枸杞颜色鲜艳、口感较好,富含胡萝卜素、维生素及氨基酸等成分,因其较高的营养价值和药理作用作为高值产品深受大众喜爱[1-2]。研究表明,不同产地枸杞受气候、光照等因素影响品质存在较大差异[3],其市场价格差异在数倍到十倍之间。建立切实可行的枸杞产地判别方法,不仅能改善枸杞市场现状,增强消费者购买信心,而且有利于枸杞生产者进行品牌建设,提高经济利益,同时也维护了消费者的权益[4],对保护枸杞产业合理有序发展发挥一定的作用。
近年来,国内外利用稳定同位素溯源的相关研究明显增加[5]。RASHMI等[6]和OCVIRK等[7]分别研究了意大利小麦中δ13C、δ15N值和啤酒花中δ13C、δ15N、δ34S值,肯定了稳定同位素与地理环境的关系；PIANEZZE等[8]测定了意大利红皮蒜样品中δ13C、δ15N、δ2H、δ18O和δ34S 5种稳定同位素比值分析意大利样品,使用SIMCA分析软件进行主成分分析(principal component analysis,PCA)和判别(discriminant analysis,DA)分析,结合线性判别分析(linear discriminant analysis,LDA)和K近邻算法(K nearest neighbor,K-NN)等方法建立模型；KANG等[9]测定海参中δ13C、δ15N、δ2H、δ18O 4种同位素比值实现产地判别。同时,稳定同位素技术在国内也取得一定成果,张建辉等[10]测定湖南3个产地茶叶样品中5种重金属元素同位素比值,结合SAS进行聚类分析和判别分析,判别分析结果为86.96%；佘僧等[11]综述了近年来稳定同位素分析技术结合PCA、LDA和正交偏最小二乘判别分析(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis,OPLS-DA)等化学计量学方法在蜂蜜的产地识别及品种判别方面应用的研究进展。由此可见,稳定同位素技术进行高值产品的产地溯源方面应用已经较为成熟,此外,其在中药[12-13]、乳肉制品[14-15]以及谷物果蔬[16-18]等各类产品的产地判别方面也得到了广泛应用。稳定同位素以其方便、可靠、准确、高效的特点在农产品产地判别方面表现出非常乐观的应用前景。
近几年,应用色谱、色谱-质谱和红外光谱测定有机物和矿物元素对不同产地枸杞进行差异化研究的报道相对较多[19],但是利用稳定同位素进行枸杞溯源的研究并不多见。孟靖[20]测定了青海、宁夏和甘肃枸杞中柠檬烯、四甲基吡嗪等具有代表性的挥发性化合物的碳稳定同位素值;BERTOLDI等[21]测定意大利和亚洲共21份枸杞样品中5种轻稳定同位素比值以及57种矿物元素含量和14种类胡萝卜素,这些研究仍存在前处理技术要求较高、判别准确率较低以及枸杞样本量较少等局限。张森燊[22]测定枸杞以及土壤中的20种矿物元素以及同位素进行产地判别,判别模型倾向于对中宁枸杞与周边地区枸杞的区分,对青海产区尚未提及。因此,建立准确可靠的模型对枸杞主要产地进行判别是很有必要的。
本文应用稳定同位素测定了采自青海、宁夏和新疆3个地区共97份地理信息可靠的枸杞样品的5种稳定同位素比值,应用LDA和支持向量机(support vector machine,SVM)分别建立了不同产地枸杞判别模型。本文对测定的枸杞稳定同位素比值进行分析,不仅为枸杞产地鉴别提供了基础数据,而且应用有效的化学计量法建立青海、宁夏和新疆3个主产区的判别模型,为枸杞产地判别提供了有效的参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
采集地理信息来源可靠的枸杞样品97份,其中青海38份、宁夏33份、新疆26份。稳定同位素标准物质IAEA-CH-7(δ2H=-100.3‰VSMOW)、IAEA-601(δ18O=23.3‰)、USGS43(δ34S=+10.46‰,δ15N=+8.44‰)均为美国地质勘探局Reston稳定同位素实验室研制；稳定同位素标准物质炭黑GBW04407(δ13C=-22.43‰VPDB)由石油勘探开发科学研究院研制。
1.2 仪器与设备
烘箱,上海精宏实验设备有限公司；多功能料理机,九阳股份有限公司；超微量天平,梅特勒-托列多仪器上海有限公司；Flash 2000元素分析仪、Delta V Advantage稳定同位素比值质谱仪,美国赛默飞世尔公司；vario PYRO cube元素分析仪,德国 Elementar 公司；isoprime 100同位素质谱仪,英国 isoprime 公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品制备
取适量干果枸杞样品置于65 ℃烘箱中加热12～24 h[13],烘干后待枸杞冷却用料理机粉碎至粉末状态,装入100 mL样品瓶备用。
1.3.2 测定方法
碳、氮、硫同位素比值的测定：取3～5 mg粉末状枸杞样品于锡杯(5 mm×8 mm)中压实包好后直接放入元素分析仪(vario PYRO,elementar)自动进样器中,在高温下燃烧、还原,最终生成CO2、N2和SO2,经过吸附与解析的过程,按照N2、CO2、SO2的顺序先后进入同位素比率质谱仪(isoprime,elementar)进行检测。以标准物质炭黑、USGS43进行单点校正,每隔12个样品插入1个标物。仪器长期标准偏差为0.2‰。
仪器检测条件：氧化管温度为1 150 ℃,还原管温度为850 ℃,通氧时间为70 s,元素分析仪氦气吹扫流量为230 mL/min,进入质谱仪氦载气流量为100 mL/min,高纯N2、CO2、SO2(纯度>99.999%)为参考气。
氢、氧同位素比值的测定：取约4 mg粉末枸杞样品,用银杯(3.2 mm×4 mm)包好压实后放入元素分析仪(FALSA 2000,Thermo Fisher)自动进样器中,在高温下裂解成H2和CO进入同位素比率质谱仪(Delta V Advantage)进行检测。以标准物质IAEA-CH-7、IAEA-601进行单点校正,每隔6个样品插入1个标物。仪器长期标准偏差为6‰。
仪器检测条件：左炉燃烧管温度为1 450 ℃,色谱柱温度90 ℃,氦气流速100 mL/min,高纯H2和O2为参考气。
稳定同位素比值的计算如公式(1)所示：
δ‰=(R样品-R标准)/R标准×1 000
(1)
式中：R样品,测试样品中重同位素与轻同位素丰度比值,即13C/12C、15N/14N、18O/16O、2H/1H、34S/32S；R标准,国际标准样的重同位素与轻同位素丰度比值。
2 结果与分析
2.1 δ13C、δ15N、δ2H、δ18O和δ34S在不同地区枸杞中的分布
由于植物生长的气候、大气成分、海拔、土壤、地形、水源及代谢类型等因素会导致同位素在植物体内发生自然分馏效应,植物体内的同位素比值信息相应地反映植物所处的生长环境信息,基于此,稳定同位素技术在产地溯源方面得到了广泛应用。
将本文测定的不同产地枸杞样本中δ13C、δ15N、δ2H、δ18O和δ34S导入Origin软件分析,所得箱线图反映了不同产地间稳定同位素比值差异趋势,见图1。不同产地枸杞中δ13C、δ15N、δ2H、δ18O值均存在显著差异。
碳同位素比值青海地区最高,平均值为-25.43‰；其次是新疆,δ13C平均值为-26.14‰,范围为-27.46‰～-25.12‰；宁夏地区最低,38份宁夏枸杞样品碳同位素比值为-27.06‰,3个产地δ13C值为-27.71‰～-24.06‰；由图1可知,青海采样点枸杞样品δ15N值相对高于其他地区,为1.37‰～9.058‰,平均值为5.08‰,其次是宁夏和新疆,δ15N值分别为0.21‰～4.70‰、-2.64‰～3.92‰,平均值分别为2.68‰和0.62‰；不同地区枸杞中氢稳定同位素比值从高到低依次是新疆、宁夏、青海,平均值分别为-77.91‰、-92.41‰、-101.89‰；氧稳定同位素比值青海最高,平均值为33.68‰,其次是新疆和宁夏,平均值分别为31.44‰、30.72‰,相比氢稳定同位素差异范围较小；硫稳定同位素比值箱线图显示,青海、新疆、宁夏δ34S平均值分别8.10‰、7.45‰、6.84‰,由差异性分析可知,青海和宁夏枸杞δ34S值存在显著差异,新疆枸杞与青海、宁夏枸杞δ34S值无明显差异。
a-C；b-N；c-H；d-O；e-S
图1 三个产地C、N、H、O、S稳定同位素比值箱线图
Fig.1 Box-plot of stable carbon,nitrogen,hydrogen,oxygen and sulfur isotope ratios in three common wolfberry producing areas 注：不同小写字母表差异显著(P<0.05)
2.2 主成分分析
选取3个地区具有代表性的样品将数据以指数进行归一化处理,导入MPP进行主成分分析,根据第1主成分和第2主成分的得分分布图(图2)可以看出,青海和宁夏枸杞样品的距离相对较远,宁夏枸杞样品基本位于第1主成分的正半轴,青海的枸杞样品基本位于第2主成分的负半轴,因此,第1主成分可以基本将青海和宁夏地区的样品分开。新疆枸杞在第1主成分的正半轴和负半轴均有分布,但基本位于第2主成分的负半轴,前2个主成分可以解释75.29%的变量。
因子载荷值的绝对值越大,代表该同位素在主成分中的方差贡献率越大。结合该模型载荷分布图来看,第1主成分中δ13C值、δ18O值的载荷值在区别枸杞产地时方差贡献率较大,分别为60.0%和63.3%；在第2主成分中δ15N方差贡献率最大为74.1%,其次是δ2H。由图1可知,不同产地枸杞δ13C、δ18O、δ15N、δ2H值变化在同位素箱线图中差异趋势均较为明显,但不同产地枸杞中δ34S值与其他稳定同位素相比差异性相对较弱,这与主成分分析结果一致,δ13C、δ18O、δ15N、δ2H对枸杞产地判别均发挥了不同程度的作用。
■-宁夏；▲-青海；●-新疆
图2 不同地区枸杞PCA得分分布图
Fig.2 PCA score distribution of wolfberry in different regions
结合2.1分析结果,不同产地枸杞中的稳定同位素比值与各地区采样地点的地理位置以及海拔高度、降水等因素有密切的联系,采样点间环境条件的差异影响了不同产地枸杞同位素比值的差异性。
2.3 判别模型建立
在产地溯源研究中,分散的采样点及庞大的数据量需依靠化学计量学方法进行数据处理,这对结果可视化起到不可或缺的作用,无监督(PCA等)及有监督的识别方法(LDA、SVM等)均被广泛应用。
LDA是一种有监督判别方法,以投影后类内方差最小,类间方差最大的原则对样品数据进行降维,实现样品的分类。PIANEZZE等[8]应用LDA建立蒜的判别模型；与LDA类似,SVM是通过已知样品集的特点,建立分析模型应用于对未知样品集的判别,在农产品产地判别及溯源等研究领域也有着广泛的应用,判别效果较好。因此,本文选用LDA和SVM 2种算法对几个地区枸杞进行建模。
2.3.1 基于LDA的枸杞产地判别模型
应用LDA算法进行模型验证时,宁夏枸杞和青海枸杞各有1个样品被误判为新疆枸杞,判别率分别为97.4%和97.0%,LDA模型在判别新疆样品时,18个新疆样品可以被准确判别,模型验证对3个产地枸杞的整体判别率为89.7%；交叉训练时所有青海枸杞样品均能被准确识别,新疆仅有5个样品分别被误判为青海枸杞和宁夏枸杞,交叉训练模型整体的准确率为93.8%。将不同产地的枸杞样品的前2个判别函数作模型图(图3),可以直观地看出不同产地来源的枸杞有其各自的空间分布特征,其中宁夏枸杞和青海枸杞分布相对较远,新疆枸杞和宁夏、青海的枸杞均有不同程度的重合,导致新疆枸杞判别准确率较低,这可能与枸杞样本量有关,未来实验将考虑增加实验样本,提升枸杞判别的准确率。
■-宁夏；▲-青海；●-新疆
图3 三个产地枸杞样品前2个判别函数得分图
Fig.3 Scatter plots of wolfberry samples from three producing areas on the first two discriminant functions
2.3.2 基于SVM的枸杞产地判别模型
使用SVM算法在进行模型初始验证时,宁夏枸杞有1个样品被误判为新疆枸杞,模型判别率为97.4%,青海枸杞均被准确识别,判别准确率为100%,新疆枸杞有1个样品被误判别为青海枸杞,2个样品被误判为宁夏枸杞,判别率相对较低为88.5%。在模型训练的结果中,青海枸杞和宁夏枸杞均能被准确识别,新疆枸杞有3个样品被误判,与模型初始验证的结果一致。但模型初始验证和模型训练时准确率分别为95.9%和96.9%,可以实现大部分枸杞的产地甄别。由表1可知,SVM算法建立的判别模型在初始验证和模型训练的准确性相对较高,判别效果明显优于LDA模型。基于稳定同位素含量结合化学计量法建立青海、宁夏和新疆枸杞的判别模型是可行的。
表1 LDA和SVM模型预测准确率
Table 1 The accuracy of LDA and SVM models
产地LDA模型SVM模型初始验证交叉训练初始验证交叉训练宁夏97.497.497.4100判别率青海97.0100100100新疆69.280.888.588.5总体判别率89.793.995.996.9
3 结论与讨论
枸杞作为药材及养生佳品持续出现在大众视野,产地来源对其价格产生了较大影响,建立切实可行的产地判别方法尤为重要。植物中的同位素比值受气候、环境等条件的影响表现出不同的产地特征。青海、宁夏和新疆是目前枸杞的主要原产地,本文通过简便快捷的前处理过程测定枸杞中稳定同位素比值,结合化学计量法建立产地判别模型实现了这3个产地枸杞的快速判别,具有明显的优势和可行性。
枸杞是典型的C3植物,δ13C值通常为-35‰～-20‰[23],本文测定其δ13C值为-27.71‰～-24.06‰,与文献中报道的结果一致,不同产地枸杞δ13C值存在显著差异,说明了环境因素对δ13C值的影响,肯定碳同位素在判别不同产地同源植物时的作用。δ15N值变化往往会受到大气环境、土壤类型等因素的影响,较环境因素而言,化学肥料造成的土壤中含氮量不同导致δ15N值差异的影响要更大。李安等[24]在产地溯源中提到,施用有机肥的农作物样品中δ15N值明显高于施用无机化肥样品,由2.1分析结果可知,青海枸杞δ15N值明显高于宁夏和青海,近年来青海枸杞产地发展势头较好,与施用有机肥是密不可分的。
植物中δ2H值和δ18O值通常受蒸腾作用、降水和海拔等因素的影响,常用作载体进行产地溯源分析[25]。将宁夏产区枸杞中H、O同位素比值导入SPSS软件以双变量进行相关性检验,结果显示在0.01水平上相关性显著,如图4所示。这与H和O都是水的组成因素,在水循环过程中有着相似的分馏作用有关。氢稳定同位素比值通常随海拔的升高而降低,3个地区采样点海拔从高到低依次为青海、宁夏、新疆,氢稳定同位素比值从高到低依次为新疆、宁夏、青海,这与生态规律相吻合；青海枸杞氧稳定同位素比值偏高,这可能与枸杞中自身物质合成影响了氧同位素比值有关[26]。同时,3个地区采样点纬度范围相近,当地灌溉方式、降水量的差异也可能对枸杞中氧同位素比值产生不同程度的影响。溯源进程中应考虑纬度效应、海拔效应和大陆效应等多种效应的综合影响[27]。
大气中的硫化物、水源中的硫化物(包括大气降水和海洋水)、化石燃料等因素影响硫稳定同位素丰度变化,其中水源和化石燃料均通过土壤影响植物的生长,青海、宁夏和新疆地区枸杞中S同位素并未表现出显著差异,这可能与3个主产区均位于西北地区,地质结构相似有关。本文建立以同位素为依据对枸杞主产地进行判别,模型准确率较高,后续试验将考虑继续增加采样量和采样地点,以建立最优的枸杞产地溯源模型。
图4 H、O稳定同位素组成相关性分析
Fig.4 Correlation analysis of stable isotope compositions of the δ2H and δ18O
本文采用稳定同位素比率质谱仪测定了青海、宁夏和新疆3个地区份共97份枸杞样品中δ13C、δ15N、δ2H、δ18O和δ34S 5种稳定同位素比值组成。基于箱线图、单因素方差分析及主成分分析等化学计量法分析各同位素比值差异,进一步肯定各同位素在枸杞产地判别中的重要作用。结合LDA和SVM两种算法建立枸杞判别模型,SVM判别模型初始验证和模型训练的准确率分别为95.9%和96.9%,相对优于LDA模型,可为实现枸杞产地判别提供依据。
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