大西洋鳕(Gadus morhua)是鳕形目鳕科鳕属鱼类，作为一种蛋白质含量高、脂肪含量低、肉质致密的水产品广受欢迎，销量呈逐年递增的趋势。鳕形目鱼类品种繁多，从感官特点上难以分辨其捕捞海域、来源和种类，而不同的鱼类品种市场价格差异大，造成以次充好或标识错误的现象时有发生[1]。曾多次出现过用“油鱼”即棘鳞蛇鲭(Ruvettus pretiosus)和异鳞蛇鲭(Lepidocybium flavobrunneum)冒充“大西洋鳕鱼”的产品进行贩卖，导致消费者食用后出现过敏、腹泻的情况[2]。目前，我国鳕鱼成分鉴定标准或真伪检测方法主要有2种，均基于实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)技术[2-3]。但是，该方法需要在实验环境分区的条件下进行，对实验器皿、人员操作、防污染措施都有较高的要求[4]，且依赖复杂精密的温控设备，成本高，在一定程度上限制了它的应用场景，无法达到现场快速检测的目的[5]。因此，建立一种灵敏、操作简便、特异性强，能够快速检测大西洋鳕鱼及其相关制品的方法迫在眉睫。
本文首次研究利用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)快速鉴定大西洋鳕鱼及其制品的方法。RPA技术是模拟DNA复制机制，用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶代替传统PCR的热循环解链过程，实现了在恒定适宜温度(37～56 ℃)下核酸的快速(15～20 min)扩增[6]。作为一种新型的恒温核酸扩增技术，RPA技术与PCR技术具有相似的功能，都有较强的灵敏性和特异性，除此之外RPA技术有反应时间短，操作简便，不需精密仪器等优点[7-8]。自2006年RPA技术被发明后，已广泛应用于有害微生物检测、病毒检测以及临床诊断等重要领域，也有应用于畜禽肉类检测上的报道[9-10]，但目前还没有应用RPA技术检测水产品真伪的研究。本研究将RPA技术与侧流层析试纸条技术(lateral flow dipstick,LFD)相结合实现检测结果可视化，其原理是因RPA-LFD体系中存在核酸外切酶Ⅳ(endonuclease Ⅳ，NFO)、5′端带有荧光FAM基团的探针以及带有生物素标记的反向引物[11]，使得杂交扩增出的产物带有双标记。将稀释后的产物滴加在LFD试纸条上，双标产物会与试纸条抗FAM抗体结合，形成三元复合物，当其流经检测线时，会与检测线上的生物素抗体结合显色，可以根据检测线的显色情况判断检测样品的真伪[12]。而未杂交的产物与LFD试纸条上的抗FAM抗体结合，形成不含有生物素的两元复合物，与质控线上的抗FAM抗体的抗体结合显色[13]。
本研究基于RPA-LFD技术建立了针对大西洋鳕鱼现场快速检测的方法，具有特异性高、灵敏度强、操作简便、结果可视等优点，为大西洋鳕鱼的现场快速检测提供了技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大西洋鳕、狭鳕(Theragra chalcogramma)、南极犬牙鱼(Dissostichus eleginoides)、异鳞蛇鲭、马舌鲽(Reinhardtius hippoglossoides)等冷冻产品，京东超市及上海市农贸市场。Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒(Sangon)，上海生工生物工程有限公司；DNA恒速快速扩增试剂盒及HybriDetect试纸条、DNA恒温快速扩增WLN8230KIT试剂盒、超快速核酸WLR8203释放剂，潍坊安普未来生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
Vortex-2漩涡混匀仪，上海沪析实业有限公司；NanoDrop3300荧光分光光度计，赛默飞世尔科技公司；Centrifuge 5430小型台式高速冷冻离心机，Eppendorf艾本德；Light Cycler 480实时荧光PCR仪，瑞士Hoffmann-La Roche有限公司。
1.3 样品DNA提取
利用Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒(Sangon，B518 251-0050)提取DNA，取4条大西洋鳕的鱼肉组织各25 mg以及狭鳕、南极犬牙鱼、异鳞蛇鲭、马舌鲽的鱼肉组织各25 mg剪碎置于1.5 mL的离心管中，加入180 μL的Buffer ACL和20 μL的蛋白酶K溶液，振荡混匀置于56 ℃水浴下5 h使细胞裂解。随后加入200 μL Buffer CL和200 μL无水乙醇充分颠倒混匀，转入吸附柱收集管中，静置2 min，以10 000 r/min室温离心1 min，倒掉收集管中的废液。再将吸附柱放回收集管中，加入500 μL CW1 solution，以10 000 r/min室温离心30 s，倒掉收集管中的废液。再将吸附柱放回收集管中，加入500 μL CW2 solution，以10 000 r/min离心30 s，倒掉收集管中的废液。将吸附柱重新放回收集管中，以12 000 r/min室温离心2 min,去残留的CW2 solution。最后取出吸附柱，放入1.5 mL离心管中，加入150 μL CE Buffer静置3 min后以12 000 r/min室温离心2 min，收集DNA溶液并按照CL3036～CL3043对所提取的基因组DNA进行编号。用NanoDrop3300荧光分光光度计测定样品的DNA浓度，置于-20 ℃保存备用。
1.4 模板DNA的鉴定
利用MiFish引物[14-15]，序列如表1所示，对样品DNA线粒体基因组上的12S区域进行PCR扩增，并将产物进行一代测序，测序结果与GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)上的物种序列进行BLAST比对，鉴定样品的物种种类。鉴定结果为：CL3036～CL3039均为大西洋鳕鱼，CL3040为狭鳕鱼，CL3041为南极犬牙鱼，CL3042为异鳞蛇鲭，CL3043为马舌鲽。
表1 MiFish引物序列信息
Table 1 Sequences information of the MiFish primers
引物名称序列(5′→3′)产物长度/bpMiFish-U-FGTCGGTAAAACTCGTGCCAGCMiFish-U-RGTTTGACCCTAATCTATGGGGTGATAC172
1.5 RPA-LFD引物和探针的设计
根据我国进出口市场以及大型水产品交易市场的调研结果，选择异鳞蛇鲭、小鳞犬牙南极鱼、莫氏犬牙南极鱼、裸盖鱼、马舌鲽等常用来冒充大西洋鳕鱼的5种水产品品种，从GenBank上下载5种鱼类的线粒体基因组序列(表2)，利用PrimedRPA软件进行初步比对，筛选出基因序列中同源性相对较高的保守区域，再根据RPA引物的设计原则，利用MEGA-X工具和人工筛选，设计针对大西洋鳕鱼的高特异性引物及探针。其中下游引物5′端带有生物素标记，探针5′端用FAM基团修饰，nfo的识别位点用dSpacer(四氢呋喃，THF)修饰，3′末端用C3-Spacer标记。设计好的引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列见表3。
表2 大西洋鳕鱼和常见冒充鳕鱼的鱼类
Table 2 Atlantic cod and other popular species used for adulterated cod products
物种名称拉丁学名GenBank序列号大西洋鳕鱼Gadus morhuaNC 036931.1异鳞蛇鲭Lepidocybium flavobrunneumNC 13587小鳞犬牙南极鱼Dissostichus eleginoidesNC 100907莫氏犬牙南极鱼Dissostichus mawsoniNC 36200裸盖鱼Anoplopoma fimbriaNC 018119.1马舌鲽Reinhardtius hippoglossoides NC 111784.1
表3 大西洋鳕鱼RPA-LFD扩增引物和探针
Table 3 RPA-LFD amplifying primers and probes for Gadus morhua
引物名称序列(5′→3′)上游引物F15′-GCTGAATAATCCTTGTAATGCAATTTAA-3′下游引物R15′-(Biotin)-CTAAAGAAAGAAGAATTATTGGGG-TGATT-3′探针T15′-(FAM)-AACTTTCTCAACTTTTATAATTTTTA-AAACTAATT(dSpacer)CTTCTACCACGGTAAA-(C3 spacer)-3′上游引物F25′-CACCTTGACATTTATGTGAGCAACCTCT-3′下游引物R25′-(Biotin)-ATGTGTTCGATGAAACGCTAAGC-CTAT-3′探针T25′-(FAM)-AGTCTAAGTAAAATACTTGATTTCG-GCTCAAGAG(dSpacer)TCTGTGGTTAAAGTCC-(C3 spacer)-3′
1.6 RPA-LFD反应条件的确立
以拷贝数为103拷贝/μL的CL3036为大西洋鳕鱼DNA扩增模板，确定RPA-LFD的扩增体系。根据DNA恒温快速扩增试剂盒的操作说明书，配制含有A buffer 29.4 μL、10 μmol/L的上下游引物各2 μL、10 μmol/L的探针0.6 μL和DNA模板2μL的体系，将其振荡混匀加入B buffer 2.5 μL及灭菌去离子水11.5 μL构建50 μL的RPA反应体系，在38 ℃金属浴反应12 min。将反应产物用无菌去离子水稀释50倍，用带有抗FAM和Biotin标记的LFD试纸条对稀释后的产物进行检测。LFD试纸条上的质控线和检测线均有条带即为阳性扩增，仅质控线有条带为阴性扩增，若质控线无条带则实验结果无效。
1.7 大西洋鳕鱼RPA-LFD引物及探针筛选
以CL3036大西洋鳕鱼为阳性对照，CL3042异鳞蛇鲭为阴性对照，灭菌去离子水为空白对照，利用DNA恒温快速扩增试剂盒筛选大西洋鳕鱼RPA-LFD的最佳引物及探针。配制50 μL RPA体系，在38 ℃金属浴反应12 min，用LFD试纸条对稀释后的产物进行检测。根据已知扩增样品的物种信息判断LFD试纸条检测结果的准确性，筛选出可以特异性扩增大西洋鳕鱼的引物及探针。
1.8 RPA-LFD反应条件的优化
针对不同的目标物种所设计的引物和探针，RPA-LFD最佳反应温度和时间均有差异[16]。本实验以大西洋鳕鱼CL3036的基因组DNA作为阳性模板，以CL3042的基因组DNA为阴性模板，分别配制出5组50 μL的RPA体系，将其静置于36、38、40、44、48 ℃的金属浴中反应12 min，将扩增产物用无菌去离子水稀释50倍后滴加在LFD试纸条上，5 min后观察条带显色情况并拍照记录，确定最佳反应温度。在最优反应温度下，以大西洋鳕鱼CL3036的基因组DNA作为阳性模板，以CL3042的基因组DNA为阴性模板，设置梯度反应时间：8、10、12、14、16 min。按照RPA-LFD实验步骤，将RPA体系恒温孵育相应时间，根据LFD试纸条显色情况，确定最佳反应时间[17]。
1.9 RPA-LFD特异性的测定
在最佳反应条件下，以CL3036～CL3043的基因组DNA为模板，灭菌去离子水为空白对照，进行RPA-LFD扩增检测，验证大西洋鳕RPA-LFD检测方法的特异性。
1.10 现场快速检测市售“鳕鱼”制品
利用DNA恒温快速扩增试剂盒对20份市售带有“鳕”字的水产品进行RPA-LFD现场快速检测，鉴别其是否为大西洋鳕。在检测现场取鱼肉组织30 mg左右，将其剪碎研磨至匀浆状，取20 μL的组织样与40 μL的超快速核酸释放剂振荡混匀，用恒温可调温式保温垫作为现场实验简易热量来源装置，将其温度调节到一档：35～40 ℃，将组织样与快速核酸释放剂混合液静置于保温杯垫上5 min，使样品DNA快速释放。取混合液中的上清液2 μL作为DNA模板，配成50 μL的RPA体系。随后将保温垫温度调节到二档40～45 ℃，将50 μL的RPA体系静置于保温杯垫上反应12 min，反应产物用无菌去离子水稀释50倍后滴加在LFD试纸条进行检测。现场快速检测结果与PCR扩增后的一代测序结果进行比对，验证RPA-LFD现场快速检测结果的准确性。
2 结果与分析
2.1 RPA-LFD最佳引物和探针的确定
根据RPA引物和探针的设计原则，针对大西洋鳕鱼ND2保守区设计了2对引物及对应的探针，并以CL3036标准DNA为阳性模板，CL3042标准DNA为阴性模板，dd双蒸水为空白对照分别用2组引物及探针进行RPA-LFD扩增检测，结果如图1所示，第一对引物和探针测试结果为CL3036阳性、CL3042及空白对照为阴性，检测结果符合实验预期。利用第二对引物和探针进行扩增的CL3042阴性对照组出现假阳性，与实验预期不符。由此确定上游引物F1：5′-GCTGAATAATCCTTGTAATGCAATTTAA-3′、下游引物R1：5′-(Biotin)-CTAAAGAAAGAAGAATTATTGGGGTGATT-3′及探针T1：5′-(FAM)-AACTTTCTCAACTTTTATAATTTTTAAAACTAATT(dSpacer)CTTCTACCACGGTAAA-(C3 spacer)-3′。
图1 引物探针筛选结果
Fig.1 Result of primer and probe screening
注：1～3分别为用引物F1、R1、探针T1对CL3036、CL3042和 PCR水进行的RPA-LFD扩增实验结果图；4～6分别为用引物 F2、R2、探针T2对CL3036、CL3042和PCR水进行的 RPA-LFD扩增实验结果图
2.2 RPA-LFD检测反应条件的优化
反应温度优化实验的结果如图2所示，反应温度过高使阴性样品产生阳性条带影响实验结果，温度过低条带显色不明显，根据实验结果确定最佳温度为44 ℃。
图2 不同培养温度下的实验结果
Fig.2 Results of different incubation temperature
注：A1～A5分别为CL3036在不同的温度下的RPA-LFD实验结 果图，A1-36 ℃；A2-38 ℃；A3-40 ℃；A4-44 ℃；A5-48 ℃； B1～B5分别为CL3042在不同的温度下的RPA-LFD实验结 果图，B1-36 ℃；B2-38 ℃；B3-40 ℃；B4-44 ℃；B5-48 ℃； A6、B6为空白对照组
反应时间优化实验的结果如图3所示，反应时间低于12 min会反应不完全导致显色不明显，超过16 min会出现假阳性，故实验最佳时间确定为14 min。
图3 不同培养时间下的实验结果
Fig.3 Results of different incubation time
注：A1～A5分别为CL3036在不同的反应时间下RPA-LFD 实验结果图，A1-8 min，A2-10 min，A3-12 min， A4-14 min，A5-16 min，A6-空白对照组；B1～B5分别 为CL3042在不同的反应时间下进行的RPA-LFD实验结 果图，B1-8 min，B2-10 min，B3-12 min，B4-14 min， B5-16 min，B6-空白对照组
2.3 RPA-LFD特异性实验
对CL3036～CL3039大西洋鳕鱼、CL3040狭鳕鱼、CL3041南极犬牙鱼、CL3042异鳞蛇鲭、CL3043马舌鲽等8种水产品以及灭菌去离子水作为空白对照进行RPA-LFD扩增检测(图4)。结果表明，CL3036～CL3039出现阳性反应，其他样品均为阴性，检测结果与PCR扩增测序结果一致，证明本研究建立的大西洋鳕鱼RPA-LFD检测方法特异性良好。
图4 引物探针的特异性检测结果
Fig.4 Results of specific test of primer and probe
注：1～4-大西洋鳕鱼；5-狭鳕鱼；6-南极犬牙鱼； 7-异鳞蛇鲭；8-马舌鲽；9-灭菌去离子水
2.4 现场实时检测市售“鳕鱼”制品结果
对20份市售带有“鳕”字的水产品进行RPA-LFD现场快速检测，鉴定其是否为大西洋鳕鱼。检测样品中15份为大西洋鳕鱼，剩余5份非大西洋鳕鱼制品。随后将20份样品按序编号，利用PCR扩增进行一代测序鉴定其物种。RPA-LFD检测结果与测序结果一致，见表4。
表4 野外实时检测市售“鳕鱼”类及其他鱼类制品
Table 4 Real-time testing on “cod” and other fish products sold in the market in the field
样品编号标签成分PCR测序比对结果RPA-LFD检测结果样品编号标签成分PDR测序对比结果RPA-LFD检测结果LMSE401大西洋鳕鱼Gadus morhua阳性LMSE411大西洋鳕鱼Gadus morhua阳性LMSE402大西洋鳕鱼Gadus morhua阳性LMSE412太平洋鳕鱼Gadus morhua阳性LMSE403大西洋鳕鱼Gadus morhua阳性LMSE413大西洋鳕鱼Gadus morhua阳性LMSE404太平洋鳕鱼Gadus morhua阳性LMSE414大西洋鳕鱼Gadus morhua阳性LMSE405大西洋鳕鱼Gadus morhua阳性LMSE415大西洋鳕鱼Gadus morhua阳性LMSE406大西洋鳕鱼Gadus morhua阳性LMSE416异鳞蛇鲭Ruvettus pretiosus 阴性LMSE407大西洋鳕鱼Gadus morhua阳性LMSE417黑鳕鱼Anoplopoma fimbria阴性LMSE408太平洋鳕鱼Gadus morhua阳性LMSE418狭鳕Gadus chalcogrammus阴性LMSE409大西洋鳕鱼Gadus morhua阳性LMSE419银鳕鱼Anoplopoma fimbria阴性LMSE410大西洋鳕鱼Gadus morhua阳性LMSE420异鳞蛇鲭Ruvettus pretiosus 阴性
3 讨论
近年来，曾多次出现过将“油鱼”棘鳞蛇鲭和异鳞蛇鲭冠以“大西洋鳕鱼”的名字贩卖，消费者购买假鳕鱼食用后，发生腹泻的事件时有发生[18-19]。林霖等[20]利用SN/T 3589.7—2013对常见的鳕鱼制品进行检测，发现该技术由于需建立标准曲线容易出现假阳性，并且无法应用于抽取的全部鳕鱼制品，反应过程也需要PCR仪等高精密仪器无法做到现场实时快速检测。此外，李新光等[21]、王敏等[22]应用DNA条形码技术，对市场上随机抽取的鳕鱼制品进行检测，结果显示该方法可以检测出众多鳕鱼品种，如大西洋鳕鱼、格陵兰鳕鱼(Gadus ogac)、狭鳕、绿青鳕(Pollachius virens)等。该方法具有检测范围广、操作简单、鉴定效率高等优点，但存在混合制品获得单一的DNA条形码片段难度大，检验操作复杂，结果分析难等缺点。SAULL等[23]基于大西洋鳕鱼的cyt b基因设计出4对LAMP引物,在63 ℃下恒温扩增60 min，检测出大西洋鳕鱼。该方法特异性强、灵敏度高但是检验所需的引物设计难度大，反应时间较长，应用于鳕鱼制品的现场快速检测存在一定难度[24]。所以目前已有的检测方法由于需要大型精密实验仪器，实验操作复杂或对实验环境要求高，反应时间长等原因均无法在现场完成对大西洋鳕鱼的实时检测。
而RPA技术作为新型核酸扩增技术，具有灵敏性强、效率高、成本低、易操作等特点。研究人员只需要根据目标物种的核酸序列设计并合成RPA上、下游引物及探针，就可以利用RPA试剂盒进行RPA反应。本文所提出的RPA-LFD实验方法，是将RPA技术与侧流层析试纸条技术相结合，做到了在短时间内结果可视，不需要PCR仪等精密仪器，在控温式保温杯内即可完成扩增反应，具有灵敏性强、特异性高、易操作、能够现场快速检测等优点[25-26]。RPA试验的关键节点为设计高特异性的引物和探针，大多数常用的PCR引物、探针不适合用于RPA反应体系。目前，获得一对“好”引物的具体规则还未完全明确，也没有专门的设计软件可供使用，因此通过试验来筛选最佳引物是不可缺少的环节。本试验结果表明温度和反应时间也是重要的试验条件，温度过高、过低，或者反应时间过长、过短均可能对整个实验造成根本性的影响，因此，也需要对反应条件和体系进行优化，以达到最好的检测效果。
4 结论
综上，本研究所建立的大西洋鳕鱼RPA-LFD方法可以准确、高效地检测出大西洋鳕鱼的真伪。该方法为大西洋鳕鱼的现场快速检测提供了科学依据，具有良好的应用前景，为其他水产品现场快速检测提供了新思路。RPA-LFD技术填补了传统检测技术依赖精密实验仪器、无法完成现场快速检测的技术空缺，在现场快速检测和低资源环境检测领域存在巨大优势。但RPA技术存在引物和探针设计难度大，没有专门的设计软件，实验条件需要人为优化等局限。这需要科研人员的共同努力，不断完善RPA研究体系，为快检领域提供技术支持。未来RPA技术在突发疾病病原检测、食品质量安全检测、低资源环境检测领域会有新的突破，将会得到广泛的应用和推广。
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