规模细胞培养肉商业化障碍不仅仅局限于技术方面,消费者的接受程度也一定程度上影响了其商业化进程。现阶段人们对培养肉接受程度偏低[38],主要原因是当前的细胞培养肉产品无法以安全经济高效的方式模拟真实肉的品质。细胞培养肉不仅在营养上应不低于畜牧肉的营养成分,且在结构、香气、味道及结构上与畜牧肉相似,符合大众口味,确保产品具有安全性。
肉类的香味一直备受人们的喜爱和追捧,刺激人们的嗅觉和味觉。满足味觉的同时,香味物质还能满足营养物质的需求。通过对比肉类生熟之间化学组分发现,肉类的香味物质主要是在加工熟制过程中氨基酸与糖类发生美拉德反应生成的含氧、含硫和含氮杂环化合物以及部分小分子量的醛、酮、醇、脂[39]。肉类的特殊香味是肉中的蛋白质、脂质和香味物质相互作用的结果。细胞纯培养由于无脂肪以及血液供应,培育产品口感差,由于缺乏脂肪的风味物质,导致产品香味不足,随着细胞培养研究进展,肌细胞与脂肪细胞共培养有望解决口感香味不足的问题[40]。
此外,细胞培养肉的结构形状是影响消费者接受程度的重要因素之一。目前,实验室产生的细胞培养肉比较松散,无组织结构,无法产生肉的咀嚼感,消费者认为细胞培养肉更适合用于肉泥类产品加工,如香肠、丸类的加工[41]。近年来,食品3D打印技术的发展为培养肉建立合理的立体结构提供了新的解决方案。目前,最新的3D打印技术可以制造人造血管、局部控制打印材料的颗粒性和韧性,可以更好地模拟真肉的三维结构[42]。此外,还可以采用3D打印技术将培养肉进行重构,打印出在结构上更接近畜牧肉细微结构及形态的产品,可增加培养肉的可接受程度。
随着经济的快速发展,人口的不断增长,全球对肉类需求日益增长,日益紧缺的资源和环境限制使饲养畜禽肉面临巨大的挑战。未来的肉类行业将会更加多元化复杂化,在肉类替代品中,细胞培养肉被认为是较有前途的选择。目前国内外学者对细胞培养肉进行了大量的研究,然而其规模化和商品化仍面临很多技术挑战,细胞培养过程中种子细胞选择、细胞增殖与分化、培养基种类、反应器和支架系统等关键技术仍存在一些技术难点需要攻克。细胞培养肉的色、香、味及结构是其商品化道路仍需要改善的主要因素。随着组织工程学、生物医学等学科的发展,新细胞系的研究将为细胞培养技术提供更多的技术支持。新的生物技术,如基因工程技术、生物光子技术、纳米技术、3D打印技术、离心浇铸技术、磁力驱动生物技术以及静电纺丝等技术的发展,为细胞培养肉产业化提供新的动力。作为一种无屠宰和可持续发展的技术,细胞培养肉最终可能与传统肉类进行竞争,以缓解人们对肉类需求的压力。
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