表1 差异蛋白质筛选结果统计 单位：个
Table 1 Statistical results of differential protein screening
比较组上调蛋白质数量下调蛋白质数量差异表达蛋白质数量SD vs FD23932MFD vs FD462268MFD vs SD343266
鸡蛋清中蛋白质种类非常丰富，每种蛋白的作用对机体的调节有着不同的意义。鸡蛋清中富含铁、钙、锌、钾和磷等矿物质对人体的健康起到关键作用。另外，鸡蛋清蛋白具有的多种加工特性也非常有益于食品生产[1]。随着食品工业的快速发展，蛋清蛋白被广泛应用于食品行业。因此，了解鸡蛋清中蛋白质的表达水平、分布情况、结构和功能对于解释鸡蛋中一些成分的功能性质和生物学性质是必要的，同时也为鸡蛋的深加工和利用提供理论依据和参考[2]。
近年来，蛋白质组学发展迅速，其研究方法主要是通过组学技术分离蛋白质，然后进行蛋白的质谱鉴定，从而研究蛋白在不同过程中的表达变化。有关蛋清蛋白质组学的研究国内外已有相关的报道。郝丽芳[3]采用凝胶电泳技术对贮藏期间鸡蛋黄中蛋白质丰度及种类的变化情况进行探究。牛春宇等[4]综述了几种常用于乳酸菌分离鉴定及功能研究领域的组学技术，阐述了多组学技术在乳酸菌功能及其机制研究中的应用概况，进一步为探明乳酸菌的潜在功能提供可行的技术方法和方向。马静等[5]整理了现阶段蛋白质组学技术发展情况、牦牛乳蛋白质组成及蛋白质组学技术在牦牛乳研究中的应用并进行论述。QIU等[6]对运用组学的方法研究了鸡蛋在不同贮存温度下蛋清蛋白质组的差异，采用二维电泳和软电离生物质谱相结合的方法，鉴定出了代表8种蛋白的32个蛋白点，在不同温度下保存时，其丰度存在显著差异。LIU等[7]利用组合肽配体库、双向凝胶电泳技术对胚胎快速生长期蛋清蛋白中低丰度蛋白的整体变化进行比较分析，研究发现在16 d的孵育过程中，发现了88个蛋白点的相对丰度显著差异(P≤0.05)，其中47个蛋白点对应于来自8个蛋白家族的10个蛋白。LU等[8]研究发现在山羊初乳与常乳中乳脂肪球膜存在差异蛋白，并在这些乳脂肪球膜蛋白中发现有长期抑郁蛋白。KIM等[9]在饲粮中添加皮质酮考察对鸡蛋清蛋白丰度的差异和蛋白质含量的影响，结果发现皮质酮治疗导致采食量增加和产蛋量降低(P≤0.05)。应激第14天，大蛋鸡的mRNAs和蛋白表达也受到显著调控(P≤0.05)。以上国内外相关研究都是运用组学相关技术对不同处理组之间蛋白质在组成成分、表达水平及各蛋白质之间的作用进行分析整理。本课题组前期采用iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技术对喷雾干燥(spray-drying，SD)处理的蛋清蛋白进行鉴定和生物信息学分析，探讨蛋清蛋白在不同干燥入口温度下差异蛋白质的分布、功能及作用机制[10]。然而目前还缺乏基于蛋白质组学的方法来探究不同干燥方式中蛋白质变化的研究报道。
本研究以真空冷冻干燥(vacuum freeze-drying，FD)、SD和微波真空冷冻干燥(microwave vacuum freeze-drying，MFD)3种干燥方式处理后的蛋清蛋白为研究对象，利用iTRAQ定量技术构建出蛋清蛋白干燥过程中的表达图谱，对比3种干燥方式蛋清蛋白质组学的变化，并对各时间点鉴定出的差异蛋白进行生物学分析，旨在更好地了解不同干燥方式下蛋清蛋白的差异变化并筛选出影响较大的功能性蛋白，为进一步开发高品质的功能性蛋清粉提供参考依据。
新鲜鸡蛋，河南洛阳盛德美超市；氨水、IAM碘乙酰胺、三乙胺-碳酸缓冲溶液(triethylammonium bicarbonate buffer，TEAB)，美国Sigma公司；丙酮、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)，上海国药公司；考马斯亮蓝染色液(常规法)，Beyotime公司；iTRAQ 8PLEX，美国AB SCIEX公司；Modified Trypsin蛋白酶(质谱级)，PROMEGA公司；PierceTM BCA蛋白检测试剂盒、蛋白Marker、蛋白酶抑制剂、Bond-BreakerTM TCEP溶液、水、乙腈、甲醇、甲酸、异丙醇，均为色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific公司。
Xo-1800D型超声波细胞破碎仪，上海般诺生物科技有限公司；EPS-300型数显式稳压稳流电泳仪，上海纳识生物科技有限公司；UltiMate 3000高效液相色谱仪、串联质谱仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；Tecan Infinite F50酶标仪，北京博宇腾辉科贸有限公司；LNG-T98B型冷冻离心浓缩干燥器，太仓市华利达实验设备有限公司；ATX124R型分析天平，上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司。
1.3.1 样品处理
蛋清粉：清洗鲜鸡蛋表面的污渍并进行消毒，晾干后分离蛋清蛋黄，搅拌蛋清液后室温下自然发酵48 h进行脱糖，巴氏杀菌法杀菌后分别采用SD、FD、MFD 3种方式进行干燥处理，具体参照本课题组前期实验方法[11]。
1.3.2 总蛋白质的提取
冷冻状态下取出适量样品置于冰上，加入蛋白质裂解液[8 mol/L尿素，1%SDS(质量分数)，含蛋白酶抑制剂]进行超声溶解2 min，然后在裂解20 min，12 000×g 4 ℃ 离心30 min，取蛋白质上清液用于定量。
1.3.3 蛋清蛋白酶解和肽段iTRAQ标记
取蛋白样品100 μg，按照酶与蛋白质量比为1∶50加入胰蛋白酶，在37 ℃条件下酶解10 h。用真空泵抽干肽段，然后用0.5 mol/L TEAB溶解肽段。从冰箱取出iTRAQ试剂盒待其恢复至25 ℃时对肽段进行标记。为了使实验结果更加清晰用不同的iTRAQ标签对肽段进行标记，在室温下放置60 min。最后把标记好的各组肽段进行混合，进行高效液相色谱分离，流速为200 μL/min，梯度为47 min。
1.3.4 蛋白质组数据分析
所有数据均采用Max Quant Software Reversion 1.5.3.8进行收集和量化。对于蛋白质分类，使用在线PANTHER库。为了在蛋清蛋白中发现过度表达的基因本体论，启动PANTHER过度表达试验，用Bonferroni校正对G.gallus(数据库中的所有基因)参考列表和注释数据集进行多次试验，利用在线BLAST2GO在线数据分析软件完成基因本体(gene ontology，GO)功能分析，利用在线KOBA分析软件完成KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析。
通过对所获得的蛋白信息和数据库结果进行对比，在3种干燥方式过程中共鉴定出157个蛋白。经分析得出这些蛋白质的肽段长度主要在7～24个氨基酸，属于正常范围可用于后续的实验分析。对鉴定到的蛋白质进行相对分子质量统计，结果表明，有89%蛋白质相对分子质量在1～120 kDa。按照表达倍数变化1.2倍以上的标准筛选差异表达蛋白质，表达倍数变化大于1.2倍表现为上调，表达倍数变化小于0.83倍表现为下调。由此筛选出差异蛋白质的结果如表1、图1所示，最终获得的差异蛋白总数为87个，其中MFD vs FD组上调蛋白质数量为46个，占差异蛋白质总数的67.6%。
表1 差异蛋白质筛选结果统计 单位：个
Table 1 Statistical results of differential protein screening
比较组上调蛋白质数量下调蛋白质数量差异表达蛋白质数量SD vs FD23932MFD vs FD462268MFD vs SD343266
图1 SD vs FD、MFD vs FD和MFD vs SD蛋清蛋白粉
韦恩图
Fig.1 Vennn diagrams of egg white protein in powder at
SD vs FD、MFD vs FD和MFD vs SD
通过对SD vs FD，MFD vs FD和MFD vs SD 3组的87个差异蛋白进行层次聚类分析，以揭示蛋白质变化的模式[12]，如图2所示。这些不同干燥方式处理的蛋清差异蛋白中，角蛋白，II型细胞骨架(ID号：NP_990263.1)、角蛋白，I型细胞骨架(ID号：NP_990340.2)、谷氨肽酶(ID号：XP_426327.3)均在SD处理中表现出高表达水平。角蛋白含有较多的胱氨酸，二硫键含量很多，在蛋白质肽链中起交联作用，因此角蛋白化学性质特别稳定，有较高的机械强度。此外，角蛋白中还含有丰富的谷氨酸、天冬氨酸等鲜味氨基酸，可以用来制作新型食品添加剂应用到食品加工业中。胰岛素样生长因子结合蛋白7(ID号：XP_420577.4)、黏蛋白-6(ID号：XP_015142236.2)、可溶性钙活化核苷酸酶1亚型(ID号：XP_015150907.1)均在FD处理中表现出高表达水平。胰岛素样生长因子结合蛋白是一组具有促生长作用的多肽类物质。跨膜蛋白酶丝氨酸9亚型(ID号：XP_425880.4)、载脂蛋白D前体(ID号：NP_001011692.1)、低品质蛋白:动力蛋白重链5(ID号：XP_025003476.1)、前神经肽Y前体(ID号：NP_990804.1)、二-N-乙酰壳多糖酶(ID号：XP_422372.1)均在MFD处理中表现出高表达水平。跨膜蛋白酶丝氨酸可以断裂大分子蛋白质中的肽键，使之成为小分子蛋白质。蛋清中这些高表达量蛋白的发现能够为选择合适的方式干燥出高品质的功能性蛋清粉提供重要信息。此外，在MFD vs FD组中差异蛋白数量较多，可能是因为蛋清蛋白经微波辐照后结构和理化性质改变，进而引起其功能性质改变。课题组前期[13]研究表明，MFD工艺会对鸡蛋清蛋白的结构和功能特性造成一定的影响。
图2 差异表达蛋白质聚类分析结果
Fig.2 Results of cluster analysis of differentially
expressed proteins
GO是一个标准化的基因功能分类体系，它分别从3个方面对蛋白质功能进行分类，分别为分子功能(molecular function,MF)、生物过程(biological process,BP)、细胞组成(cellular component,CC)[14]。SD vs FD、MFD vs FD和MFD vs SD 3组蛋清蛋白共鉴定87个差异蛋白，利用BLAST2GO软件对差异表达蛋白进行GO富集分析，结果如图3、表2所示，3组比较组中，参与的BP主要涉及单体细胞过程、生物调节(biological regulation)、代谢过程、生物过程调节，说明不同的干燥方式对鸡蛋清细胞内蛋白质的代谢影响很大。CC主要分布在胞外区、细胞、细胞器、细胞部分、胞外区部分。其参与的蛋白质数较多显著过度表达，说明了蛋清对细胞的保护作用[15]。差异倍数最高的为黏蛋白(蛋白ID：XP_025007106.1)，差异倍数为2.619。黏蛋白是一族高分子质量、重糖基化的蛋白，与蛋清的凝胶性质密切相关[16]，是蛋清凝胶状结构的重要成分[17]。MF主要包括结合和催化活性。由此表明3种干燥方式会造成生物过程、细胞组成及分子功能等方面的基因功能发生变化。郭长明等[18]利用蛋白组学技术对鱼源株与人源株差异表达蛋白进行GO功能分析，结果发现，差异蛋白共涉及26个生物学功能。LIAO等[19]利用GO功能注释分析了不同泌乳期人乳乳清差异蛋白主要参与了信号传导、细胞外组成、代谢等过程。通过GO功能分析找到差异基因富集在哪些类别条目上，寻找引起基因功能改变的差异基因，对实验结果有指导作用。
图3 GO功能富集分析
Fig.3 GO function enrichment analysis
表2 差异蛋白的GO术语和途径
Table 2 GO terms and pathways for differential proteins
二级分类名称GO ID差异蛋白数目比例细胞死亡00019062/87细胞过程000998724/87代谢过程000815221/87生物过程负调控004851912/87生物过程调节005078919/87多细胞有机体过程003250114/87多生物过程00517048/87发展过程003250212/87生物黏附00226103/87生物调节006500722/87生物过程正调控00485186/87刺激反应005089618/87生殖过程00224141/87免疫系统过程00023766/87单细胞过程004469927/87细胞外区域部分004442125/87细胞连接00300545/87细胞部分004446428/87细胞外区域000557633/87细胞000562329/87大分子复合体00329914/87细胞器部分004442211/87膜部分004442510/87转运活性00052154/87营养贮存活性00457351/87催化活性000382411/87结合000548825/87
KEGG是常用的代谢和信号转导通路研究数据库之一[20]。利用Python软件生成Pathway富集分析柱形图。如图4～图6所示，利用KEGG数据库对MFD vs FD组差异表达蛋白进行注释，结果显示，富集最为显著的为折叠和降解、运输和分解代谢、细胞生长和死亡，接下来分别为细胞活性、脂质代谢、聚糖的生物合成和代谢、信号传导、细胞群落、辅助因子和维生素的代谢、核苷酸代谢、内分泌系统、传染病。利用KEGG数据库对SD vs FD组差异表达蛋白进行注释，结果显示，富集通路为聚糖的生物合成和代谢、细胞活性、运输和分解代谢、核苷酸代谢。利用KEGG数据库对MFD vs SD组差异表达蛋白进行注释，结果显示，富集最为显著的为折叠和降解、运输和分解代谢，接下来分别为细胞生长和死亡、脂质代谢、转录、信号传导、翻译内分泌系统。彭梦玲等[21]和马聪聪等[22]同样利用KEGG数据库对差异蛋白进行注释，找到了差异基因显著性变化的生物学调控通路。
图4 MFD vs FD差异蛋白的KEGG通路图
Fig.4 KEGG pathway analysis of MFD vs FD differential proteins
图5 SD vs FD差异蛋白的KEGG通路图
Fig.5 KEGG pathway analysis of SD vs FD differential proteins
图6 MFD vs SD差异蛋白的KEGG通路图
Fig.6 KEGG pathway analysis of MFD vs SD differential proteins
在机体中，蛋白质通过结合作用和相互作用进行彼此之间的信号传递和功能之间的相互调节。本研究将不同干燥方式下(SD、FD、MFD)的差异蛋白进行蛋白质网络互作分析，图7为MFD vs FD、SD vs FD、MFD vs SD共同差异表达蛋白的互作图。与蛋白关联的线条数量越多，表明该蛋白在网络中越关键。其中具有高连接度的为血清白蛋白前体、凝血酶原前体、组织蛋白酶L1前体。血清白蛋白分子质量较低，溶于水，易结晶，在中性溶液中加热即凝固，是具有黏性和胶质性的物质，在现代食品加工业中常作为防腐剂和保健剂。这些高连接度的鸡蛋清差异蛋白很可能是调节整个系统代谢和信号传导途径的关键节点，具有非常重要的作用。
图7 蛋白互作网络图
Fig.7 Protein interaction network
MFD vs FD、SD vs FD、MFD vs SD 3组间共有的87个差异表达蛋白，从差异蛋白筛选出与蛋清蛋白密切相关的指示蛋白。由图8可知，有4种蛋白质在不同的干燥过程中丰度变化显著，分别是黏蛋白(XP_025007106.1)、血清白蛋白(NP_990592.2)、卵清蛋白相关蛋白Y亚型X1(XP_015137657.1)和卵白蛋白相关蛋白Y(NP_001026172.1)。丰度变化显著的原因可能是不同的干燥方式对蛋清蛋白的结构和理化性质有不同程度的影响，从而造成蛋白之间的差异，这符合本课题组前期研究发现结果[11]。
a-黏蛋白(XP_025007106.1)；b-血清白蛋白(NP_990592.2)；c-卵清蛋白相关蛋白Y亚型X1(XP_015137657.1)；
d-卵白蛋白相关蛋白Y(NP_001026172.1)
图8 二级质谱图
Fig.8 Secondary mass spectrum
2.6.1 黏蛋白
黏蛋白在鸡蛋蛋白质中变性原性较强[23]，其结构紧密有耐热耐酸碱等特性。黏蛋白是形成凝胶的关键蛋白，其含量与蛋清凝胶黏弹性呈正相关，对蛋清凝胶状结构影响显著。并且黏蛋白耐蛋白水解，具有维持重要黏膜障碍的作用[24]。
2.6.2 血清白蛋白
血清白蛋白在人体血浆蛋白质中占比较大，是一种溶解度大，亲水性强，功能较多的蛋白。它可以和一些难溶的物质结合形成易溶性的复合物。因运输类固醇胆色素、氨基酸等物质具有运输作用，它是反映肝脏合成功能的重要指标，能够维持人体血液中正常的渗透压水平。
2.6.3 卵清蛋白相关蛋白Y亚型X1
卵清蛋白相关蛋白Y亚型X1是卵清蛋白中的一种，也是蛋清中的主要组成成分，其结构与性质发生变化会引起功能性质的改变，采用不同干燥技术和手段一定程度上影响其抗氧化性、持水性、乳化性等功能性质。LIU等[25]探究了SD和MFD对水解/糖基化卵清蛋白制备的影响，研究发现经MFD处理的水解/糖基化卵清蛋白在起泡性、乳化稳定性和热稳定性均优于SD。因此探究卵清蛋白经干燥处理后是否会引起蛋清蛋白在加工过程中功能性质的改变可为实际生产提供重要的参考价值。
2.6.4 卵白蛋白相关蛋白Y
卵白蛋白相关蛋白Y属于卵白蛋白中的一种，对蛋清液的起泡性和乳化性有很大影响，因此，制备蛋清粉时，加工方式的选择对卵白蛋白的品质尤为重要。李俐鑫等[26]有关研究表明卵白蛋白的某些功能特性如凝胶性、黏性等易受外部因素的影响，因此，在食品加工过程中要注意调整因素的水平以确保达到理想的加工条件。此外，还有相关研究表明卵白蛋白与多糖复合后可以提高其凝胶性质[27]。
鸡蛋清在3种不同的干燥方式过程中，以上4种蛋白丰度发生显著变化，很可能是在不同的干燥方式下，不同的加热温度和加热时间会造成蛋白质结构发生变化，进而引起蛋白的功能性质发生改变。其具体原因有待进一步验证。
本研究利用iTRAQ蛋白质组学先进技术，对FD、SD、MFD的蛋清蛋白的组成及丰度差异进行了鉴定和分析。在157种鉴定的具有定量信息的蛋清蛋白中，发现了87种差异丰度蛋清蛋白。不同的干燥方式相比，MFD vs FD组比SD vs FD组差异蛋白数目多52.94%，说明干燥方式会对蛋清蛋白丰度差异产生较大影响。通过功能注释、蛋白质网络互作等生物信息学分析发现，差异蛋白主要参与的生物过程为单体细胞过程，主要参与的分子功能为蛋白结合，主要参与的细胞组成为胞外区。
在不同的干燥方式蛋清蛋白差异蛋白质组中发现有4个蛋白质变化较为明显，分别为黏蛋白、血清白蛋白、卵清蛋白相关蛋白Y亚型X1和卵白蛋白相关蛋白Y，在功能注释、差异倍数和蛋白质互作中变化显著。这4个差异蛋白质均有望作为蛋清蛋白干燥过程中的指示蛋白。本研究对3种干燥方式的蛋清蛋白丰度差异进行了深入研究，找到了重要的功能性蛋白，这些蛋白的发现能够为日后生产及优化功能性蛋制品提供理论依据。
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