柑橘作为全世界种植面积最广且品种资源较为丰富的水果品种之一，素有“水果之王”的美称[1]。据资料显示，我国柑橘年产量自1978年以来始终保持稳定增长的态势，且于2020年年产量首次突破5 000万t，达到5 121.90万t，占世界柑橘总产量的50%以上[2-3]。目前，我国柑橘产量居世界第一，但其加工量占比仅为5%，这对于成熟季节相对集中的柑橘而言将会面临滞销的现象，从而造成了巨大柑橘资源的浪费。对此，提高柑橘类水果的加工量可作为解决困境的主要途径。果汁、果酱、蜜饯、罐头等为常见的柑橘加工产品，其中，柑橘汁凭借其风味独特、营养价值高等优点而逐渐成为了柑橘类水果的主要加工方向[4]。
香气物质作为消费者衡量柑橘汁品质的关键指标，是果实成熟过程中形成的次级代谢产物，其中大部分来自于氨基酸和脂肪酸的衍生物。柑橘汁中的香气物质分为两类，分别为游离态香气物质与键合态香气物质。其中，游离态香气物质可被人们直接感知，但键合态香气物质因其以糖苷键的形式存在而不易被人感知，需要在酸或酶的水解作用下才会释放出游离态芳香化合物进而被人感知达到增香的目的。近年来，研究人员对柑橘汁中游离态香气物质研究逐渐增多。XIAO等[5]从5种宽皮柑橘汁中鉴定出47种挥发性化合物并筛选出36种芳香活性物质。成传香等[6]从13种柑橘汁中共测得67种香气物质，其中以烯烃类物质种类最多，其次为醇类、酯类、醛类、酮类、酚类。ZHOU等[7]从8种宽皮柑橘汁和甜橙汁中共测得77种香气物质，筛选出41种香气活性物质，并进一步对宽皮柑橘汁、甜橙汁中香气成分在风味形成过程中的差异性进行了研究。键合态香气物质作为水果中最为重要的潜在香气源，其水解后释放的香气化合物对于平衡、改善果汁的风味至关重要[8]。目前，已有研究对不同品种葡萄、猕猴桃、刺梨汁中键合态香气物质的组成及分布差异做了较为详细的研究，并证实了键合态香气物质的水解对于水果及其加工产品的增香至关重要。但对于柑橘汁中键合态香气物质的研究则鲜有报道。对此，本试验以宽皮柑橘(椪柑、南丰蜜桔)、杂柑(沃柑、爱媛38号)、橙类(长叶香橙、脐橙)、琯溪蜜柚为原料，采用树脂吸附分离与顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(headspace solid phase microextraction-GC-MS，HS-SPME-GC-MS)相结合的方法对各类柑橘汁中键合态香气组分、游离态香气组分进行分离鉴定，并比较了各类柑橘汁中键合态、游离态挥发性化合物的组成及含量差异，为进一步提升柑橘类水果加工产品的品质提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 实验材料
本实验选用的柑橘类水果均在各自成熟期采摘，具体情况见表1。
表1 受试柑橘样品基本信息
Table 1 Information of tested citrus samples
分类种类名称来源地宽皮柑橘椪柑重庆北碚南丰蜜橘江西南丰杂柑爱媛38号重庆江津沃柑广西南宁橙类长叶香橙重庆北碚脐橙重庆北碚柚类琯溪蜜柚广东梅州
1.1.2 实验试剂
Amberlite XAD-2树脂(20～60目)，美国Supelco公司；β-D-葡萄糖苷酶(来源于杏仁，6 000 U/g)，上海瑞永公司；环己酮(≥99.9%)，阿拉丁公司；戊烷、乙醚、甲醇、NaCl(均为分析纯级)，国药集团。
1.1.3 仪器与设备
7890B/5977A气相色谱-质谱仪(配DB-5MS石英毛细管柱)，Agilent；二乙烯基苯(divinyl benzene，DVB)/碳分子筛(carbon molecular sieves, CMS)/聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)萃取头，美国Supelco公司；SQP分析天平，赛多利斯有限公司；FMC压榨机全果锥式榨汁机，西南大学柑桔研究所中试车间。
1.2 实验方法
1.2.1 柑橘汁样品制备
采用家用全果锥式榨汁机对柑橘汁样品进行榨汁，随后将果汁经100目无菌纱布过滤后存于-80 ℃超低温冰箱备用。
1.2.2 固酸比
依照GB/T 8210—2011 《柑桔鲜果检验方法》测定固酸比，按公式(1)计算：
固酸比=可溶性固形物含量/可滴定酸含量
(1)
1.2.3 Amberlite XAD-2树脂预处理
称取50 g XAD-2树脂于索式抽提器中，依次用戊烷、乙酸乙酯、甲醇分别对其进行回流处理约10 h，然后将处理后的树脂置于甲醇中保存备用。使用时采用甲醇为溶剂进行湿法装柱，此后用大约600 mL去离子水(4 mL/min)冲柱至无醇味后备用。
1.2.4 不同品种柑橘汁中游离态香气物质的萃取
参考成传香等[6]的方法，并稍作修改。准确量取5.0 mL果汁、1.0 g干燥NaCl、3 μL环己酮(甲醇稀释40倍至质量浓度为14.25 μg/mL)依次加入到20 mL螺口玻璃瓶中，顶空充氮20 s后用聚四氟乙烯隔热垫密封瓶盖旋紧备用，每个样品重复3次。顶空固相微萃取条件：40 ℃平衡20 min，插入SPME萃取头于螺口瓶顶空恒定高度处推出纤维头使其暴露30 min。
1.2.5 不同品种柑橘汁中键合态香气物质的萃取
参考陈亦欣等[9]的方法，将1.2.1得到的柑橘汁以3 mL/min流速流经1.2.3处理好的树脂柱，接着用去离子水洗柱至水澄清以除去可溶性糖和酸类物质。然后用V(乙醚)∶V(戊烷)=1∶1溶液洗柱除去游离态香气物质，再用乙醇将吸附于树脂柱上的键合态香气物质洗脱出来并收集乙醇部分，置于50 ℃下减压浓缩，用25 mL柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(pH 5.0)溶解，随后用100 mL V(乙醚)∶V(戊烷)=1∶1分3次萃取残留的游离态香气物质，剩余水相即键合态香气组分。最后，称取β-葡萄糖苷酶0.1 mL于50 mL顶空瓶中，加入上述水相，密封后38 ℃恒温水解48 h，将得到的酶解液进行GC-MS分析，步骤同1.2.4。
1.2.6 GC-MS分析
参考成传香等[6]的方法，并稍作修改。色谱条件：DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升温程序：35 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至180 ℃保持2 min，再以5 ℃/min升至240 ℃，保持2 min；进样口温度240 ℃；不分流进样；载气为He(纯度>99.999%)；载气流速1 mL/min。
质谱条件：离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；离子化方式电子电离(electron ionization，EI)；电子能量70 eV；质量范围45～400 amu。
1.2.7 定性、定量分析
定性分析：将各样品香气组分与图谱库(Flavour 2.0、NIST 2008)的检索结果进行匹配，以正构烷烃(C5～C25)保留时间为标准计算挥发性化合物的保留指数(retention index，RI)与相关文献相结合定性[10]。
定量分析：参考SHUI等[11]的方法稍作修改，采用甲醇稀释后的环己酮为内标物进行半定量分析。香气组分含量计算如公式(2)所示[7]：
(2)
式中：ω待,待测物质浓度，μg/g；S待,待测物峰面积，mAU·min；ω,环己酮浓度,μg/g；V1,环己酮体积,μL；S1,环己酮峰面积,mAU·min；V待,样品体积,μL。
1.3 数据处理
采用SPSS Statistics 17.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)，Excel 2019、SIMCA 14.1用于数据分析；Origin 2018用于图片整理。
2 结果与分析
由电子版增强出版文件附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.028946)可知，经过HS-SPME-GC-MS从宽皮柑橘(南丰蜜桔、椪柑)、橙类(脐橙、长叶香橙)、杂柑(爱媛38号、沃柑)、琯溪蜜柚4大类柑橘汁中共鉴定出127种挥发性香气物质，其中烯烃类香气物质种类最多，为50种，醇类、醛类、酯类香气物质种类也较多，分别为20、19和17种，酮类、酚类香气物质种类则较少，分别为6、5种，此与成传香等[6]的研究结果相似。此外，本试验还测得10种其他类香气化合物，包括一些常见的烷烃类物质及苯系物。
2.1 游离态挥发性组分分析
由表2可知，烯烃类物质的种类、含量在所有游离态香气物质中均远高于其他香气组分，其中烯烃类物质的含量更是占到了总游离态香气物质含量的90%以上，这与吴曲阳[12]的研究结果一致。
表2 不同品种柑橘汁中各类游离态香气物质含量
Table 2 Contents of free aroma compounds in different citrus juices
香气物质分类含量/(μg·g-1)爱媛38号琯溪蜜柚长叶橙南丰蜜橘椪柑脐橙沃柑醇类 41.972.58105.38 308.76 128.59 151.45 22.53醛类35.911.50126.33210.72121.32228.6224.76烯烃类919.7561.242 979.024 412.353 319.144 436.631 255.90酮类14.720.741.154.001.621.581.21酯类19.420.1419.9721.7714.4725.259.87酚类0.000.000.0023.132.403.510.00其他0.730.040.004.1850.890.000.00总计1 032.5066.253 231.854 984.903 638.434 847.031 314.28
如图1所示，在所有柑橘汁中，含游离态香气物质种类数由高到低的品种依次为爱媛38号、南丰蜜橘、脐橙、琯溪蜜柚、长叶香橙、椪柑、沃柑。其中，爱媛38号的游离态香气物质种类显著高于其他果汁样品，而其他果汁样品中游离态香气物质的种类差异则不显著。但对于爱媛38号而言，其游离态香气物质的含量则较低，位于所有柑橘汁中的第6位。沃柑与爱媛38号均属于杂柑，二者的游离态香气物质含量相近均远低于宽皮柑橘与橙类，且远高于琯溪蜜柚。但本试验中宽皮柑橘与橙类所含游离态香气物质的含量相近，这与成传香等[6]、周琦等[13]研究结果不符，原因可能与本批实验中所选宽皮柑橘品质较好，而橙类由于其采样地点当年的生长环境较差，果园树枝管理及肥水管理方式不善而导致其品质较差。
图1 不同品种柑橘汁中各类游离态香气物质的数量
Fig.1 Quantity of free aroma compounds in different citrus juices
固酸比作为国际通用的衡量果实鲜食品质及风味的重要指标[14]，由图2可知，宽皮柑橘(椪柑、南丰蜜橘)的固酸比要显著高于橙类(脐橙、长叶香橙)。此外，本试验中采用了可以使柑橘汁中香气物质种类更为丰富的全果机榨而并非切半式手榨的榨汁方式，且南丰蜜橘、椪柑的比表面积较大、皮质胞壁相对较薄易破裂，故融入到果汁中的香气物质种类及含量可能会更多[15]。
图2 不同品种柑橘汁中固酸比
Fig.2 Solid acid ratio in citrus juice of different varieties
柑橘汁中含量最多且最为重要的一类香气物质为烯烃类物质[16]。本试验中共鉴定出49种游离态烯烃类物质，其中爱媛38号中含有27种，沃柑、琯溪蜜柚中均含有19种，长叶香橙中含有16种，南丰蜜橘、椪柑中均含有15种。脐橙、南丰蜜橘中游离态烯烃类物质含量最高，分别为4 436.63和4 412.35 μg/g，其次为椪柑和长叶香橙，琯溪蜜柚中含量最低，仅为61.24 μg/g。爱媛38号、沃柑2种杂柑中游离态烯烃类香气物质含量均低于橙类与宽皮柑橘，而宽皮柑橘与橙类中游离态烯烃类物质则含量相近，占样品中总游离态烯烃类物质含量的比例均超过40%。柠檬烯、月桂烯、γ-松油烯、萜品油烯为所有柑橘汁样品中均被检测到的游离态烯烃类物质，且柠檬烯为众多游离态烯烃物质中含量最高的单萜类物质，其在所有样品中占总游离态香气组分含量的比例均高于55%，这与成传香等[6]的研究结果相似。月桂烯作为组成柑橘类果实香气的重要组分，其伴有辛香气味，在南丰蜜橘中含量最高，为284.42 μg/g，其次分别为脐橙、椪柑(247.95、194.91 μg/g)，琯溪蜜柚中含量最少，仅为9.95 μg/g。γ-松油烯、萜品油烯分别具有明显的木香和柑橘香味，其二者为柑橘中常见的香气物质，本试验研究发现宽皮柑橘中的γ-松油烯、萜品油烯含量远高于其他品种，其次分别为橙类和杂柑，琯溪蜜柚中γ-松油烯的含量则最少，这与ZHOU等[7]的研究结果相似。
醇类为柑橘果汁中另一类香气物质种类，在所有游离态香气物质中，共检测到17种醇类物质。其中，南丰蜜橘9种，爱媛38号8种，琯溪蜜柚、脐橙均为6种，长叶香橙、沃柑分别为5种，椪柑最少，为4种。南丰蜜橘中游离态醇类物质的含量为所有柑橘样品中最高，为308.76 μg/g，其次为脐橙151.45 μg/g，琯溪蜜柚中最少，仅为2.58 μg/g。而对于爱媛38号、沃柑2种杂柑而言，二者游离态醇类物质的含量则远低于宽皮柑橘和橙类，其中宽皮柑橘和橙类中游离态醇类物质的含量分别占到所有样品中总游离态醇类物质含量的57.45%和33.74%。芳樟醇、4-萜烯醇、α-松油醇为柑橘汁中主要的醇类香气物质。其中，赋有芳香和果香的芳樟醇含量位于4大类柑橘汁中醇类物质含量之首，这与CHENG等[17]的研究结果一致，且本试验中芳樟醇含量由高到低依次为宽皮柑橘、橙类、杂柑、琯溪蜜柚。α-松油醇为柑橘汁中常见的醇类物质之一，游离态α-松油醇在除南丰蜜橘外的样品中均被检测到，且在脐橙中含量最高，为14.08 μg/g，其次为椪柑13.78 μg/g，琯溪蜜柚中则最少，仅为0.14 μg/g。游离态4-萜烯醇在爱媛38号中含量最高，为12.85 μg/g，其次为长叶香橙10.79 μg/g，沃柑、琯溪蜜柚中含量则较少，分别为2.79和0.26 μg/g。此外，游离态正己醇、叶醇、1-辛烯-3-醇仅在琯溪蜜柚中被检测到。而游离态薄荷醇、香叶醇仅在南丰蜜橘中被检测到，且香叶醇伴有着玫瑰香及天竺葵味。
醛类作为柑橘香气物质的主要组成部分，其在橙汁风味中发挥着至关重要的作用。本试验在所有样品香气组分中，共检测出18种游离态醛类物质，其中爱媛38号含有12种，椪柑含有10种，长叶香橙、脐橙、南丰蜜橘均含有8种，琯溪蜜柚和沃柑分别含有7、6种。游离态醛类物质在脐橙、南丰蜜橘、长叶香橙、椪柑中的含量均较高，分别为228.62、210.72、126.33和121.32 μg/g，而在琯溪蜜柚中含量最低，仅为1.50 μg/g。在众多游离态醛类物质中，癸醛、壬醛为所有柑橘汁样品中均被检测到的游离态醛类香气物质，二者在杂柑中的含量远低于宽皮柑橘和橙类(二者含量相近)，远高于琯溪蜜柚，且癸醛具有典型橙子气味与甜味，壬醛具有令人愉悦的花香味[18]。此外，游离态庚醛、月桂醛仅分别在琯溪蜜柚、爱媛38号中被检测到，二者分别具有草本香及柑橘香气味。
酯类物质作为柑橘汁风味的主要贡献者，其总浓度即被建议为衡量橙汁香气强度与质量的关键指标[19]。在所有香气物质中共测得10种游离态酯类物质。其中，长叶香橙含有7种，脐橙、爱媛38号均含有5种，椪柑、沃柑均含有4种，南丰蜜橘3种，琯溪蜜柚仅为2种。脐橙中游离态酯类物质含量最高，为25.25 μg/g，其次为南丰蜜橘21.77 μg/g，而在琯溪蜜柚中含量最低仅为0.14 μg/g。赋有花香、果香的游离态乙酸香茅酯、乙酸橙花酯仅在琯溪蜜柚中未被检测到，且二者在爱媛38号、脐橙中含量最多，分别为6.99、11.37 μg/g。游离态丁酸乙酯具有着典型的果香气味，且在往常报道中被认为是最重要的酯类香气物质，但其仅在脐橙中被检测到，含量为0.43 μg/g，这与ZHOU等[7]的研究结果一致。
二氢香芹酮、香芹酮、甲基庚烯酮、(-)-宁酮、开司米酮和香叶基丙酮为所有样品香气物质中检测出的6种游离态酮类物质。其中爱媛38号含有4种，其次为琯溪蜜柚3种，长叶香橙、南丰蜜橘、椪柑、脐橙、沃柑均仅含有1种。本试验发现游离态香芹酮在所有样品中均被检测到，其作为柑橘汁品种劣变的衡量指标，对橙汁的感官往往有着负面的影响。研究发现，游离态香芹酮于爱媛38号中含量最多，为11.62 μg/g，其次为南丰蜜橘3.99 μg/g，琯溪蜜柚中含量最少，仅为0.23 μg/g。此外，长叶香橙、椪柑、脐橙、沃柑中游离态香芹酮含量相近。
本试验中共发现2种游离态酚类物质，分别为2,4-二叔丁基苯酚和百里酚。其中2,4-二叔丁基苯酚仅在脐橙中检测到，含量为3.50 μg/g。具有典型百里香油味的百里酚仅在南丰蜜橘和椪柑中检测到，且南丰蜜橘中百里酚的含量远高于椪柑[13]。
此外，在宽皮柑橘(南丰蜜橘、椪柑)、橙类(脐橙、长叶香橙)、杂柑(爱媛38号、沃柑)、琯溪蜜柚中共检测到5种其他游离态挥发性化合物，分别为正十二烷、正十三烷、正十四烷、戊基环乙烷和2-异丙基-1-甲氧基-4-甲基苯。
2.2 键合态挥发性组分分析
由图3、表3可知，所有柑橘汁样品的键合态香气成分中，醛类物质最多，为8种，其次依次为酯类物质(7种)，烯烃类物质、醇类物质(均为6种)，酚类物质(3种)，且在所有柑橘汁样品的键合态香气组分中并未检测出酮类物质。在所有柑橘汁中，含键合态香气物质种类最多的为椪柑，为16种，南丰蜜橘、脐橙、沃柑中键合态香气物质的种类均为11种，琯溪蜜柚中最少，仅为4种，这与范刚[20]的研究结果相似。
图3 不同品种柑橘汁中各类键合态香气物质的数量
Fig.3 Quantity of various bonded aroma compounds in different citrus juices
表3 不同品种柑橘汁中各类键合态香气物质含量
Table 3 Contents of various bonded aroma compounds in different citrus juices
香气物质分类含量/(μg·g-1)爱媛38号琯溪蜜柚长叶橙南丰蜜桔椪柑脐橙沃柑醇类7.040.001.011.087.1910.552.45醛类0.000.009.8015.565.642.841.04烯烃类1.360.893.2111.436.499.6216.43酯类0.740.343.450.000.0027.624.65酚类0.007.760.0012.550.770.000.00其他0.000.860.760.690.300.580.29总计9.149.8518.2341.3020.3951.2024.86
本试验中，脐橙中键合态香气物质含量最高，为51.20 μg/g，其次由高到低分别为南丰蜜橘(41.30 μg/g)、沃柑(24.86 μg/g)、椪柑(20.39 μg/g)、长叶香橙(18.23 μg/g)、琯溪蜜柚(9.85 μg/g)、爱媛38号(9.14 μg/g)。其中，烯烃类物质在所有柑橘汁中均被检测出来，其含量位于所有键合态香气组分中首位，占总键合态香气物质含量的28.25%。
本试验在所有柑橘汁样品中共检测出6种键合态烯烃类物质，分别为柠檬烯、δ-4-蒈烯、γ-松油烯、α-法尼烯、4-甲氧基苯乙烯、P-伞花烃。其中沃柑、南丰蜜橘中均含有4种，脐橙3种，椪柑2种，爱媛38号、琯溪蜜柚、长叶香橙均为1种。键合态烯烃类物质含量最高的是沃柑，为16.43 μg/g，南丰蜜橘、脐橙中含量也较高，含量分别为11.43和9.62 μg/g，其次为长叶香橙和爱媛38号，含量分别为3.21和1.36 μg/g，含量较低的品种为琯溪蜜柚，仅为0.89 μg/g。柠檬烯具有典型的柑橘气味，其在所有柑橘汁样品中均被检测到，说明柠檬烯在柑橘汁中同时以游离态、键合态2种形式存在，这与孙伶俐等[21]的研究结果一致。键合态柠檬烯在沃柑中含量最高，为8.11 μg/g，其次为南丰蜜橘8.00 μg/g，爱媛38号和琯溪蜜柚中含量则较少，分别为1.36和0.89 μg/g。γ-松油烯作为柑橘汁中常见的具有柠檬气味的香气物质，其在南丰蜜橘、沃柑中均被检测到，说明γ-松油烯在南丰蜜橘、沃柑中同时以游离态、键合态形式存在，且二者中键合态γ-松油烯的含量分别为1.00和0.68 μg/g。同样，具有柑橘香、花香的α-法尼烯仅在南丰蜜橘中以游离态、键合态形式存在,且以键合态形式存在的α-法尼烯含量为2.07 μg/g。但P-伞花烃在不同品种中存在形式则不同，其在琯溪蜜柚中以游离态的形式存在，而在脐橙、沃柑中却以键合态的形式存在，且以键合态形式存在于脐橙、沃柑中的含量分别为0.61和0.21 μg/g。δ-4-蒈烯同样以不同的存在形式存在于不同品种中，其以游离态的形式存在于爱媛38号中，以键合态的形式存在于南丰蜜橘中且含量为0.35 μg/g。此外，4-甲氧基苯乙烯仅存在且以键合态的形式存在于沃柑、脐橙、琯溪蜜柚中，含量分别为7.41、4.27和2.65 μg/g。
本试验在所有柑橘汁样品中共检测出6种键合态醇类物质，分别为仲丁醇、正辛醇、2，3-丁二醇、芳樟醇、橙花醇和顺-香芹醇。其中，椪柑中含有4种，爱媛38号3种，长叶香橙、南丰蜜橘、脐橙、沃柑均为1种，琯溪蜜柚中则未检出。键合态醇类物质含量最高的是脐橙，为10.55 μg/g，椪柑和爱媛38号含量也较高，分别为7.19和7.04 μg/g，其次为沃柑和长叶香橙，含量分别为2.45和1.01 μg/g。芳樟醇、正辛醇均为柑橘汁中携带花香和柑橘香的醇类香气物质，其中芳樟醇在长叶香橙和南丰蜜橘中同时以游离态、键合态形式存在，且以键合态形式存在的芳樟醇含量分别为1.01、1.07 μg/g。而正辛醇仅在爱媛38号中同时以游离态、键合态形式存在，且以键合态形式存在的正辛醇含量为1.30 μg/g。橙花醇作为柑橘汁中花香和果香的贡献者，其在不同品种中存在形式不同，如在南丰蜜橘、脐橙中以游离态的形式存在，而在椪柑中则以键合态的形式存在，且含量为1.61 μg/g。此外，仲丁醇、2,3-丁二醇和顺-香芹醇则仅以键合态的形式存在于柑橘汁中，其中脐橙、沃柑、爱媛38号中均检测出2,3丁二醇，且含量分别为10.54、2.45和1.13 μg/g；爱媛38号和椪柑中均检测出顺-香芹醇，含量分别为4.54和0.35 μg/g；仲丁醇仅在椪柑中检测到，含量为0.90 μg/g。
本试验在所有柑橘汁样品中共检测出7种键合态醛类物质，分别为2-己烯醛、正辛醛、壬醛、癸醛、反式-2-癸烯醛、2,4-癸二烯醛和紫苏醛，这与SUN等[22]的研究结果相似。其中，椪柑中含有7种、长叶香橙4种、南丰蜜橘3种，脐橙和沃柑均为2种，爱媛38号和琯溪蜜柚中则未检出。键合态醛类物质含量最多的为南丰蜜橘，高达15.56 μg/g，长叶香橙、椪柑含量也较高，分别为9.80和5.64 μg/g，其次为脐橙和沃柑，含量分别为2.84和1.04 μg/g。癸醛是柑橘汁中常见的醛类物质，其在南丰蜜橘、长叶香橙、脐橙、椪柑和沃柑中均同时以游离态、键合态2种形式存在，且以键合态形式存在的癸醛含量分别为9.33、2.44、1.19、0.76和0.45 μg/g。壬醛作为柑橘中花香、柑橘香的贡献者，其在南丰蜜橘、沃柑、椪柑中同时以游离态、键合态2种形式存在，且以键合态形式存在的壬醛含量分别为1.48、0.59和0.38 μg/g。具有花香味的紫苏醛在长叶香橙、椪柑中均同时以游离态、键合态2种形式存在，且以键合态形式存在的紫苏醛含量分别为1.05和0.53 μg/g。同样，反式-2-癸烯醛仅在椪柑和南丰蜜橘中检测到，且仅同时以游离态、键合态的形式存在于椪柑中。而2-己烯醛在不同品种柑橘汁中存在形式则不同，如在爱媛38号、琯溪蜜柚中以游离态的形式存在，而在长叶香橙中则以键合态的形式存在，且含量为0.51 μg/g。2,5-二甲基苯甲醛同样在不同品种柑橘汁中存在形式不同，如在爱媛38号、琯溪蜜柚、脐橙中以游离态的形式存在，而在椪柑中则以键合态的形式存在，且含量为0.54 μg/g。此外，2,4-癸二烯醛仅存在且以键合态形式存在于椪柑中，含量为0.60 μg/g。
本试验在所有柑橘汁样品中共检测出7种键合态酯类物质，且这7种酯类物质仅以键合态的形式存在于柑橘汁中，分别为(Z)-丙酸-3-己烯酯、壬酸甲酯、癸酸甲酯、辛酸甲酯、3-羟基已酸乙酯、苯甲酸甲酯和乳酸乙酯。其中，脐橙中含有4种、沃柑3种、长叶香橙2种、爱媛38号和琯溪蜜柚中均为1种，南丰蜜橘和椪柑中则未检出。键合态酯类物质含量最高的为脐橙，含量高达27.62 μg/g，其次为沃柑和长叶香橙，含量分别为4.65和3.45 μg/g，爱媛38号和琯溪蜜柚含量较少，分别为0.74和0.34 μg/g。具有典型清新风味的3-羟基己酸乙酯[13]与具有明显草药味的苯甲酸甲酯[9]均仅在脐橙中检出，含量分别为0.79和1.39 μg/g。乳酸乙酯、壬酸甲酯、辛酸甲酯均在沃柑中被检出，含量分别为3.95、0.36及0.33 μg/g。此外，(Z)-丙酸-3-己烯酯、癸酸甲酯分别仅在琯溪蜜柚和爱媛38号中检出，含量分别为0.34和0.74 μg/g。
本试验在所有柑橘汁样品中共检测出3种键合态酚类物质，分别为2,5-二叔丁基酚、2,6-二叔丁基酚和丁香酚，且丁香酚在葡萄[23]、梧桐科植物[24]中也以键合态的形式存在。其中，椪柑中含有2种，分别为2,5-二叔丁基酚和丁香酚，含量为0.55和0.22 μg/g。此外，2,6-二叔丁基酚仅在南丰蜜橘和琯溪蜜柚中被检测到，含量分别为12.55和7.76 μg/g。
此外，在所有柑橘汁样品中共检测到5种其他键合态挥发性化合物，分别为十一烷、顺-芳樟醇氧化物、1,1-二甲氧基辛烷、1-异丙烯基-3-甲基苯和邻-异丙基苯。
2.3 主成分分析(principal component analysis，PCA)
为进一步从整体上比较宽皮柑橘、橙类、杂柑和琯溪蜜柚汁中香气物质的差异性，本试验对4大类柑橘汁中目标香气化合物的含量采用PCA法进行分析，得到主成分的特征值与贡献率见表3。第F1主成分贡献率为88.54%，第F2主成分的贡献率为8.64%，2个主成分累计贡献率为97.17%，表明F1、F2两个主成分可解释原香气特征变量97.17%的方差信息。载荷值将各变量与主成分之间的相关系数得以体现，符号+/-表示其与主成分的正负相关性。结合表4、表5可知，与F1主成分呈现正相关的样品为南丰蜜橘和椪柑，其余均呈负相关，与F2主成分呈正相关的为南丰蜜橘、脐橙、长叶香橙，其余均为负相关。
表4 主成分的特征值及方差贡献率
Table 4 Eigenvalues and variance contribution rates of principal components
主成分F1F2F3F4F5F6特征值6.200 00.605 00.153 00.023 60.014 2 0.006 5贡献率/%88.537 58.636 52.192 70.337 00.202 80.093 5累计贡献率/%88.537 597.174 099.366 799.703 799.906 5100.000 0
表5 主成分载荷矩阵
Table 5 Principal component load matrix
品种F1F2南丰蜜橘0.999 50.002 7椪柑0.490 4-0.100 5脐橙-0.150 30.335 1长叶香橙-0.256 60.084 3爱媛38号-0.339 6-0.089 2沃柑-0.348 4-0.075 4琯溪蜜柚-0.395 0-0.157 0
由图4可知，宽皮柑橘、橙类、杂柑和琯溪蜜柚根据距离远近被分布在了不同的象限内，F1主成分正半轴的宽皮柑橘为1类，位于F1负半轴且位于第2主成分F2正半轴(第2象限)的橙类为1类，位于F1负半轴且位于F2负半轴(第3象限)的杂柑和琯溪蜜柚各为1类。芳樟醇、橙花醇、仲丁醇、香叶醇、香茅醛、2,4-癸二烯醛(键合态)、月桂烯、γ-榄香烯、松油烯、α-蒎烯、β-蒎烯、α-4-榄香烯(键合态)、2,5-二叔丁基酚(键合态)、丁香酚(键合态)、百里酚等香气物质在PCA图上与宽皮柑橘的距离较近，表明这些香气成分对宽皮柑橘的风味有着较大贡献，这与NJOROGE等[25]的研究结果一致。γ-松油烯、4-甲氧基苯乙烯(键合态)、正辛醛、丁酸乙酯、乙酸芳樟酯、丁酸丁酯、壬酸甲酯(键合态)、1,1-二甲氧基辛烷(键合态)等香气物质与橙类距离较近，表明这些香气成分对橙类的风味贡献较大，这与MIYAZAKI等[26]的研究结果相似。4-萜烯醇、1-辛烯-3-醇、正己醇、叶醇、庚醛、雪松烯、β-罗勒烯、紫苏烯、γ-杜松烯、大根香叶烯、(Z)-丙酸-3-己烯酯(键合态)、辛酸丁酯、甲基庚烯酮、开司米酮、顺-芳樟醇氧化物(键合态)等香气物质与琯溪蜜柚的距离较近，表明这些香气成分对琯溪蜜柚的风味起到了关键作用，这与嵇海锋等[27]的研究结果相似。同样，顺-香芹醇、L-薄荷醇、顺-薄荷醇、苯甲醛、月桂醛、1-十四烯、(+)-喇叭烯、(+)-γ-荜橙茄油烯、(+)-γ-古芸烯、2,5-二甲基苯乙烯、金合欢烯、(+)-β-芹子烯、癸酸甲酯(键合态)、二氢香芹酮、香叶基丙酮、α-愈创木酚、正十二烷等香气物质与杂柑(爱媛38号、沃柑)距离较近，表明这些香气成分与杂柑风味的联系程度较高。
图4 主成分载荷图
Fig.4 Principal component load diagram
注：编号所代表的目标香气物质如电子版附表1所示
3 结论
采用树脂吸附分离与气相色谱-质谱相结合的方法对各类柑橘汁中键合态香气组分、游离态香气组分进行了分离鉴定，共检测出键合态、游离态香气物质127种。其中烯烃类香气物质种类最多，醇类、醛类、酯类香气物质种类较多，酮类、酚类香气物质种类则较少。含量方面，烯烃类物质含量最多，其次由高到低分别为醇类、醛类、酯类、酮类、酚类。此外，以4大类柑橘汁为研究对象，对检测到的目标香气物质进行PCA，4大类柑橘汁均可被明显区分开。研究发现，杂柑中所含游离态香气物质的含量远低于宽皮柑橘和橙类(二者含量相近)，远高于琯溪蜜柚。但对于杂柑而言，其所含有的游离态香气物质种类却较为丰富，其中以爱媛38号最为丰富，且远高于其他柑橘品种(其他柑橘品种所含游离态香气物质种类数相近)。此外，宽皮柑橘所含键合态香气物质的种类数最多，其次为橙类和杂柑(二者种类数相近)，琯溪蜜柚最少。值得注意的是，研究发现，柑橘产区区域性差异及每年的气候条件和田间管理水平显著影响着柑橘的香气物质。
综上，本研究通过GC-MS结合PCA法比较了4大类柑橘汁中键合态、游离态香气物质的组成及含量的差异。仅风味特性而言，橙类与宽皮柑橘因其香气物质含量多且风味较为浓郁而更适宜于加工成为果汁，而杂柑虽然所含香气物质含量少且风味较为寡淡，但因其含有的游离态香气物质种类较为丰富而更适宜于果汁风味的调配。此外，各类柑橘汁均可以用酶解的方式达到各自增香的效果，其中以宽皮柑橘所含键合态香气物质种类最多而增香效果最佳。基于此，本研究在前期研究的基础上更为全面的分析了不同品种柑橘汁中香气物质的组成及含量差异，这为今后柑橘类果实的加工提供了更为全面的参考方案。此后，本研究将进一步通过GC-MS-O对4大类柑橘汁中键合态、游离态香气物质进行感官分析，并结合香气重组与遗漏试验重点探讨键合态香气物质对于各类柑橘汁风味的影响及键合态、游离态香气物质间的互作效应。
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