酱香型白酒是中国传统优质白酒的代表,其中的典型代表茅台酒更是驰名中外,具有酱香突出、幽雅细腻、酒体醇厚、回味悠长、空杯留香持久等特点[1]。酱香型白酒的酿造工艺“2次投粮,9次蒸煮,8次发酵,7次取酒”及“高温制曲、高温堆积、高温发酵、高温馏酒以及生产周期长、贮存期长、用曲量大”等特殊工艺是形成酱香型白酒典型风格的重要原因[2-4]。酱香酒工艺分为坤沙、碎沙、翻沙和窜沙工艺。坤沙工艺是酱香酒工艺最好的一种,也是传统的酱香酒酿造工艺[5-6],使用大约80%完整的高粱进行酿造。碎沙工艺是指高粱全部粉碎后再进行堆积发酵后蒸馏取酒。翻沙工艺是用坤沙工艺最后一轮发酵蒸馏取酒后的酒糟,加入一些粉碎的高粱和大曲,进行发酵蒸馏出酒。窜沙工艺是用坤沙工艺完成后丢弃的酒糟,加入食用酒精,然后进行蒸馏取酒,市场上严厉打击这种工艺生产的酒[7-10]。
紫外可见光谱仪器(ultraviolet-visible spectrophotometer,UV-Vis)属于常用光谱设备,仪器便携廉价、测试简单快速,基于这一设备的白酒品牌判别方法开发较易于推广使用,因而具有较高的现场测试的应用价值,可以满足现场执法的需求。近年来,紫外光谱法在白酒品牌快速鉴别中已有应用[11]。白酒的挥发性风味化合物具有成分复杂、含量低的特性,应选择合适的分析技术进行组合,主要分析仪器有GC-MS、二维气相色谱-质谱(two-dimensional GC-MS,GC/GC-MS)；通常使用离子色谱法、高效液相色谱法、超高效液相色谱法和核磁共振法等对非挥发性组分进行检测[12]。
随着酱香酒市场的扩大,人们在辨别传统坤沙酒和碎沙、翻沙、窜沙酒,尤其是辨别窜沙酒,主要靠白酒品评专家实现人工鉴别。本研究旨在通过紫外光谱法结合GC-MS、离子色谱(ion chromatography,IC)分析辨别坤沙酱香酒与其他工艺的酱香酒,并聚类分析轮次酒与成品酒。紫外光谱的吸光度值通过应用相似度和主成分分析(principal component analysis,PCA)区别坤沙工艺酱香酒和其他工艺的酱香酒,并找出与成品酒成分相近的轮次酒。挥发性物质含量应用PCA和偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)进一步区别坤沙工艺酱香酒和其他工艺的酱香酒,明确与成品酒香气相近的轮次酒,并识别重要的标记挥发性化合物。之后,对标记挥发性化合物进行鉴定和定量,然后进行层次聚类分析以聚类不同工艺类型的酱香型白酒。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酒样取自茅台镇某知名酒厂,相关信息见表1。
表1 白酒酒样信息
Table 1 Information of the Baijiu samples
酒样编码酒精度(体积分数)/%工艺类型1轮次酒G153坤沙2轮次酒G253坤沙3轮次酒G353坤沙4轮次酒G453坤沙5轮次酒G553坤沙6轮次酒G653坤沙7轮次酒G753坤沙碎沙酒GS53碎沙翻沙酒GF53翻沙窜沙酒GC53窜沙成品酒1号J153坤沙成品酒2号J253坤沙
1.2 仪器与设备
50 mL容量瓶,河北中仪伟创试验仪器有限公司；UV-1780型紫外分光光度计,岛津企业管理(中国)有限公司；Clarus 600型GC-MS联用仪,美国PerkinElmer公司；固相微萃取进样器、固相微萃取柱(50/30 μm,DVB/CAR/PDMS),美国Supelco公司；ICS-3000型离子色谱仪：配有EluGen Cartridge 淋洗液自动发生器、电导检测器和Chrromeleon 6.80色谱工作站、Ionpac AS11-HC型分离柱(250 mm×4 mm)、Ionpac AG11-HC型保护柱(50 mm×4 mm),美国Dionex公司。
1.3 实验方法
1.3.1 紫外光谱实验方法
用蒸馏水做空白对照液,取5 mL的酒样于50 mL容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度线,然后移取适量样品在石英比色皿中在200～400 nm下进行紫外光谱扫描。
1.3.2 GC-MS对微量风味成分的定量分析
将分析酒样用超纯水降度至10%,移取一定量稀释后的酒样于20 mL的顶空瓶中,加入NaCl饱和,然后加入内标储备液,放入磁力搅拌转,密封。插入萃取头,纤维头置于距离酒样表面约20 mm的上部空间,搅拌约l5 min,在50 ℃水浴温度下萃取,先预热15 min,萃取30 min后,取出手柄,直接进样分析。
1.3.3 离子色谱法对有机酸类的定量测量
将样品稀释50倍直接进样,可直接定量含量较高且保留时间靠前的部分有机酸(如乳酸、乙酸等)；将一定量的酒样氮吹至少量,用超纯水定容至一定体积,最终浓缩4倍进样检测,可以定量含量较低且保留时间靠后的有机酸(如二元酸)。
1.3.4 GC-MS、离子色谱分析条件
气相色谱条件：DB-WAX ETR型色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱温箱升温程序：初始温度35 ℃,恒温2 min,以4 ℃/min升至230 ℃,保持7 min。进样口温度为250 ℃,载气为He,流速为1.0 mL/min,不分流。
质谱条件：电子轰击(electron impact,EI)离子源,电子能量70 eV,传输线温度240 ℃,离子源温度240 ℃,质量扫描m/z 55～500。
离子色谱条件：淋洗液流速1.0 mL/min；电导检测器检测；进样量25 μL。
1.4 数据处理
实验数据采用SIMCA 14、Origin、Microsoft Excel 2019、IBM SPSS Statistics 26.0和TBtools进行数据处理和分析。
2 结果与分析
2.1 不同工艺酱香酒的紫外光谱分析
如图1所示,酱香酒制曲酿酒工艺、酿酒原料与其他香型白酒差异较大,其中实验用酱香型3、4、5、6轮次酒、成品酒和翻沙酒的吸光度值超出了仪器检测范围,这些酒除了翻沙酒都是坤沙工艺酒。从紫外光谱曲线看,碎沙工艺酒和窜沙工艺酒是容易区分于坤沙酒的,翻沙酒不容易区分[13]。
图1 不同轮次、工艺酱香酒的紫外光谱图
Fig.1 UV spectroscopy of Maotai-flavor Baijiu with different batches and processes
在酱香酒中除含有酯类、有机酸、高级醇类等香味物质外,糠醛也是一类重要的香味成分。糠醛是一无色油状的液体,化学性质活泼,易进行氧化、缩合等反应,与空气接触会快速变成黄色,具有苦杏仁味。糠醛是芳香族的醛,结构中含有2个共辄双键,使得π→π*跃迁能量降低。当200～400 nm波长的紫外光照射酒样时,糠醛中不饱和键中的π电子吸收光波能量后跃迁到π*反键轨道上,形成吸收光谱,其在276 nm处有较强的特征吸收[14-15]。在曲线中可以明显看到有1个明显的吸收峰,假设超出检测限的吸光度A值是4,根据对应关系依次命名为F,对应的波长λ和吸光度值A如表2 所示。酱香白酒中的糠醛主要是通过酿酒辅料带入的,如麸皮、高粱壳、稻壳、玉米芯等填充辅料。不同产地、轮次、工艺的酱香型白酒因酿酒原料、气候温度、生产条件、发酵时间等不同,其糠醛含量必然存在差异。酱香型白酒的糠醛含量高于其他香型的白酒,它是区分酱香型白酒与其他香型白酒的重要依据之一[16]。
表2 最大吸光度值及对应波长
Table 2 The maximum absorbance value and corresponding wavelength
指标G1G2G3G4G5G6G7GSGFGCJ1J2A277277285289287287278277200276289289λ/nm0.565 41.306 84.000 04.000 04.000 04.000 02.377 70.665 74.000 00.171 64.000 04.000 0
PCA是1种基于最大统计学距离投影的降维方法,方法是将每个数据点仅投影到最初的几个主要成分上,以获得较低维的数据,同时保留尽可能多的数据变化。设超出仪器检测的吸光值为4,选取200～400 nm波段的吸光度值进行PCA可得,PC1为70.65%,PC2为27.336%,PC3为0.916%,前3个主成分的累积贡献率达到98.902%,能有效代表紫外光谱中所包含的吸光度值的信息,达到识别不同工艺、不同轮次酱香型白酒的目的。图2为以PC1和PC2为轴的白酒散点分布图,窜沙、碎沙、翻沙工艺的酒分布在图上方,相距范围较远,与坤沙工艺酒区别大；1、2、7轮次酒分布在左下角,分布范围较近,与成品酒的距离较远；成品酒与3、4、5、6轮次酒分布在右下角,说明在勾兑中使用的轮次酒3、4、5、6轮次酒多于1、2、7轮次酒,可初步用于酱香酒勾兑[17]。
图2 酒样吸光度值主成分分析
Fig.2 Principal component analysis of absorbance of Baijiu
2.2 不同工艺酱香酒挥发性物质分析
2.2.1 挥发性物质及主成分分析
经过GC-MS数据库对比分析,定性不同工艺酱香型白酒风味物质,其中坤沙工艺53种,翻沙工艺50种,碎沙工艺49种,窜沙工艺31种。将定性出的4种不同工艺的酱香型白酒挥发性物质进行种类分析,见图3。酱香型坤沙工艺酒的挥发性物质种类居于翻沙、碎沙、窜沙工艺酒之上,说明酱香酒的独特风味是与传统的独特的“四高”坤沙工艺分不开的。传统坤沙工艺的高温发酵、高温馏酒促进了挥发性物质产生及馏出,使传统坤沙工艺的酱香酒挥发性物质种类更多[18-19]。
图3 不同工艺类型酱香型白酒挥发性物质组成差异
Fig.3 Composition differences of volatile compounds in Maotai-flavor Baijiu of different technological types
PCA可以较好地应用于酱香型白酒不同工艺、不同轮次的分析(图4)。图4对挥发性成分的PCA与紫外吸光度值PCA(图2)还是存在较大差异。由图4可知,酱香白酒不同轮次、工艺主成分累计贡献率为49.90%,有效描述了挥发性香气物质和不同工艺、不同轮次酱香型白酒之间的复杂关系。PCA可用于区分窜沙与坤沙工艺,翻沙与成品酒位置接近,说明风味物质相近,难以区分；碎沙与3、4、5轮次酒位置相近,难以区分。
图4 酒样中挥发性物质主成分分析
Fig.4 Principal components analysis of volatile compounds in Baijiu samples
在同一95%置信区域(Hotelling T2 test)的坤沙工艺与窜沙工艺酱香酒,能较好的分开,具有非常直观的可视化区分效果,聚类趋势明显,可推测出窜沙工艺与坤沙工艺的酱香型白酒的香气与其挥发性物质组成有直接联系。
2.2.2 酱香酒不同工艺挥发性物质差异分析
把12个白酒挥发性物质观察值,由PLS-DA进行的监督多变量统计分析,以识别特定的标记化。如图5-a所示,不同工艺的的酱香酒样本在PLS-DA得分图上明显分开,轮次酒和成品酒位置相近,翻沙、碎沙、窜沙虽然相距较远,但都与坤沙酒明显分开,都位右上角。此外,还进行了置换检验(n=200),以评估判别模型是否过度拟合数据。排列测试通过改变分类变量(Y)的排序顺序来随机重新排列实验,并随机分配最多200次的Q2Y。模型良好拟合的推荐值被描述为R2Y截距=0.3和Q2Y截距<0.05[20-21]。其中,本实验置换检验的Q2Y截距值为0.966,表明模型对数据进行过度拟合。基于预测值的可变重要性(variable importance in projection val-ues,VIP)(>1.5),确定了5种挥发性化合物作为潜在的标记化合物,为苯甲醛、三甲基吡嗪、己酸乙酯、乙酸和异丁醇。其中,苯甲醛VIP最高(1.91),其他潜在标记的VIP介于1.51～1.84(图5-a)。
a-坤沙和非坤沙白酒样品的PLS-DA图；b-置换测试的执行；c-5个合格标记化合物的VIP
图5 重要的标记化合物定性定量分析
Fig.5 Identification and quantitation of marker compounds
将标记的不同工艺酱香型白酒5种差异性挥发性化合物列于表3中进行分析。酱香型白酒的传统的坤沙酿造工艺是最具特色的白酒酿造工艺,是酱香型白酒形成独特风味的关键。在酿造过程的高温堆积和高温发酵中的微生物代谢,产生多种对酒体香气有贡献的挥发性物质和一些苦味物质。异丁醇是1种会带给酒体苦味的物质,由表3可知,在坤沙工艺的酱香型酒中的相对含量是非坤沙工艺酱香型酒的1.94倍[22]。不同工艺的酱香型白酒乙酸含量差别较大,坤沙工艺酱香型白酒中乙酸的相对含量是非坤沙工艺酱香型白酒的1.74倍。
表3 不同工艺酱香型白酒标记的挥发性物质差异分析
Table 3 Analysis on the difference of volatile compounds marked by Maotai-flavor Baijiu with different processes
编号化合物摩尔质量/(g·mol-1)质量浓度/(mg·L-1)坤沙非坤沙坤沙、非坤沙酱香酒质量浓度比1苯甲醛106.122.63±2.1215.79±21.430.162己酸乙酯144.2114.70±7.1242.04±21.580.353异丁醇74.12154.35±35.0179.38±78.521.9442,3,5-三甲基吡嗪122.171.11±1.071.11±1.931.005乙酸60.053 183.70±899.971 833.56±107.871.74
为了表明定量标记化合物之间的关联,使用来自坤沙和非坤沙的酱香酒样品中定量化合物的浓度来制备热图(图6),颜色(从浅到深)指示相对强度从低到高变化。从聚类来看,窜沙工艺与碎沙工艺的酱香酒聚类为一类,翻沙工艺酱香酒是难以与坤沙酒分开,这与酱香型不同工艺酒挥发性物质PCA的结果一致。热图中可以看出碎沙、窜沙酒中苯甲醛和己酸乙酯是明显高于其他酒,与其他坤沙、翻沙工艺酒的风味差异也更加明显[23]。
图6 不同工艺酱香型白酒挥发性物质差异分析热图
Fig.6 Heatmap of differences analysis of volatile compounds in Maotai-flavor Baijiu with different processes
3 结论
研究了12种坤沙工艺的酱香型白酒和翻沙、碎沙、窜沙酱香型白酒的紫外吸收光谱。实验结果显示,通过紫外可见吸收光谱的峰形、峰高及最大吸收波长,可对12种进行了良好区分,光谱曲线相似度表明不同工艺、轮次的酱香型白酒在采样点各种组分特征吸收光谱的叠加使得紫外可见吸收光谱表现更加丰富。测定的酒样在各自酒区分的基础上同工艺不同酒类可以区分(包括轮次酒与成品酒区分、轮次酒与轮次酒区分)。设超出检测限的吸光值为4,酱香型白酒的3、4、5、6轮次酒之间,成品酒之间,成品酒2号与4、5轮次酒之间波形和峰高相似度较高。结合PCA对实验数据进行分析,结果显示,利用紫外可见吸收光谱法结合PCA可区分12种不同工艺酱香型白酒,并可初步判定成品酒与3、4、5、6轮次酒风味组成相似,可用于指导轮次酒勾兑。紫外可见吸收光谱法对不同工艺、轮次的酱香型白酒有一定的区分能力。
通过紫外可见吸收光谱对其进行区分有一定局限性。采用GC-MS与IC对酱香型酒样中挥发性物质进行检测分析,坤沙工艺53种,翻沙工艺50种,碎沙工艺49种,窜沙工艺31种。通过对挥发性物质进行PCA,发现窜沙的工艺酱香酒与坤沙的工艺酱香酒聚类趋势明显,能根据酒种的挥发性香气物质将坤沙与窜沙这2种工艺的酱香型白酒区分。除窜沙工艺的其他酱香型酒样PCA聚类离散成2大类,碎沙工艺与3、4、5轮次酒成分相聚较近,成品酒与翻沙工艺、6轮次酱香酒相聚较近,翻沙与碎沙工艺不容易区分,且6轮次酒与成品酒相聚较近,可用于指导轮次酒勾兑。PLS-DA模型中,所有测试样本都被正确地归入2组。确定重要差异标记物(VIP>1.5),然后定量为苯甲醛、三甲基吡嗪、己酸乙酯、乙酸和异丁醇。定量结果和热图分析表明,翻沙工艺被聚类分在了坤沙工艺内,表明翻沙工艺酱香难以与坤沙酒分开。碎沙工艺和窜沙工艺酱香酒的苯甲醛和己酸乙酯含量明显多于其他酒样,香味风格也与其他酒样差别较大。酱香型白酒的不同酿造工艺的区别导致了酒体中挥发性物质的差异,从而形成了不同工艺、不同轮次酱香型白酒的不同风格特点。
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