分子感官科学是在分子水平上定性和定量解析食品的滋味和气味等感官品质的多学科交叉综合技术，由德国Peter Schieberle教授于2007年提出[1-2]。其主要以GC-MS、气相色谱-嗅闻仪(gas chromatography-olfactometry, GC-O)和核磁共振等高灵敏的检测分析方法为技术基础，从分子水平解密食品滋味和风味的物质组成，客观评价食品的感官品质[2]。近几年科学家们利用分子感官科学技术着重对各种发酵食品及果蔬汁中滋味和风味物质的组成进行相应研究。RHYU等[3]根据分子感官技术鉴定出鲜味肽(含谷氨酸或天冬氨酸)是决定大酱鲜味的主要物质之一。而甲硫氨酸、麦芽酚、愈创木酚、4-乙基愈创木酚、2-乙酰吡咯、2-乙酰呋喃、2-苯乙醇和4-羟基-2, 5-二甲基-3(2H)-呋喃酮是我国市售酱油的主要呈味物质，使酱油具有烤土豆味、焦糖味、烤坚果味和水果味等特征[4]。此外，ZHANG等[5]利用GC-MS和GC-O联用技术鉴定出18种具有香气活性的红树莓汁挥发性化合物，发现花草香是红树莓汁的主体香气。
薏仁米，又称薏米，是一年生禾本科草本植物薏仁的种仁，营养丰富且兼具药理作用，具有利尿、抗过敏、抗炎、抗肥胖、抗氧化和免疫调节等多种功效，被誉为“生命健康之禾”[6-9]。大量研究表明，薏仁米作为一种高油脂的谷物，极易在贮藏过程中发生酸败而导致劣变[10]，严重限制了其营养及开发价值，因此对薏仁米深加工开发具有重要意义。
近年来，乳酸菌发酵已成为谷物深加工中最经济和安全的技术之一。在谷物发酵过程中，乳酸菌的生长代谢与谷物成分相互作用，增强纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶等相关酶的表达，改善发酵谷物产品的理化特性和感官品质[11]。YIN等[12]研究发现植物乳杆菌NCU137发酵薏米能显著增加醇类化合物和减少呋喃类化合物的含量。戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)AB-8是一株从四川泡菜中分离出的潜在益生菌，其生长速率快，耐酸和产酸能力强，还具有较强的产β-葡萄糖苷酶能力。因此，本研究基于分子感官和稳定性评估戊糖乳杆菌AB-8对薏仁米的发酵影响，测定发酵过程中有机酸、氨基酸和挥发性风味物质的变化，并结合人工感官和稳定性测试评价乳杆菌AB-8的发酵性能，为改善薏仁米感官品质提供数据支撑和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
材料：薏仁米，长春金籽农产品有限公司；戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)AB-8，实验室分离获得。
试剂：亚铁氰化钾、ZnSO4、茚三酮、NaCl等(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；草酸、乳酸、丁酸、苹果酸、柠檬酸、乙酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、2-辛醇等(色谱纯)，上海阿拉丁生化科技有限公司。
1.2 仪器与设备
TGL-16M台式高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；1260高效液相色谱仪、7890A气相色谱仪、5975C质谱仪，美国Agilent公司；LA-8080全自动氨基酸分析仪，日本日立制作所；LT3600 ZETA电位分析仪，上海力晶科学仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品制备
参考YIN等[12]的方法制备发酵薏仁米。称取新鲜薏仁米300 g，加水浸泡4 h，用2倍质量的无菌水打浆，打浆的混合物置于115 ℃灭菌20 min，冷却后装入无菌玻璃罐中，混匀后接种于戊糖乳杆菌AB-8 3.8×105 CFU/g混合物，37 ℃发酵48 h，每12 h平行取样3次，并编号为0、12、24、36、48 h，置于-80 ℃冰箱储存，待测。
1.3.2 有机酸测定
采用HPLC检测薏仁米发酵过程中有机酸的含量[13]。称取适量样品，8 000 r/min离心15 min取上清液，依次加入等体积的亚铁氰化钾和ZnSO4，混匀，12 000 r/min离心5 min，上清液过0.45 μm滤膜后进行HPLC分析。色谱条件：Ecosil C18色谱柱，流动相为甲醇-水-磷酸溶液[A液，V(甲醇)∶V(水)∶V(磷酸)=80∶15∶5；B液，V(甲醇)∶V(水)∶V(磷酸)=5∶90∶5]，流速0.5 mL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃，检测波长210 nm；梯度洗脱：0～5 min，B 100%；5～15 min，B 100%～90%；15～45 min，B 90%～0%；45～55 min，B 0%；55～60 min，B 0%～100%；60～70 min，B 100%[13]。
1.3.3 游离氨基酸测定
参考王泽晗等[14]的方法测定。称取适量样品，8 000 r/min离心15 min取上清液，加入4倍体积的50 g/L三氯乙酸溶液，混匀后4 ℃反应60 min，10 000 r/min离心5 min，上清液过0.22 μm滤膜后进行游离氨基酸分析。分析条件：分离柱为TS263离子交换柱，流速60 μL/min，进样量10 μL，柱温30 ℃，检测波长为440和570 nm。
1.3.4 挥发性风味化合物测定
参照杨忠全等[15]的方法测定。称取2 g样品置于20 mL螺口顶空瓶中，分别加入6 mL超纯水和1.5 g NaCl，再向瓶内加入10 μL 2-辛醇(1.6 g/L)标准品作为内标物，密封后置于60 ℃水浴平衡5 min，将萃取头(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)插入顶空瓶吸附40 min，然后在GC进样口(250 ℃)解吸5 min。GC条件：采用Agilent DB-WAX毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；进样口温度250 ℃，不分流；载气为氦气；流速1.0 mL/min；升温程序：初始40 ℃保持2 min；以4 ℃/min上升到80 ℃，保持2 min；以4 ℃/min上升到145 ℃；再以10 ℃/min上升到220 ℃；保持5 min。质谱条件：电子轰击离子源；离子源温度250 ℃；四极杆温度180 ℃；扫描范围m/z 33～450。定性方法：经NIST08数据库检索定性。采用面积归一法定量[15]。
1.3.5 感官评定
参考ISO 8589—2010《感官分析 试验室设计的一般指南》对发酵前后样品进行感官评价。感官评价小组由12位品评师(6男6女，年龄25～45岁)组成，试验在食品感官品评室中进行。参考标准物质的溶度参照STEINHAUS等[16]的方法。以下5种水溶液作为“滋味”标准：2 g/L NaCl(咸味)、1.65 g/L乳酸(酸味)、5 g/L L-异亮氨酸(苦味)、35 g/L 蔗糖(甜味)和0.6 g/L谷氨酸钠(鲜味)。同时，以下6种水溶液作为“风味”标准：乙酸(酸香)、1-辛烯-3醇(蘑菇香)、苯乙醇(花香)、乙醇(醇香)、己酸乙酯(果香)和己醛(脂肪香)，然后被要求对样品滋味和气味强度进行评分(0～9)：0(无)；1～3(较弱)；4～6(中等强度)；7～9(强)。
1.3.6 稳定性测定
采用电位分析仪表征发酵前后薏仁米样品的粒径和ζ电位。
1.4 数据分析
数据结果以平均值±标准偏差的形式表示。使用SPSS 19.0软件进行方差分析。采用GraphPad Prism 8.0、Excel 2017和R 3.6绘制图表。
2 结果与讨论
2.1 发酵对有机酸含量的影响
乳酸菌可将薏仁米中小分子糖类物质转化为有机酸，增加产品酸感。发酵后的薏仁米有机酸色谱图见电子增强出版附图1(http://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.032010)。由表1可知，在未发酵样品中只检测到草酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸和α-酮戊二酸等5种有机酸，其含量分别为94.36、214.11、37.45、26.84、8.22 mg/L。接种戊糖乳杆菌AB-8后，除苹果酸含量逐渐减少外，其他有机酸均逐渐增加。在发酵48 h时草酸、柠檬酸、琥珀酸和α-酮戊二酸分别比未发酵增加了10.81%、2 513.94%、96.13%和57.91%，而苹果酸含量则减少了72.27%。此外，在发酵48 h时还检测到乳酸、丁酸和乙酸，其含量分别为3 412.67、535.73、283.5 mg/L，而乳酸作为乳酸菌的主要代谢产物，占有机酸总含量的62.73%。在乳酸发酵体系中生成的乳酸可以参与丁酸和挥发性脂类化合物的合成[17]。丁酸是一种常见的短链脂肪酸，可用于改善非酒精性脂肪肝的形成[18]。综上可知，接种戊糖乳杆菌AB-8发酵可赋予薏仁米柔和的酸感，并提升薏仁米的益生功能。
表1 薏仁米发酵过程中有机酸含量的动态变化
Table 1 Dynamic changes of organic acids content during the fermentation of coix seed
有机酸质量浓度/(mg·L-1)0 h12 h24 h36 h48 h阈值/(mg·L-1)滋味活性值(taste activity value,TAV)草酸94.36±9.07a98.28±10.34a102.05±8.69a104.13±10.35a104.56±10.77a5.2[19]>1乳酸ND768.55±69.22c1 863.69±162.19b3 350.58±269.31a3 412.67±241.83a83.4[19]>1丁酸ND107.61±9.38c278.37±19.35b507.02±37.51a535.73±31.9a6.2[19]>1苹果酸214.11±16.15a132.22±13.42b80.96±8.66c65.94±7.37cd59.37±5.84d7.4[19]>1柠檬酸37.45±6.3d510.92±56.19c743.31±62.68b935.64±80.03a978.92±86.17a4.4[19]>1乙酸ND51.37±6.39c 141.06±15.3b263.15±28.91a283.5±29.36a55.6[19]>1琥珀酸26.84±4.11c39.55±4.34b47.07±5.5ab51.15±5.12a52.64±4.95a23.1[19]>1α-酮戊二酸8.22±1.02b10.73±1.56ab12.01±1.81a12.67±1.77a12.98±1.9a 5.6[19]>1
注：ND表示未检出；同行不同字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
2.2 发酵对游离氨基酸含量的影响
乳酸菌发酵谷物过程中可利用其自身蛋白水解系统降解谷物蛋白生成短肽和氨基酸，赋予产品独特的鲜味特征[20-21]。发酵后的薏仁米游离氨基酸色谱图见电子增强出版附图2(http://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.032010)。根据表2可知，在未发酵样品中只检测到6种游离氨基酸和2种必需氨基酸，含量最高的为Arg(6.89 mg/L)，其次分别为His(6.57 mg/L)、Pro(3.86 mg/L)、Lys(3.62 mg/L)、Ala(3.39 mg/L)和Gly(1.41 mg/L)，与YIN等[12]的研究结果相一致。接种戊糖乳杆菌AB-8后，薏仁米中游离氨基酸的组成发生显著改变，其游离氨基酸和必需氨基酸种类分别增加至17种和8种。在发酵48 h时总氨基酸含量和必需氨基酸含量分别比未发酵增加了3.72倍和5倍。除Pro和Arg外，其他氨基酸含量均随发酵的不断进行而逐渐增加，其中His、Ala、Val、Phe和Glu等5种氨基酸含量增加最为显著，在发酵48 h时含量分别可达22.89、19.11、13.04、12.05和9.12 mg/L。某些氨基酸含量的增加可能是由于乳酸菌代谢产生的氨基酸和其他氨基酸的转化，从而丰富产品的滋味[12]。Asp和Glu有助于改善产品的鲜味，而Ser、Gly、Ala和Thr可赋予产品甜味[22]。以Asp、Glu、Gly和Ala为代表的滋味氨基酸对薏仁米的滋味起着至关重要的作用，发酵48 h时鲜味氨基酸(13.26 mg/L)和甜味氨基酸(25.24 mg/L)含量远高于未发酵薏仁米(未检出和12.28 mg/L)。此外，Asp、Glu、Gly和Ala的含量还会影响薏仁米的风味，发酵48 h后薏仁米中风味氨基酸含量可达35.64 mg/L，是未发酵的7.43倍。上述结果表明，戊糖乳杆菌AB-8发酵可提高薏仁米的游离氨基酸含量，增加滋味和风味氨基酸的含量，有助于促进发酵薏仁米鲜甜滋味和风味的形成。
表2 薏仁米发酵过程中游离氨基酸的动态变化
Table 2 Dynamic changes of free amino acids during the fermentation process of coix seed
游离氨基酸质量浓度/(mg·L-1)0 h12 h24 h36 h48 h阈值/(mg·L-1)滋味贡献TAVAsp^ND2.27±0.37c3.49±0.39b4.35±0.38a4.54±0.45a1[22]鲜>1Glu^ND4.75±0.51c7.37±0.63b8.78±0.73a9.12±0.71a0.3[22]鲜>1SerND0.18±0.03b0.3±0.05a0.39±0.06a0.41±0.08a1.5[22]甜<1Gly^1.41±0.18c2.02±0.2b 2.48±0.23ab2.73±0.25a2.87±0.25a1.3[22]甜>1Ala^3.39±0.4d9.91±0.88c14.63±1.11b18.05±1.25a19.11±1.21a0.6[22]甜>1ThrΔND0.01±0.01a0.01±0.01a0.02±0.01a0.02±0.01a2.6[22]甜<1LysΔ3.62±0.32a2.76±0.33b2.23±0.24bc1.88±0.2c1.81±0.19c0.5[22]微甜>1Pro3.86±0.42a2.59±0.29b1.62±0.2c1.15±0.13d1.02±0.13d3[22]微甜>1Arg6.89±0.55a7.26±0.63a7.51±0.66a7.73±0.69a7.79±0.68a0.5[22]苦>1HisΔ6.57±0.41d14.68±0.89c19.79±1.01b22.12±1.33a22.89±1.19a0.2[22]苦>1
续表2
游离氨基酸质量浓度/(mg·L-1)0 h12 h24 h36 h48 h阈值/(mg·L-1)滋味贡献TAVIleΔND0.62±0.05c1.01±0.09b1.33±0.1a1.38±0.09a0.9[22]苦>1LeuΔND2.86±0.21c5.1±0.42b6.61±0.47a7.33±0.52a1.9[22]苦>1MetΔND1.15±0.09c1.97±0.14b2.34±0.16a2.65±0.21a0.3[22]苦>1PheΔND5.49±0.46c9.05±0.77b11.34±0.93a12.05±0.97a0.9[22]苦>1ValΔND5.46±0.41c9.89±0.8b 12.5±0.99a13.04±0.96a 0.4[22]苦>1TyrND2.64±0.23c4.79±0.4b 6.17±0.51a6.98±0.7a 0.9[22]微苦>1CysND3.74±0.31c6.15±0.55b7.82±0.69a8.55±0.75a-无味鲜味氨基酸ND7.02±0.66c10.86±0.99b13.13±1.23a13.36±1.21a甜味氨基酸12.28±0.92d17.47±1.33c21.27±1.89b24.22±2.02ab25.24±2.04a苦味氨基酸13.46±1.12d40.16±3.32c59.11±4.95b70.14±6.02ab74.11±6.11a风味氨基酸^4.8±0.36d18.95±1.51c 27.97±2.44b 33.91±3.06a 35.64±3.03a 必需氨基酸Δ10.19±0.89d33.03±2.92c 49.05±4.33b 58.14±5.25a 61.17±5.42a 非必需氨基酸15.55±1.22d35.36±3.01c48.34±4.22b57.17±5.17a60.39±5.38a总氨基酸25.74±2.22d68.39±6.3c97.39±9.24b115.31±10.85ab121.56±11.01a
注：-表示阈值未查到；^表示风味氨基酸；Δ表示必需氨基酸；空白表示无相关数据
2.3 发酵对挥发性化合物含量的影响
薏仁米中脂类和含氮化合物可作为大多数挥发性化合物的前体[17]。发酵后的薏仁米挥发性化合物色谱图见电子增强出版附图3(http://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.032010)。由电子增强出版附表1可知，在未发酵样品中检测出30种挥发性化合物，接种戊糖乳杆菌AB-8发酵48 h后，可检测出42种挥发性化合物。未发酵和发酵的薏仁米挥发性化合物含量差异显著，随着发酵的不断进行，挥发性化合物含量呈先降后升的变化趋势。发酵48 h后总挥发性化合物含量可达15 059.58 μg/L，比未发酵增加了36.19%。除醛类和其他类化合物外，醇类、酸类、脂类和酮类化合物的含量均随发酵的不断进行而逐渐增加，在发酵48 h时含量分别可达7 134.92、1 552.16、2 019.89、1 921.56 μg/L。其中，乙酸、异丁酸、丁酸、己酸、辛酸和壬酸仅在发酵的薏仁米中被发现，这些物质是潜在的酸化剂同时可作为霉菌的广谱抑制剂[12]。醇类化合物可为发酵产品带来酒香气和怡人的花草香气[23]，发酵48 h后含量最高的醇类化合物为正己醇(2 916.6 μg/L)，其次分别为正辛醇(820.3 μg/L)和苯乙醇(2 916.6 μg/L)。醛类化合物具有沸点低和阈值小等特性，具有脂肪味、花香、果香和青草香等风味，对薏仁米风味的贡献较大[12]。发酵48 h后醛类化合物中含量较多有糠醛(616.81 μg/L)、2-辛烯醛(128.1 μg/L)和壬醛(121.04 μg/L)等。经戊糖乳杆菌AB-8发酵的薏仁米中2,3-丁二酮、2-庚酮、3-羟基-2-丁酮和2-壬酮的含量较高，在发酵48 h时含量分别可达176.22、427.14、835.66、241.11 μg/L，而未发酵样品的检测结果正好相反。这可能是因为在柠檬酸代谢过程中，柠檬酸被柠檬酸裂解酶分解为乙酸和草酰乙酸，后者经草酰乙酸脱羧酶生成丙酮酸，并降解为乳酸、2,3-丁二酮和3-羟基-2-丁酮[24]，其中，后两者赋予发酵薏仁米浓郁的奶香味[24]。此外，发酵48 h后2-戊基呋喃(779.93 μg/L)含量显著低于未发酵样品(2 614.95 μg/L)。2-戊基呋喃对热加工食品的感官特性有显著贡献，但对人体健康有害[25]。本研究结果表明，接种戊糖乳杆菌AB-8发酵可增加薏仁米挥发性风味物质的含量，使发酵后薏仁米具有特殊香气。此外，发酵有助于减少2-戊基呋喃和糠醛的含量，提高产品的安全性。
2.4 发酵对关键滋味及香气化合物的影响
滋味活性值(taste activity value, TAV)和香气活性值(odor activity value, OAV)能确切地评价单一组分的滋味和香气强度对整体滋味和香气的贡献度。通常认为TAV>1的化合物为呈味的关键化合物，而OAV>1的化合物则为呈香的关键化合物[5, 22]。根据表1、表2及增强出版表1可知，以TAV>1或OAV>1为标准在薏仁米发酵过程中筛选出22种关键滋味化合物和19种关键香气化合物。基于这些关键化合物对15个样品进行层次聚类。如图1-a所示，这些样品可被划分为2个簇，未发酵样品单独聚为1簇(Ⅰ)，其他发酵样品则聚为另一簇(Ⅱ)；而第Ⅱ簇又可进一步分为两个亚簇，其中发酵12～24 h的样品聚为一个亚簇(ⅰ)，发酵36～48 h的样品则聚为另一个亚簇(ⅱ)。不同发酵时间的样品中关键滋味和风味物质呈现清晰的时间变化规律。此外，在主成分分析中也观察到与聚类分析相一致的结果(图1-a)。由图1-b可知，主成分1表示所有变量的84.77%，主成分2表示所有变量的8.91%，总计贡献率达93.68%。上述结果表明，接种戊糖乳杆菌AB-8发酵能够改变薏仁米中关键滋味和风味物质的含量。
a-聚类分析；b-主成分分析
图1 发酵对关键滋味和香气化合物的影响。
Fig.1 Effect of fermentation on key flavor and aroma compounds
2.5 不同发酵时间标志性关键滋味和香气化合物的分析
为进一步确定不同发酵时间的标志性关键滋味和香气化合物，对薏仁米发酵过程进行了线性判别分析效应大小分析。由图2可知，未发酵、发酵12～24 h和发酵36～48 h薏仁米分别鉴定出16、11和14个关键物质。1-辛烯-3-醇、己醛、Arg、Lys、草酸和苹果酸等在未发酵薏仁米中富集；2-壬酮、2,3-丁二酮、Asp、Glu、琥珀酸和柠檬酸等在发酵12～24 h薏仁米中富集；而己酸乙酯、3-羟基-2-丁酮、Tyr、Val、丁酸和乳酸等在发酵36～48 h薏仁米中富集。1-辛烯-3-醇呈现强烈的蘑菇香[4]，可能是薏仁米中蘑菇香的特征物质；而己醛等醛类化合物具有脂肪味，可能是薏仁米中脂肪香的特征物质。己酸乙酯等酯类化合物可能来源于醇类化合物和酸类化合物的酯化反应，其呈现果香，使发酵后的薏仁米具有果香特征。
图2 不同发酵时间生物标志性关键滋味和 香气化合物的分析
Fig.2 Analysis of key taste and aroma compounds of biomarkers at different fermentation times
2.6 发酵对感官评定的影响
如图3所示，薏仁米发酵前后在不同感官属性上的强度值及其风味均存在差异。接种戊糖乳杆菌AB-8发酵48 h后，酸味、甜味、苦味及鲜味显著高于未发酵样品。未发酵样品的脂肪香和蘑菇香显著高于发酵48 h样品，而果香和花香则显著低于发酵48 h样品。综上可知，发酵48 h薏仁米的滋味以酸味、甜味和鲜味为主，而香气则以果香和花香最为突出。
a-滋味；b-香气
图3 发酵对感官评定的影响
Fig.3 Effect of fermentation on sensory evaluation
注：*表示差异显著(P<0.05)
2.7 发酵对稳定性的影响
如图4-a所示，未发酵样品静置1 h后出现明显的分层，而接种戊糖乳杆菌AB-8发酵48 h后的样品稳定性较好。为确定影响薏仁米稳定性的因素，对薏仁米的ζ电位和粒径进行了检测。由图4-b和图4-c可知，接种戊糖乳杆菌AB-8发酵48 h后，发酵薏仁米的ζ电位绝对值从9.16 mV显著减小至1.13 mV，而粒径则从1 020 nm增加至5 116 nm。根据静电原理[26]，由于ζ电位绝对值的降低和粒径的增大，发酵48 h后颗粒运动速度比未发酵样品要慢。这些结果表明，接种戊糖乳杆菌AB-8发酵可以提高薏仁米的粒径和降低ζ电位绝对值，降低颗粒沉降速度，从而增加薏仁米的贮藏稳定性。
a-稳定性；b-ζ电位；c-粒径
图4 发酵和未发酵薏仁米的稳定性、ζ电位和粒径的比较
Fig.4 The comparison of the stability,ζ potential, and particle size between fermented and non-fermented coix seed
注：** P< 0.01，*** P< 0.001
3 结论
本文将戊糖乳杆菌AB-8用于薏仁米发酵，研究发酵过程中有机酸、游离氨基酸和挥发性风味物质等分子感官指标的变化规律，并比较发酵前后的人工感官及稳定性的差异。结果表明，发酵能显著提高薏仁米的有机酸含量，其中乳酸的含量变化最大，增加了3 412.67 mg/L。相比未发酵样品，发酵48 h后总氨基酸含量和必需氨基酸含量分别增加了3.72倍和5倍。此外，接种戊糖乳杆菌AB-8发酵后薏仁米挥发性风味化合物的种类从30种增加至42种，含量则从11 057.82 μg/L 增加至15 059.58 μg/L。发酵48 h后可显著增加薏仁米的酸味、甜味和鲜味，同时增加果香和花香。此外，发酵还可以改善薏仁米的稳定性。本研究为薏仁米发酵加工提供了实验依据，为薏仁米的深加工提供了一种新型环保的加工工艺。
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