亚硝酸钠因其抑菌、防腐、增色等特性而被广泛作为食品添加剂，并且腌制食物存放一定时间也会产生亚硝酸钠[1]。但是，过量摄入亚硝酸钠会导致高铁血红蛋白症，这种现象在婴儿中频繁出现，对婴儿健康造成严重危害。更为严重的是，亚硝酸盐是亚硝胺的前体物质，而亚硝胺是被广泛证实的强致癌物质[2]。因此，寻找天然食物成分来有效降低食品中的亚硝酸钠以及阻断亚硝胺合成已成为食品工业的关注热点。
麒麟菜是一种大型海洋经济红藻，含有大量的卡拉胶和粗纤维，主要用途是提取卡拉胶。随着卡拉胶在食品和化工等领域的广泛应用，产生了大量的麒麟菜提胶残渣。这些残渣大部分仅当作废弃物处理，不仅未能发挥其剩余价值，也造成了环境污染。而事实上麒麟菜残渣中含有丰富的不溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber，IDF)，这些IDF富含羟基与羧基等官能团，具有较强的结合能力和吸水膨胀特性[3]。已有研究表明某些植物IDF具有吸附亚硝酸钠的能力[4-6]，并且纤维吸水膨胀后，可以加快肠道蠕动进而将所吸附的亚硝酸钠等有害物质带出体外。然而目前的研究多集中于麒麟菜全海藻的应用，缺乏麒麟菜残渣吸附有害物质的研究。本文研究了不同粒度麒麟菜残渣的理化性质、亚硝酸钠吸附能力和亚硝胺合成阻断能力，为人们有效开发麒麟菜残渣资源提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
耳突麒麟菜残渣，浙江上方科技有限公司，其膳食纤维含量约为91%，其中可溶性膳食纤维干基含量为0.88%，IDF干基含量为90.1%。使用超微粉碎机粉碎麒麟菜残渣得到粗样以及40、100、150、200、300目5个不同目数的样品，分别记为EC、E40、E100、E150、E200、E300。亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、二甲胺水溶液(体积分数为40%)、α-萘胺，国药化学试剂有限公司。实验中使用的所有试剂均是国产分析纯。
1.2 仪器与设备
PL2002电子精密天平，梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司；JYNU40-37M超微粉碎机，青岛捷怡纳机械科技有限公司；UV1800紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；THZ-300C恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 麒麟菜残渣粗粉和超微粉的理化性质测定
持水力[7]、膨胀力[8]和阳离子交换能力[9]分别参照文献报道的方法测定。
1.3.2 麒麟菜残渣粗粉和超微粉的亚硝酸钠吸附能力测定
1.3.2.1 亚硝酸钠标准曲线的建立
参考文献[10]的方法建立亚硝酸钠标准曲线。
1.3.2.2 麒麟菜残渣对亚硝酸钠的吸附实验
称取400 mg麒麟菜残渣粗粉和超微粉于50 mL离心管，加入4 mL 20 μg/mL的亚硝酸钠标准溶液，再加模拟胃液至20 mL(此时混合液中麒麟菜残渣添加量为20 mg/mL，亚硝酸钠的初始质量浓度为4 μg/mL)，在37 ℃、150 r/min恒温水浴中振摇4 h。
然后均选用E200进行以下实验：在不同剂量麒麟菜残渣的吸附实验中，E200的添加量分别为5、15、20、25、30、35、40 mg/mL；在不同吸附时间下的吸附实验中，时间设置为5、10、15、30、60、120、150、180、210、240、270 min；在不同亚硝酸钠初始浓度的吸附实验中，亚硝酸钠的初始浓度分别设为2、4、10、100、200、400 μg/mL。
1.3.2.3 麒麟菜残渣对亚硝酸钠吸附率的测定
参照刘星等[11]的方法，将上述振摇吸附后的反应液于4 000 r/min离心10 min，取出10 mL上清液，立即加入0.4%对氨基苯磺酸溶液2.0 mL，混匀，静置3～5 min后再加入1 mL 0.2%盐酸萘乙二胺溶液，加双蒸水至25 mL，静置15 min，在波长538 nm处测定吸光度。亚硝酸钠吸附率按公式(1)计算：
亚硝酸钠吸附率
(1)
式中：A0，无麒麟菜残渣样品(只含亚硝酸钠)的吸光度；Ai，麒麟菜残渣样品与亚硝酸钠混合液的吸光度；Aj，麒麟菜残渣样品的本底吸光度。
1.3.3 麒麟菜残渣粗粉和超微粉对亚硝胺合成阻断率的测定
参照赵二劳等[12]的方法，向15 mL离心管中加入200 mg麒麟菜残渣粗粉和超微粉，然后依次加入4 mL模拟胃液、0.4 mL 10 mmol/L的亚硝酸钠溶液、0.4 mL 10 mmol/L的二甲胺溶液，用双蒸水定容至10 mL，37 ℃振摇4 h后4 000 r/min离心10 min。吸取1.0 mL上清液加到6孔培养板中，加入质量分数为0.5%的Na2CO3溶液0.5 mL，于紫外分析仪上照15 min后，加入1.5 mL质量分数1%的对氨基苯磺酸溶液和1.5 mL质量分数0.1%的α-萘胺溶液以及0.5 mL双蒸水，摇匀后静置15 min。用紫外可见分光光度计在525 nm处测吸光度。按公式(2)计算亚硝胺合成阻断率：
亚硝胺合成阻断率
(2)
式中：A0，无麒麟菜残渣样品的吸光度；Ai，加入麒麟菜残渣样品的吸光度；Aj，麒麟菜残渣样品的本底吸光度。
1.3.4 数据处理
实验均重复3次，使用SPSS 25.0处理数据并进行显著性分析，显著性差异水平设为0.05，使用Origin软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 麒麟菜残渣粗粉和超微粉的理化性质
持水力和膨胀力是评价物质水合特性的重要指标。具有较佳的吸水膨胀特性的物质可加快肠道蠕动，并将吸附的有害物质带出体外。阳离子交换能力反映了纤维链的断裂及基团暴露程度，暴露出来的基团越多越有利于吸附有害物质。如图1所示，在麒麟菜残渣粗粉和超微粉中，粗样(EC)的持水力和膨胀力最小，分别为(4.07±0.04) g/g和(2.40±0.19) mL/g，E40持水力和膨胀力最大，分别为(5.61±0.06) g/g和(5.67±0.30) mL/g。随着超微粉碎程度的增大，持水力和膨胀力有所下降，直至基本稳定在4.9 g/g和4.5 mL/g。随着粒度减小，阳离子交换能力由EC的(0.18±0.001) mmol NaOH/g增加至E300的(0.32±0.02) mmol NaOH/g。GO
I等[13]的研究中，商业膳食纤维Fibra Leo的持水力和膨胀力分别为(3.1±0.1) g/g和(6.2±0.3) mL/g，说明麒麟菜残渣超微粉的水合特性可以与商业可用膳食纤维相媲美。
阳离子交换能力增加主要是因为发生交换反应所需的侧链基团增加，由此验证了超微粉碎破坏了纤维的网络结构，而且粉碎程度越强，暴露出来的基团越多。E40的水合性质显著提高也进一步验证了这一点，但是在继续粉碎后持水能力和膨胀力有所减小，主要是因为过度粉碎破坏了麒麟菜残渣颗粒的网络结构，从而导致水合性能轻微下降。以上结果表明麒麟菜残渣超微粉可能具有一定的吸附性能及较高的吸水膨胀性能，可以吸附肠道中的有害物质并促进其排出体外，因此其吸附性能值得进一步研究。
a-持水力和膨胀力；b-阳离子交换能力
图1 麒麟菜残渣粗粉和超微粉的理化性质
Fig.1 The physicochemical property of crude and superfine powder of Eucheuma sp.residue
注：相同指标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
2.2 麒麟菜残渣的亚硝酸钠吸附能力和亚硝化反应抑制作用
首先测定了亚硝酸钠显色反应的标准曲线。以亚硝酸钠的质量(μg)和538 nm下的吸光度(A538)分别作为横坐标和纵坐标，得出相应的回归方程：y=0.029 1x+0.000 6，R2=0.999 8，表明在0.0～12.5 μg亚硝酸钠的质量(μg)与吸光度(A538)呈良好的线性关系。
2.2.1 麒麟菜残渣的亚硝酸钠吸附能力和亚硝胺合成阻断能力
麒麟菜残渣在模拟胃液中具有较强的吸附率和阻断率，这是由于在酸性条件下，酸性基团会发生解离，这更有利于吸附的进行。如图2所示，吸附率和阻断率随着目数增加总体上呈递增趋势。E200的亚硝酸钠吸附率最高，为(92.3±1.30)%，其次是E150，为(91.3±0.65)%，其他粒度样品的吸附率为80%左右。E300对亚硝胺合成的阻断率最高，为(65.2±2.1)%，其次是EC，为(63.4±4.7)%，其他粒度样品的阻断率为60%左右。结果表明麒麟菜残渣可以有效吸附亚硝酸钠并阻断亚硝胺的合成，并且它对亚硝胺合成的阻断率比对亚硝酸钠的吸附率低，这与相关文献报道的结果一致[14-16]。
图2 麒麟菜残渣粗粉和超微粉的亚硝酸钠吸附率 和亚硝胺合成阻断率
Fig.2 The adsorption rate of sodium nitrite and blocking rate of nitrosamine synthesis by crude and superfine powder of Eucheuma sp.residue
来思彤等[17]研究了依次为0.200～0.250、0.160～0.200、0.125～0.160、0.080～0.125、0.063～0.080 mm的5种不同区间粒度紫花苜蓿上部叶皮颗粒对亚硝酸钠的吸附能力，发现随着粒度减小，对亚硝酸钠的吸附能力依次增强。而本研究中亚硝酸钠吸附率最高的是150和200目麒麟菜残渣超微粉，与紫花苜蓿吸附率最高时的粒度最为接近。因为麒麟菜残渣的亚硝酸钠吸附效果极佳，所以选择吸附效果最好的E200对其吸附亚硝酸钠的影响因素进行下一步探讨。
2.2.2 麒麟菜残渣剂量对亚硝酸钠吸附率的影响
吸附剂的用量会改变吸附亚硝酸钠活性位点的数量，对吸附过程有很大的影响。如图3所示，当麒麟菜残渣浓度较低时，它的剂量与吸附率之间呈显著的量效关系，表现为麒麟菜残渣浓度增大后吸附率迅速升高，当质量浓度为25 mg/mL时，对亚硝酸钠的吸附率可达(94.6±0.3)%，之后随麒麟菜残渣浓度增加，吸附率增加的程度逐渐变小，趋于饱和，最高可达(97.7±0.2)%。两者之间符合良好的对数曲线关系，经拟合得到方程：y=12.899 lnx+51.785，R2=0.977 8。麒麟菜残渣对亚硝酸盐达到半数吸附率所需浓度IC50为0.87 mg/mL。苏学军等[18]研究发现仙鹤草提取物对亚硝酸钠吸附率随剂量增加呈对数增长，IC50为2.35 mg/mL。本研究中麒麟菜残渣超微粉对亚硝酸钠的吸附率也随剂量增加而呈对数增加，IC50为0.87 mg/mL，表明麒麟菜残渣超微粉具有明显优于仙鹤草提取物的亚硝酸钠吸附能力。
图3 E200质量浓度对亚硝酸钠吸附率的影响
Fig.3 Effect of E200 dosage on adsorption rate of sodium nitrite
2.2.3 亚硝酸钠初始浓度的影响
为探究亚硝酸钠初始浓度(c0)对E200吸附亚硝酸钠的影响，选用2～400 μg/mL的亚硝酸钠溶液并研究了吸附等温线。由图4可知，E200的吸附量(qe)与亚硝酸钠初始浓度成正比例关系。随着亚硝酸钠初始浓度的增加，E200对亚硝酸钠的吸附量从(0.080±0.010)线性增加到(18.376±0.066) mg/g，说明在亚硝酸钠浓度较高的情况下麒麟菜残渣仍可以有效地吸附亚硝酸钠。ZHU等[4]研究了超微粉碎后的青稞麸皮膳食纤维的亚硝酸钠吸附量为(0.674±0.014) mg/g，远低于本研究的麒麟菜残渣的亚硝酸钠吸附量。
图4 亚硝酸钠初始浓度对E200吸附亚硝酸钠的影响
Fig.4 Effect of sodium nitrite initial concentration on sodium nitrite adsorption by E200
分别使用公式(3)、公式(4)对吸附数据进行Langmuir和Freundlich等温模型的线性回归拟合。
(3)
(4)
式中：kL(L/mg)和kf(mg/g)(L/mg)1/n分别为Langmuir常数和Freundlich常数，kf越大，吸附能力越大，kL越大，说明麒麟菜残渣和亚硝酸钠之间的相互作用越大。qm为最大吸附量，mg/g;1/n,吸附位点的异质性;ce，平衡时亚硝酸钠的浓度，mg/L。
拟合后的方程如公式(5)、公式(6)所示，麒麟菜残渣吸附数据与Freundlich模型(R2=0.992 6)拟合的效果优于Langmuir模型(R2=0.975 4)，Freundlich模型的1/n为1.214 6，表明麒麟菜残渣对亚硝酸钠的吸附是一个协同吸附过程。
=-0.105 3ce+5.053
(5)
lnqe=1.214 6 lnce-1.562 7
(6)
2.2.4 吸附时间的影响
为了解麒麟菜残渣对亚硝酸钠吸附达到平衡所需的时间，分别测定了E200(添加量为20 mg/mL)在模拟胃液条件下吸附亚硝酸钠5～270 min的吸附量，结果如图5所示。E200对亚硝酸钠的吸附率随时间的延长而快速上升，吸附5 min时，吸附率为(70.0±0.4)%。当处理时间延长至180 min时，吸附率明显上升，达到(87.2±1.0)%，处理时间为240 min时，吸附率升至(93.1±0.7)%，继续延长处理时间，吸附率不再上升，反而略有下降，说明在一定时间内麒麟菜残渣对亚硝酸钠的吸附效果与处理时间呈正相关。樊琛等[19]研究了芦荟凝胶在0～4 h下对亚硝酸钠的吸附率，发现1 h内吸附率快速增加到34.7%，随后吸附率的增加减缓并最终稳定在48%左右。而本研究中麒麟菜残渣超微粉E200在5 min时就可以吸附70.0%的亚硝酸钠，之后上升较慢，在4 h达到平衡，平衡时可以吸附93.1%的亚硝酸钠。
图5 吸附时间对E200吸附亚硝酸钠的影响
Fig.5 Effect of adsorption time on sodium nitrite adsorption by E200
为了更深入地了解吸附特性，利用公式(5)、公式(6)将吸附反应的动力学数据拟合到准一级和准二级动力学反应模型中，如公式(7)、公式(8)所示。
(7)
(8)
式中：k1为准一级反应速率常数，k2为准二级动力学模型速率常数，qt，“t”时刻吸附亚硝酸钠的量，mg/g；qe，平衡时吸附亚硝酸钠的量。
拟合后的方程如公式(9)、公式(10)所示，麒麟菜残渣对亚硝酸钠的吸附在准二级动力学模型上的拟合效果(R2=0.996 3)优于准一级动力学模型(R2=0.930 8)，说明可能发生化学吸附。本研究中麒麟菜残渣超微粉对亚硝酸钠的吸附与宋娟等[20]对壳聚糖质活性炭吸附亚硝酸钠拟合的结果一致，均符合Freundlich等温线模型和准二级动力学模型。
ln(qe-qt)=-0.006 8t-3.128 7
(9)
(10)
3 结论
麒麟菜残渣超微粉在模拟人体胃液下具有较强的亚硝酸钠吸附能力，其中E200的吸附效果最好。E200在5 min就可以吸附约70.0%的亚硝酸钠，之后上升较慢，在4 h达到吸附平衡，平衡时可以吸附约93%的亚硝酸钠。此外，吸附率随麒麟菜残渣超微粉剂量增加而呈对数增加，吸附一半亚硝酸钠的E200剂量为0.87 mg/mL；吸附率随亚硝酸钠浓度线性增加，在实验范围内吸附率最高可达(18.376±0.066) mg/g；麒麟菜残渣超微粉对亚硝酸钠的吸附可能是化学吸附；麒麟菜残渣具有约65%的亚硝胺合成阻断率。通过实验结果说明麒麟菜残渣可有效降低模拟胃液内亚硝酸钠的浓度，预防由亚硝酸钠引起的癌症，并且麒麟菜残渣超微粉的吸水膨胀性能达到商业膳食纤维的标准，可加快肠道蠕动，从而促进亚硝酸钠的排出。这不仅可以缓解亚硝酸钠带来的危害，而且为麒麟菜提胶残渣开辟了新用途，有助于其资源的再利用和附加值的提升。然而本文对麒麟菜残渣中主要发挥吸附和阻断作用的组成还不清晰，还需要分离提取纤维素、半纤维素、木质素等物质来做进一步的研究。
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