玉米蛋白粉是玉米湿法生产淀粉的副产物，蛋白质含量丰富，超过60%，主要为醇溶蛋白(65%～68%)和谷蛋白(22%～23%)，还含有少量球蛋白(1.2%)和白蛋白[1-3]，由于疏水性氨基酸含量较高，水溶性较差，限制了其在食品行业的应用[4]，采用蛋白酶对玉米蛋白进行水解，将大分子蛋白切割成小分子肽，增加了其溶解性，且小分子肽与蛋白相比具有了抗疲劳、抗氧化、促进乙醇代谢和降血压等活性功能[5]。
中式香肠，也叫腊肠，是中国传统的腌肉制品，因为其独特的味道和口感深受广大人民的喜爱。由于采用肥瘦质量比为3∶7～2∶8的猪肉为原料制作香肠，导致其脂肪含量较高，因此在运输和贮藏过程中易发生脂质过氧化等问题。工业上常常使用人工合成的抗氧化剂丁基羟基茴香醚(butyl hydroxyanisole，BHA)和二丁基羟基甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT)等防止香肠氧化变质，但人工合成的抗氧化剂对人体有着不同程度的毒害作用，近年来已经逐渐被限制甚至禁止使用。因此寻找天然、高效且无毒害的抗氧化剂是目前亟待解决的问题。目前的研究表明，玉米蛋白水解物具有良好的抗氧化能力，但是其在实际食品体系中的应用研究却不多。石丽梅[6]通过考察在不同贮藏温度下玉米蛋白水解物对香肠氧化稳定性和质构的影响，发现玉米蛋白水解物对香肠中脂质氧化有着良好的抑制作用，但对于香肠的质构并没有显著影响。刁静静等[7]等研究了相同添加量下的豌豆蛋白肽、玉米肽、乳清蛋白肽、麦胚蛋白肽和骨蛋白肽对香肠抗氧化能力的影响，结果表明，玉米蛋白肽的抗氧化能力最强，但对于香肠护色和质构并没有提升。WANG等[8]发现，将玉米醇溶蛋白与壳寡糖用谷氨酰胺转氨酶交联后，其糖基化产物具有良好的体外抗氧化活性，并证实了糖基化玉米醇溶蛋白能够很大程度地抑制脂质氧化并延长肉制品的保质期。以上结果表明，在香肠中添加玉米蛋白水解物能够显著提高香肠的抗脂质氧化能力，但对玉米谷蛋白水解物(corn gluten hydrolysate, CGH)能否抑制脂质过氧化的研究还未见报道。
本文以玉米谷蛋白为原料，用碱性蛋白酶进行水解，制备CGH，探究了CGH的体外抗氧化活性，并将其应用于香肠中，分析不同添加量的CGH对香肠防腐的作用，还研究了其作为食品添加剂对于香肠物性和护色方面的影响。
玉米蛋白粉，黑龙江龙凤玉米开发有限公司；α-淀粉酶，北京奥博星生物技术责任有限公司；碱性蛋白酶，丹麦诺维信公司；猪肉、肠衣，齐齐哈尔市售；其他化学试剂均为实验室常规分析纯试剂。
PC/PLC-LD-53冷冻干燥机，美国MILLRCK 公司；TCL-16G型台式离心机，上海安亭科学仪器厂；CT15R型高速冷冻离心机，天美科学仪器有限公司；DF-1型集热式磁力加热搅拌器，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；PB-10 pH-计，赛多利斯科学仪器有限公司；TV-7L灌肠机，济南惠峰机械设备有限公司；CR-10 Plus小型色差计，深圳市茂迪机电设备有限公司；TU-1810紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。
将玉米蛋白粉的含水量调至16 %，放置12 h后进行膨化。膨化机工作参数设为160 ℃，压力1.0 MPa。将膨化后的玉米蛋白粉干燥、粉碎、过100目筛，待用。
将膨化后的玉米蛋白粉配成100 mg/mL的悬浮液(液体为PBS缓冲液，浓度为0.02 mol/L, pH 6.5)，称取α-淀粉酶(3 700 U/g)置于悬浮液中。将悬浮液置于水浴振荡器中反应2 h，温度为60 ℃。取出悬浮液于1 800×g离心15 min。弃去上清液，用等量蒸馏水洗涤滤饼3次。将洗涤后的滤饼分散于无水乙醇中，料液比为1∶10(g∶mL)，室温下抽提45 min后于1 800×g离心15 min，滤饼置于硫酸纸上晾干，粉碎，过80目筛，待用。
将去除色素淀粉的玉米蛋白粉用70%(体积分数)乙醇60 ℃萃取2 h，料液比为1∶10(g∶mL)，取出悬浮液于1 800×g离心15 min，重复2次。将沉淀置于硫酸纸上晾干，粉碎，过80目筛，待用。
用碱溶酸沉法提取谷蛋白。用0.1 mol/L NaOH溶液提取，料液比为1∶10(g∶mL)，60 ℃水浴振荡2 h，取出悬浮液于1 800×g离心15 min。上清液用4 mol/L HCl溶液调pH至4.8，得到悬浮液于1 800×g离心15 min，沉淀分别用70%乙醇水溶液洗涤3次，蒸馏水洗涤2次，所得滤饼冻干。
1.5.1 玉米谷蛋白的酶解
参考课题组前期优化的水解条件，将玉米谷蛋白加入到pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中，底物浓度为50 g/L，按加酶量10 g/L加入碱性蛋白酶(2.1×105U/g)，60 ℃条件下水浴振荡150 min。向反应体系中滴加1 mol/L NaOH溶液维持pH恒定，反应结束后在沸水中灭酶10 min，4 500×g离心15 min后，将得到的酶解液冻干。
1.5.1 蛋白含量的测定
采用杜马斯燃烧法测定粗蛋白含量，用福林酚法测定可溶性蛋白含量[11]。
采用pH-stat法[12]。
制作流程为：
新鲜猪肉(肥瘦质量比为1∶4)→清洗→去筋腱→绞碎→腌制→灌装→风干成熟(15 d)→成品→贮藏
香肠配方：盐0.016，味精0.012，糖0.034，干肠料(市售)0.013，腐乳汁(市售)0.03，以上添加量均为1 kg肉的添加量。CGH添加量为总肉质量的0.25%、0.5%和0.75%(质量分数，下同)，空白组不添加CGH，阳性对照组添加0.01%(质量分数，下同)BHA。
参照李冠龙等[13]的方法测定CGH的DPPH自由基清除率、羟自由基清除率以及Fe2+螯合能力。
1.9.1 香肠pH值的测定
参照王洋等[14]的方法，有改动。称取5 g样品，加入50 mL蒸馏水，在5 400×g条件下均质1 min，静置2 min，用pH计测定样品pH值。
1.9.2 香肠TBARs的测定
参照SINNHUBER等[15]的方法，略有改动。取2 g样品，加入3 mL 10 mg/mL硫代巴比妥酸溶液，加入17 mL三氯乙酸-盐酸溶液(2.5 g三氯乙酸和0.6 mL 0.6 mol/L的HCl溶液用去离子水稀释到100 mL)，混匀，沸水浴30 min，冷却至室温，取上述溶液，加入4 mL氯仿，在1 800×g条件下离心5 min，在532 nm下测定吸光值。TBARs计算如公式(1)所示：
(1)
式中：A532，试样在532 nm处的吸光值；MS，试样的质量，g；9.48为常数。
1.9.3 香肠酸价的测定
参考李亚蕾等[16]的方法。
用质构仪测定香肠的嫩度、弹性和咀嚼性，探头型号为P/36R，采用全质析分析法对香肠进行连续2次的压缩，测定条件如下：压缩形变系数为50%，压缩速率为1 mm/s，2次压缩时间间隔为2 s。用色差仪测定香肠色差。
参照POHLMAN等[17]的方法，有改动。试验周期为15 d，评价人数为10人(5男5女)。分别对香肠的色泽、风味、口感以及组织状态进行评价。感官评价评分标准如表1所示。
表1 感官评价评分标准
Table 1 Sensory evaluation scoring criteria
项目1级(12～15分)2级(7～11分)3级(<7分)色泽 肉色呈鲜艳的瑰红色,表面有光泽肉色不鲜艳,呈淡粉色,表面略有光泽肉色发暗,呈褐色,表面无光泽风味 咸淡适中,风味纯正,香味浓郁稍咸或稍淡,风味有些许不协调,香味适中过咸或过淡,风味不协调,香味较少口感 口感细腻,鲜香可口,咀嚼性很好,弹性良好口感较细腻,咀嚼性一般,弹性较好口感粗糙,咀嚼性差,弹性差组织状态组织紧密,结构完整,纹理鲜明组织较紧密,结构较完整,纹理较明显组织松散,结构不完整,无明显纹理
预处理前后玉米蛋白粉蛋白含量变化情况如表2所示。用碱性蛋白酶水解玉米谷蛋白，所得水解液的水解度、粗蛋白含量及可溶性蛋白含量如表3所示。
表2 预处理前后玉米蛋白粉的蛋白含量
Table 2 Protein content of corn gluten meal
before and after pretreatment
指标预处理前预处理后蛋白含量/%62.3578.56
表3 玉米谷蛋白水解物的水解度、粗蛋白含量
及可溶性蛋白含量
Table 3 Hydrolysis degree, crude protein content and
soluble protein content of corn gluten hydrolysate
水解度/%粗蛋白含量/%可溶性蛋白含量/(mg·mL-1)1980±1.1222.4±1.33
由表2、表3可知，玉米谷蛋白的水解度、粗蛋白含量和可溶性蛋白含量分别为19%、80%和22.4 mg/mL。玉米蛋白粉经过挤压膨化、去淀粉和去色素处理之后，蛋白含量有所增加，是因为在挤压膨化过程中改变了玉米蛋白粉的空间结构，α-淀粉酶能够更好地水解玉米蛋白粉中的淀粉，使淀粉去除的更彻底，同时，色素的去除也能增加其蛋白含量。
将CGH配制成质量浓度为0.5、1、2、4 mg/mL的溶液(均以蛋白计)，分别测定DPPH自由基、羟自由基的清除能力以及Fe2+螯合能力，结果如图1所示。由图1可知，CGH具有良好的DPPH自由基清除能力，在0.5～2 mg/mL内，其清除能力与浓度成正相关，随着质量浓度增加，清除率趋于稳定，说明CGH的DPPH自由基清除能力在一定质量浓度范围内具有量效关系，在质量浓度为2 mg/mL时，其DPPH清除率最高，为52.62%。DPPH法在1958年被提出[18]，它是一种人工合成的自由基，其中心氮原子上有不成对的电子，CGH中含有大量带负电荷的氨基酸，这些氨基酸能够提供电子给DPPH自由基，形成稳定的DPPH自由基分子，从而清除DPPH自由基。
羟自由基是人体内最活泼的氧自由基，具有很强的氧化能力，能从人体内绝大多数分子上抢夺电子，使自身趋于稳定，危害机体健康。因此，清除机体内的羟基自由基对于人体健康有重大意义。由图1可以看出，CGH对羟自由基清除能力良好，并且在0.5～4 mg/mL 范围内呈线性相关，这也与王晓杰等[19]报道的结果一致。在CGH质量浓度为4 mg/mL时，其羟基自由基清除率为77.33%。CGH具有良好的羟基自由基清除能力:一是因为羟基自由基作为电子受体，能够从CGH上得到电子，形成稳定结构，进而阻止自由基的链式反应，减少羟基自由基的产生；二是CGH能够与Fe2+结合，减少Fe2+与H2O2反应，从而抑制羟基自由基的产生[20]。
由图1可以看出，CGH在低质量浓度时就具有良好的Fe2+螯合能力，在0.5～2 mg/mL内有量效关系，与DPPH自由基清除能力趋势一致，在质量浓度为2 mg/mL时，Fe2+螯合率为93.96%，Fe2+螯合率高是因为CGH含有多种芳香族氨基酸，芳香族氨基酸的环状结构能够促进CGH与金属离子螯合[21]。这种较强的Fe2+螯合能力可以有效抑制Fenton反应和Harber-Weiss反应，从而直接或者间接减少了羟基自由基的产生，为其发挥抗氧化活性提供了良好的基础。
肽的抗氧化活性与其氨基酸组成有重要联系。SUETSUNA等[22]的研究表明，疏水性氨基酸能增强抗氧化肽与脂质中自由基的相互作用，相同的疏水性氨基酸和2个以上疏水性氨基酸排列在一起可以增加肽段的抗氧化活性。CHEN等[23]和GEIGERT等[24]认为疏水性氨基酸和His、Pro、Met、Cys、Tyr、Try、Phe中一个或几个残基的存在能增强肽段的抗氧化能力，CGH富含大量疏水性氨基酸且紧密相连，不能发挥其功能活性，经过碱性蛋白酶水解后，肽键断裂，疏水性氨基酸暴露，肽链内部氨基酸之间的短程相互作用加强，强化了氨基酸作为质子供体的能力，提高了与自由基的结合能力，阻止了自由基的链式反应，从而发挥其抗氧化功能。
图1 CGH的抗氧化活性
Fig.1 Antioxidant activity of CGH
pH值是衡量肉制品品质好坏的一个重要指标，正常情况下，在香肠的贮存过程中，微生物会分解蛋白质产生碱性物质，这些物质会使肉的浸出液趋于碱性，导致pH值升高[25]。CGH对香肠pH值的影响如图2所示。空白组香肠的pH值呈现上升的趋势。在整个贮存期内，添加0.25%CGH组的pH基本保持不变，CGH添加量为0.5%和0.75% 组的pH值出现小幅下降，分别下降了7.8%和7.0%，而添加0.01%BHA组的pH值下降了9.1%。产生这种效果有两个方面的原因：(1)CGH在香肠中起到抗氧化剂的作用，延缓了香肠的腐败，使其pH值上升趋势减慢。(2)可能是CGH中含有一些具有抗菌功能的肽，能够抑制微生物生长，从而延缓香肠pH上升。
图2 CGH对香肠pH值的影响
Fig.2 Effect of CGH on pH of the sausage
CGH对香肠TBARs值的影响图3所示。TBARs反映的是脂肪氧化后期产物丙二醛的含量，通常用来评价脂肪次级氧化程度[19,26]。
图3 CGH对香肠TBARs值的影响
Fig.3 Effect of CGH on TBARs of the sausage
由图3可知，随着时间的延长，各组香肠的TBARs值均逐渐升高，其中空白组的TBARs值在第9天后上升较快，是因为空白组没有添加抗氧化剂，香肠中脂肪氧化后期产物大量积累，到第15天时，TBARs值是原来的1.79倍；添加量为0.25%CGH组的TBARs值在第12天后上升较快，可能是因为香肠中的CGH添加量太少，在贮藏后期已经被消耗殆尽，导致香肠中丙二醛含量急剧增加；添加量为0.25%、0.5%和0.75% CGH组的TBARs值分别是初期的0.78、0.30和0.63倍，添加0.01%BHA组的TBARs值是初期的0.53倍，均显著低于空白组，说明CGH可以有效地延缓或者抵抗香肠的脂质氧化，但并没有量效关系；其中添加量为0.5%CGH组的抗氧化效果优于添加0.01% BHA组。玉米谷蛋白经碱性蛋白酶水解后，疏水性氨基酸暴露，这些疏水性氨基酸能够增加CGH在脂质中的溶解度，防止脂质过氧化和细胞损伤，还能提高CGH与亲脂性自由基的结合力，从而增强自由基的清除作用，这也与FREITAS等[27]和ZHANG等[28]的报道结果一致。
酸价是脂肪中游离脂肪酸的标志，肉制品中游离脂肪酸通常来源于脂肪水解及脂肪氧化，游离脂肪酸越多越高，其酸价就会越高[29]。CGH对香肠酸价的影响如图4所示。
图4 CGH对香肠酸价的影响
Fig.4 Effect of CGH on the Sausage acid value
由图4可知，随着时间的延长，各组香肠的酸价都呈现着先逐渐上升而后趋于平缓趋势，在前9 d，空白对照组的酸价上升最快，可能是由于前期香肠中脂肪含量较高，微生物利用脂肪进行生长代谢，分泌脂肪酶水解脂肪，产生大量游离脂肪酸及氢过氧化物，进而发生次级氧化反应，产生大量丙二醛，与图3 的结果一致，这也与WONGWICHINA等[30]的研究相符。在相同贮藏时间时，实验组香肠的酸价均低于空白组，说明CGH 能够有效抑制香肠中脂肪的氧化，从而减少游离脂肪酸的产生。香肠中含有的金属离子(Fe2+、Cu2+等)对脂肪氧化有促进作用，而CGH 有着良好的Fe2+螯合能力，能够与香肠中的Fe2+结合，降低香肠中脂肪的氧化速率，从图4还能看出，随着CGH 添加量的增加，香肠的酸价也越低，且在添加量为0.75%时与0.01%BHA组的效果相当甚至更好，表明CGH的添加量与香肠中游离脂肪酸产生的抑制程度呈正相关。
香肠的物性包括硬度、弹性和咀嚼性等，这些指标能够直接影响香肠的品质和消费者的购买欲望。CGH添加对香肠物性的影响如表4～表6所示。
表4 CGH对香肠硬度的影响 单位：N
Table 4 Effect of CGH on the sausage hardness
时间/d空白0.01%BHA0.25%CGH0.5%CGH0.75%CGH08.50±0.058.52±0.358.50±0.168.50±0.388.49±0.19315.87±0.2815.64±1.6514.00±0.6612.13±2.369.12±0.36631.63±1.1230.15±2.0327.33±0.7125.24±1.9920.37±1.01937.08±1.0635.36±0.9833.34±1.0930.20±1.6825.97±1.761244.60±0.6544.05±1.2640.23±0.9637.65±2.5633.45±0.991550.16±0.3349.86±0.6746.24±0.8540.01±1.3935.07±0.89
表5 CGH对香肠弹性的影响 单位：mm
Table 5 Effect of CGH on the sausage elasticity
时间/d空白0.01%BHA0.25%CGH0.5%CGH0.75%CGH01.19±0.261.19±0.131.20±0.371.23±0.121.25±0.2231.28±0.061.30±0.081.41±0.111.56±0.081.70±0.1661.46±0.091.53±0.161.73±0.161.93±0.062.44±0.2391.56±0.141.66±0.272.01±0.132.19±0.052.43±0.28121.85±0.071.91±0.082.11±0.162.38±0.082.68±0.13152.10±0.112.18±0.102.54±0.072.76±0.032.99±0.09
表6 CGH对香肠咀嚼性的影响 单位：N·cm
Table 6 Effect of CGH on chewability of the sausage
时间/d空白0.01%BHA0.25%CGH0.5%CGH0.75%CGH09.75±0.509.77±0.649.72±0.509.71±0.219.69±0.56315.90±1.1316.06±0.4214.33±1.6313.26±0.5011.09±0.31620.00±1.5621.21±0.5718.39±0.5716.78±1.0613.39±0.71937.41±1.5936.95±1.0433.29±1.9230.59±1.8927.98±1.331246.70±0.5147.77±0.0844.89±1.0941.47±1.1337.64±3.681551.93±1.9552.35±1.2549.69±0.2547.34±0.8943.23±0.24
由表4～表6可知，随着时间的延长，各组香肠的硬度、弹性和咀嚼性都呈上升的趋势，因为香肠在风干过程中水分在不断蒸发流失，导致含水量降低。CGH组对香肠物性有不同程度改善作用，其中以添加了0.75%CGH组的效果最好，使香肠的硬度只增加了3.13倍，低于空白组的4.90倍；弹性增加了1.39倍，高于空白组的0.76倍；咀嚼性只增加了3.46倍，低于空白组的4.33倍，而添加0.01%BHA组的硬度、弹性及咀嚼性变化不大，说明BHA对于改善香肠物性几乎没有作用。有研究表明，蛋白氧化会破坏肉制品的凝胶特性，而抗氧化剂能够抑制其氧化从而改善肉糜的凝胶特性，提高其持水性[31]，实验中各处理组香肠的硬度、弹性和咀嚼性与对照组相比均有不同程度的改善，是因为CGH具有良好的抗氧化活性，能够抑制香肠氧化，从而增强肉糜的凝胶强度和持水性，使香肠水分流失速率减慢，改善其质构性质。
色泽是消费者对于香肠的第一印象，分为亮度、红度和黄度3个方面，是影响香肠销量和观感的重要指标之一。CGH添加量对香肠色差(L*、a*、b*值)的影响如表7所示。
表7 CGH对香肠色差(L*、a*、b*值)的影响
Table 7 The effect of CGH on the sausage color difference
(L*, a *,b * value)
组别L*(亮度)a*(红度)b*(黄度)空白41.00±1.336.90±0.428.40±0.140.01%BHA33.60±1.417.03±0.636.90±0.990.25%CGH36.35±1.207.25±0.0710.70±0.280.5%CGH35.45±1.489.80±0.7011.75±0.920.75%CGH31.35±2.2311.80±0.1413.25±0.07
由表7可以看出，各实验组的亮度较空白组分别下降了18%、11.3%、13.5%、23.5%，说明CGH并不能维持或提高香肠的亮度。香肠的红度随着CGH添加量的增加呈上升趋势，在CGH添加量为0.75%时，香肠的红度最高，是空白组的1.71倍，说明CGH对于香肠的发色有良好的作用，能够促进消费者的食欲，吸引消费者购买。CGH是黄色粉末状固体，本身含有一定量的叶黄素、类胡萝卜素等物质[32-33]，所以在一定范围内，随着添加量的增加，香肠的黄度也随之升高，添加量为0.75%时，其黄度最高，是空白组的1.58倍。
感官评价是消费者评价香肠味道、口感、气味等指标最直接的方法，是影响消费者是否会购买的重要依据。CGH添加量对香肠感官评价结果如表8所示。
表8 CGH对香肠感官评价得分的影响 单位：分
Table 8 Effect of CGH on sensory evaluation
score of the sausage
组别色泽风味口感组织状态空白10.00±16510.08±1.7310.42±2.1510.25±1.470.01%BHA9.25±2.739.93±2.0010.41±1.9710.33±1.560.25%CGH10.00±2.2110.08±2.5310.39±1.9510.58±2.110.5%CGH10.50±1.9311.00±2.2910.83±2.6210.67±2.310.75%CGH10.03±2.529.83±1.9010.00±1.8610.42±1.98
由表8可知，添加0.25%CGH的各项感官评价得分与空白组并无明显差异，添加0.5%CGH的各项指标评分均高于空白对照组，其色泽、风味、口感和组织状态较空白组提高了5.00%、9.12%、3.93%和4.10%，说明少量添加CGH并不会降低香肠的感官得分，反而会使香肠品质变好，更能被消费者接受，添加0.5%CGH能够显著提高香肠的风味指标，可能是因为适量的CGH能够给香肠带来一种淡淡的玉米清香，风味较好，添加0.75%CGH的香肠有微微苦味，可能是因为添加量过多，玉米肽自身的苦味渗透到肉中，导致其各项感官评价指标得分偏低。
由于玉米谷蛋白溶解性差，限制了其在食品工业中的应用。本研究采用碱性蛋白酶对玉米谷蛋白进行酶解改性得到CGH，其DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和Fe2+螯合率的EC50分别为2.397、0.723 和0.329 mg/mL。将CGH与BHA分别添加到香肠中，比较其抑制香肠脂质过氧化能力，结果表明，添加0.75%CGH组的抗脂质氧化能力均比添加0.01% BHA好。另外添加CGH对香肠物性及理化性质有不同程度的改善效果，添加量为0.5% 时，香肠的感官评价得分最高。综上，CGH对于肉制品的腐败有抑制作用，能够延长肉制品的保藏时间，且对部分功能性质有一定程度的改善作用。本研究为玉米肽替代化学抗氧化剂应用于食品行业奠定了理论基础。
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