莲藕(Nelumbo nucifera Gaertn)是一种具有丰富营养价值和药用价值的水生植物[1-4]。主要生长地区是长江三角洲、洞庭湖和珠江三角洲[5-6]。随人们生活水平提高,对莲藕加工产品的要求越来越高[7],莲藕加工产品有藕粉、糖藕片、藕脯、莲藕饮料等。鲜切莲藕贮藏过程中极易发生褐变,不仅严重影响莲藕的感官色泽,而且造成营养成分的大量损失,最终导致鲜切莲藕商品价值下降[8-9]。因此,延缓贮藏期间鲜切莲藕褐变对提高莲藕的经济价值至关重要。
目前果蔬褐变的研究主要集中于褐变底物与褐变相关酶方面。大量研究结果表明柠檬酸、抗坏血酸、天冬氨酸对果蔬褐变具有较好的抑制效果,因其保鲜效果较好且安全性较高而被广泛应用。酸味剂可通过抑制酶活性来降低褐变速率,其护色时间可能更长。王秋成等[10]研究表明,1.5%的柠檬酸处理具有较好的护色效果；张婷婷等[11]采用1.0%的抗坏血酸浸泡鲜切苹果3 min,发现具有较好的抑制褐变效果；刘箕箕等[12]以鲜切马铃薯为实验材料,采用1.0%的天冬氨酸进行处理,发现可维持鲜切莲藕5 d不褐变。这3种保鲜剂在各种果蔬上的应用较多,如鲜切马铃薯、鲜切冬瓜、新鲜萝卜片等,但在鲜切莲藕方面的应用较少,本实验通过前期单因素试验筛选出抑制鲜切莲藕褐变的防褐变剂为：0.6%、0.8%、1.0%无水柠檬酸,0.06%、0.08%、0.1%抗坏血酸钙,0.1%、0.2%、0.3% L-天门冬氨酸,为本次实验奠定基础。本文在前期单因素试验的基础上进行3因素3水平的响应面实验,对鲜切莲藕复合防褐变剂进行优化,进一步研究优化防褐变剂对鲜切莲藕品质的影响,并且对延缓鲜切莲藕褐变提出了新的技术要求。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
河北省邯郸市磁县的“白莲藕”购自天津市米兰生鲜超市,选择大小均匀、无病虫害、无机械损伤的莲藕作为试验试材。
冰箱,美的集团有限公司；Sigma3-30K高速离心机,德国SIGMA离心机公司；Check PiontⅡ便携式残氧仪,丹麦 Dansensor 公司；F-900便携式乙烯分析仪,美国FELIX仪器公司；CM-700 d色差仪,日本柯尼卡美能达；DDS-307A电导率仪,上海仪电科学仪器股份有限公司；Multiskcan FC酶标仪,Thermo Scientific。
甲醇、氢氧化钠、草酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、偏磷酸醋酸、硫酸、钼酸铵、三氯乙酸、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)、福林酚、碳酸钠,天津市江天化工有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 实验前处理
从市场采购新鲜鲜切莲藕,挑选品质均一的鲜切莲藕清洗田间泥土并去皮。然后沿着鲜切莲藕的横截面切成5 mm厚的切片,用蒸馏水浸泡,放置于4 ℃的冰箱中预冷15 min,取出后控干其表面水分。
1.2.2 响应面实验方法
在单因素试验的基础上,根据Box-Behnken试验设计原理,以无水柠檬酸、抗坏血酸钙和L-天门冬氨酸为自变量,褐变度为响应值,设计响应面分析实验,在前期单因素试验基础上设定实验的因素和水平值(表1)。
表1 响应面实验因素与水平
Table 1 Factor and levels of response surface test
因素编码水平-101A无水柠檬酸/%0.600.801.0B抗坏血酸钙/%0.060.080.1CL-天门冬氨酸/%0.100.200.3
分别用表1中3种防褐变剂组合的复合防褐变剂溶液浸泡3 min,取出鲜切莲藕片沥干水分,放置于实验用碗中,所有处理均进行4次重复,每个实验组16片莲藕,然后放置于4 ℃的冰箱中贮藏,贮藏96 h测定1次相关指标。
1.2.3 优化防褐变剂实验方法
分别用优化防褐变剂溶液浸泡 3 min,取出鲜切莲藕片沥干水分,放置于实验用碗中,所有处理均进行4次重复,然后放置于4 ℃的冰箱中贮藏,每2 d测定1次相关指标。
1.3 测定指标及方法
褐变度：参考李翠红等[13]的方法,A410×6；维生素C：采用钼蓝比色法测定[14],mg/100 g；总酚：采用FoLin-Ciocalteu法测定[15-16],mg/100 g；相对电导率：采用DDS-307A型电导仪测定[17],%；丙二醛(malondialdehyde,MDA)：采用TBA法测定[18],nmol/g；呼吸强度：采用静置法[19],mg/(kg·h)；乙烯生成速率：采用F-900便携式乙烯测量仪测定[18],μL/(kg·h)；还原糖含量测定：3,5-二硝基水杨酸法[20],%；多酚氧化酶活性(polyphenol oxidase,PPO)、过氧化物酶(peroxidase,POD)活性测定：参考曹建康等[20]的方法,U/g FW。
1.4 数据处理
采用Excel 2010软件对数据进行统计分析与作图；DPS软件对所测平均值进行LSD法差异显著性分析,检验其差异显著性(P<0.05为差异显著)；采用Design-Expert 8.0.6软件对实验进行3因素3水平的设计,并进行响应面分析与作图。
2 结果与分析
2.1 Box-Behnken实验
响应面实验方案及结果见表2,将实验数据进行多元回归拟合,得到以褐变度(Y)为目标函数的二次回归方程模型为：Y=0.24-0.032A-0.010B-1.250C-3.500AB+2.000AC+6.500BC+0.011A2+0.022B2+0.020C2,对该数学模型进行方差分析,以检验方程的有效性和各因子的偏回归系数。
表2 响应面设计方案和实验结果
Table 2 Design scheme and experimental results of response surface
序号A无水柠檬酸B抗坏血酸钙CL-天门冬氨酸褐变度(A410×6)1 01-10.2602-1 0-10.3023-1 0 10.2984 0 0 00.2425 0 0 00.2346 0 0 00.2347 1 1 00.2268 0-1-10.3009-1-1 00.30410 0-1 10.28211-1 1 00.29612 1-1 00.24813 0 0 00.23214 1 0-10.23215 1 0 10.23616 0 1 10.26817 0 0 00.234
实验方差分析结果显示(表3),模型极显著(P<0.000 1),其决定系数 R2=0.989 6,说明用此模型可以预测褐变度(Y)对无水柠檬酸(A)、抗坏血酸钙(B)和L-天门冬氨酸(C)3个因素的响应值。所选择的回归模型的P值<0.000 1,表明整体模型对实验结果具有显著的影响,具有可信度；而失拟项的P值为0.263 2>0.05,失拟项检验不显著,模型选择适当；该模型的决定系数为0.989 6,表明模型可信度高。另外,该回归方程的一次项A、B差异极显著,交互项BC差异显著,二次项A2、B2、C2差异极显著,从各因素的水平来看,A、B、C对鲜切莲藕褐变率的影响次序为：A>B>C,即无水柠檬酸>抗坏血酸钙>L-天门冬氨酸。
表3 实验结果方差分析表
Table 3 Analysis of variance of experimental results
变异源自由度平方和均方F值P值显著性模型90.0141.581E-00373.89<0.000 1∗∗A18.320E-0038.320E-003388.81<0.000 1∗∗B18.820E-0048.820E-00441.210.000 4∗∗C11.250E-0051.250E-0050.580.469 7AB14.900E-0054.900E-0052.290.174 0AC11.600E-0051.600E-0050.750.415 9BC11.690E-0041.690E-0047.900.026 1∗A215.472E-0045.472E-00425.570.001 5∗∗B212.019E-0032.019E-00394.36<0.000 1∗∗C211.752E-0031.752E-00381.88<0.000 1∗∗残差71.498E-0042.140E-005
续表3
变异源自由度平方和均方F值P值显著性失拟项38.900E-0052.967E-0051.950.263 2不显著纯误差46.080E-0051.520E-005总和160.014R2=0.989 6
注：*为显著性差异,P<0.05；**为极显著性差异,P<0.01
通过响应面的坡度陡峭程度和等高线图椭圆形状可以直观反映出2个因素交互作用的强弱程度,响应面坡度相对平缓说明因素间的交互作用弱,即当实验条件改变时其对响应值影响不大；反之,表明因素间的交互作用强[21]。等高线图呈椭圆表明因素的交互作用强,而圆形则相反,表明2个因素的交互作用对响应值影响不大。由图1可知,无水柠檬酸与L-天门冬氨酸的交互作用最强,其次是无水柠檬酸与抗坏血酸钙,抗坏血酸钙与L-天门冬氨酸的交互作用最弱,各因素对响应值的显著性表现为：无水柠檬酸>抗坏血酸钙>L-天门冬氨酸。
图1 褐变度的响应面和等高线图
Fig.1 Response surface and contour map of browning degree
随着无水柠檬酸、抗坏血酸钙和L-天门冬氨酸浓度的增加,褐变度逐渐降低。由Design-Expert 8.0.6响应面分析得到褐变度最佳配方为：无水柠檬酸0.962%、抗坏血酸钙0.089%和L-天门冬氨酸0.203%。考虑操作的可行性,对上述工艺条件进行修正,最佳配方为：无水柠檬酸1.0%、抗坏血酸钙0.1%和L-天门冬氨酸0.2%。对优化结果进行3次重复验证,结果显示鲜切莲藕贮藏96 h褐变度分别为0.226、0.218、0.215,基本符合预期值,即该模型与实际实验拟合良好,实验误差小,表明响应面优化配方是合理、稳定的。
由图2可知,贮藏2 d,对照和优化防褐变剂处理组间差异较小；当贮藏4 d时,对照组的莲藕发生中等褐变,而优化防褐变剂处理组维持莲藕较好的色泽；6 d时,对照的褐变程度进一步加深,优化防褐变组出现微褐。综上可得出,与对照相比,优化防褐变剂处理组可较好地抑制莲藕褐变。
图2 优化防褐变剂对鲜切莲藕感官的影响
Fig.2 Effect of optimized anti browning agent on sensory properties of fresh cut lotus root
2.2 优化防褐变剂对鲜切莲藕营养品质的影响
由图3-a可知,贮藏0 d时,鲜切莲藕的维生素C含量为54.59 mg/100 g,随着贮藏时间的延长,各组维生素C含量逐渐减少,6 d时含量最低,对照和优化防褐变剂处理组分别为33.53、37.18 mg/100 g,处理间差异显著(P<0.05),表明优化防褐变剂可较好地维持鲜切莲藕的维生素C含量。
a-维生素C；b-还原糖含量
图3 优化防褐变剂对鲜切莲藕维生素C和还原糖含量的影响
Fig.3 Effect of optimized anti browning agent on vitamin C and reducing sugar content of fresh cut lotus root
由图3-b可以看出,随着贮藏时间的延长,鲜切莲藕还原糖的含量逐渐上升,可能是鲜切莲藕生理活动较快,淀粉大量分解成糖以满足自身活动需要。贮藏前期,对照组与处理组间差异较小,在贮藏时间为6 d时,优化防褐变剂处理组还原糖含量显著低于对照(P<0.05),说明优化防褐变剂可抑制还原糖的生成。
2.3 优化褐变剂对鲜切莲藕生理指标的影响
呼吸强度是鲜切莲藕的一个重要生理指标。如图4-a所示,贮藏4 d,处理与对照之间莲藕呼吸强度差异较小,随着贮藏时间的延长,对照组莲藕呼吸强度显著高于优化防褐变剂处理组,处理间差异显著(P<0.05)。如图4-b所示,莲藕乙烯生成速率也随着贮藏时间的延长逐渐上升,贮藏时间为6 d时达到乙烯峰值,对照和处理组分别为6.347、5.041 μL/(kg·h),在整个贮藏期间：对照>优化防褐变剂处理组。综上可得出：优化防褐变剂可抑制鲜切莲藕的生理代谢,进而抑制鲜切莲藕的呼吸强度和乙烯生成速率。
MDA含量是评价果实衰老的重要指标之一,也是脂膜过氧化作用的主要产物之一,其含量的增加,是脂膜过氧化加强,膜受伤而加剧衰老的表现,其含量高低可以反映细胞膜脂过氧化的程度[22]。由图4-c可知,随着贮藏时间的延长,鲜切莲藕的MDA含量呈现上升的趋势,贮藏前期对照组的MDA含量与优化防褐变剂组差异不显著,贮藏后期差异显著(P<0.05),说明优化防褐变剂处理可以减轻莲藕膜受伤程度。相对电导率是反映组织细胞膜透性的重要指标,细胞膜相对电导率越高,说明细胞膜透性越大,膜受伤的程度也越大[22]。由图4-d可知,随着贮藏时间的延长,鲜切莲藕相对电导率逐渐升高,贮藏时间为6 d时,对照和处理组均达到最大值,分别为28.825%、26.257%,优化防褐变剂组与对照差异显著(P<0.05)。
2.4 优化防褐变剂对鲜切莲藕褐变调控的影响
鲜切莲藕的褐变属于酶促褐变,褐变度能够反映样品经过切割后的褐变程度,是果蔬中酚类物质被氧化成褐色物质的体现[23-24]。由图5-a可知,在贮藏过程中,莲藕的褐变程度逐渐加强,其中对照的褐变度最大,褐变最严重,优化防褐变剂处理组褐变度最低,褐变程度最弱。说明优化防褐变剂处理可较好地抑制鲜切莲藕的褐变,维持莲藕较好的感官色泽。
鲜切莲藕在贮藏过程中极易发生褐变,严重降低了鲜切莲藕的食用价值和商品性,从而降低其经济价值。酚类物质作为褐变底物,含量的多少与褐变密切相关。由图5-b可知,贮藏初期时莲藕总酚含量最高,为3.478 mg/100 g,随着贮藏时间推移呈现逐渐降低的趋势,优化防褐变剂处理组总酚含量始终维持较高水平,说明该处理可较好地维持莲藕的酚类物质,减少其氧化为醌,进而抑制褐变。
a-呼吸强度；b-乙烯生成速率；c-MDA含量；d-相对电导率
图4 优化防褐变剂对鲜切莲藕呼吸强度、乙烯生成速率、MDA含量、相对电导率的影响
Fig.4 Effects of optimized anti browning agent on respiration rate,ethylene production rate,malondialdehyde content and relative conductivity of fresh cut lotus root
a-褐变度；b-总酚含量；c-PPO活性；d-POD活性
图5 优化防褐变剂对鲜切莲藕褐变度、总酚含量、PPO活性和POD活性的影响
Fig.5 Effects of optimized anti browning agents on browning degree,total phenol content,PPO and POD activity of fresh cut lotus root
不同处理组鲜切莲藕的PPO活性变化趋势都是逐渐上升,莲藕鲜切后,PPO与酚类底物接触,同时切分后藕片与氧气的接触面积增大,使PPO活性增强,随着酚类物质被氧化形成醌,醌的聚合使莲藕表层组织愈合,氧气浓度降低,PPO活性又逐渐降低[25-26]。由图5-c可知,鲜切莲藕的PPO活性逐渐增加,在整个贮藏期间,对照组的酶活性最强,褐变最严重,优化防褐变剂处理组的活性最低,褐变较轻。贮藏初期PPO活性为0.667 U/g FW,6 d时,对照和优化防褐变剂处理组分别为1.667、1.467 U/g FW。说明优化防褐变剂可较好地抑制PPO酶活性,进而延缓褐变进程。
过氧化物酶是与衰老有关的酶,H2O2存在时,POD催化氧化类黄酮和酚类物质,并聚合形成褐色物质[20]。POD还会导致谷胱甘肽和抗坏血酸的氧化,加速乙烯的生成,导致果实的成熟衰老[27]。由图5-d可看出,对照和优化防褐变剂处理组的鲜切莲藕POD酶活性均逐渐上升,贮藏时间0 d时为0.385 U/g FW,贮藏末期时,对照和优化防褐变剂处理组的酶活性增幅分别为41.755%、23.154%。说明优化防褐变剂处理可较好地抑制鲜切莲藕的POD酶活性。
3 结论
本文由Design-Expert 8.0.6响应面分析得到鲜切莲藕褐变度最佳配方为：无水柠檬酸0.962%、抗坏血酸钙0.089%和L-天门冬氨酸0.203%,优化配方为：无水柠檬酸1.0%、抗坏血酸钙0.1%和L-天门冬氨酸0.2%。无水柠檬酸与L-天门冬氨酸的交互作用最强,其次是无水柠檬酸与抗坏血酸钙,抗坏血酸钙与L-天门冬氨酸的交互作用最弱,各因素对响应值的显著性表现为：无水柠檬酸>抗坏血酸钙>L-天门冬氨酸。
在冷藏过程中,优化防褐变剂可较好地维持鲜切莲藕较好的色泽,贮藏4 d时鲜切莲藕的色泽与0 d时相当,贮藏6 d时微褐,商品性略差,显著优于对照组。MDA含量和相对电导率呈现上升趋势,优化防褐变剂组低于对照组。贮藏末期对照组莲藕褐变度显著高于处理组(P<0.05)。褐变底物以及褐变相关的酶是导致褐变发生的关键,莲藕总酚含量呈现下降趋势,可能是随着褐变发生,酚类物质作为褐变底物逐渐被消耗。而褐变相关的酶PPO和POD活性呈现逐渐上升趋势,其中对照组高于优化防褐变剂处理组,说明优化防褐变剂结合冷藏可抑制褐变相关酶活性,进一步延缓褐变的发生。
综上所述,优化防褐变剂可较好地抑制鲜切莲藕褐变,减少鲜切莲藕营养成分的损失,延长贮藏期达到4 d。
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