黄连，最早记载于《神农本草经》，为毛莨科植物黄连(Coptis chinensis Franch.，味连)、三角叶黄连(Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hisao，雅连)、云连(Coptis teeta Wall.)的干燥根茎[1-2]。黄连抗菌谱广，对各种细菌、真菌以及流感病毒均有一定的抑制作用，临床常用其进行抗菌与抗病毒[3]。雅连对生长环境要求苛刻，且药效最佳，历代都被视为黄连属的上品[4]。但由于雅连多为野生，生长慢且栽培采挖条件苛刻，目前产量较低，缺乏相关科学研究。
目前食源性疾病频发[5]，多由于各种致病菌和腐败菌的污染[6]，营养丰富的食物使得细菌更好的生长和繁殖并产生致病毒素[7]。因此为预防食源性疾病和延缓食品的腐败变质，常在食品中加入防腐保鲜剂[8]。近年来，天然食品防腐保鲜剂的研究成为热点，使用黄连等抗菌谱广、高效且持久、无毒、无残留与污染的天然植物或中草药开发天然防腐剂受到越来越多的关注[9-10]。
黄连在抑菌抗菌方面具有显著的药理活性，但不同品种、不同炮制方式的黄连对常见肠道致病菌的抑菌作用研究未见报道，黄连抑菌作用的药效物质基础研究仍然不足。本实验采用体外抑菌活性测定方法，分析比较不同品种及炮制方式的黄连对食品中常见的肠道致病菌的抑菌效果，为进一步明确黄连发挥抑菌作用的极性部位及药效物质基础提高参考，也为以黄连为原料开发天然抑菌剂提供思路。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料
味连(生品、酒制)，太极大药房温江店；雅连(生品、酒制)，四川洪雅县瓦屋山药业有限公司。
1.1.2 菌株
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium.)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)，成都中医药大学医学技术学院。
1.1.3 试剂与仪器
营养琼脂，北京奥博星生物技术有限公司；氢氧化钠、无水乙醇、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二甲亚砜，成都科隆化学品有限公司；PBS缓冲液，Life Technologies Corporation。
KH3200V超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；YM-75高压蒸汽灭菌，上海三申医疗器械有限公司；SPX-400-Ⅱ生化培养箱，上海跃进医疗器械有限公司；SW-CJ-2F超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 味连、雅连及其炮制品不同极性部位的制备
将烘干的黄连药材干燥根茎粉碎，过20目筛，称取100 g粉末，用70%甲醇水溶液超声辅助提取3次，每次1 000 mL，合并提取液，减压浓缩得粗提物浸膏。加水分散均匀，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3～4次，合并后减压浓缩得甲醇提取物(methanol extracts，ME)、石油醚部位(petroleum ether extract，PE)、乙酸乙酯部位(ethyl acetate extract，EAE)、正丁醇部位(n-butanol extract，BE)和水部位(water extract，WE)浸膏，密封保存于4 ℃冰箱[11]。
1.2.2 抗菌初筛供试药液的制备
将制备所得黄连各部位浸膏，用适量二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解并混合均匀，制成200 mg/mL的各药材不同极性部位的供试药液。
1.2.3 菌悬液的制备
在无菌操作条件下，将活化后的细菌接种到装有5 mL PBS缓冲液的试管中，制成浓度约为1×108～2×108 CFU/mL的菌悬液。
1.2.4 抑菌活性测定
在无菌环境中，将滤纸片(直径6 mm)分别浸泡于味连、雅连提取液及不同极性部位的药液中浸泡4 h，取200 μL浓度约1×108CFU/mL的菌悬液均匀涂布在冷却凝固的固体培养基上，将供试药液滤纸片和空白滤纸片(DMSO溶液浸泡)呈等边三角形贴在培养基上，37 ℃恒温培养24 h后测量抑菌圈大小。
1.2.5 最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)的测定
将味连、雅连及炮制品的甲醇粗提物用两倍稀释法制成质量浓度梯度为200、100、50、25、12.5、6.25 mg/mL的供试药液。在96孔细胞培养板各孔中加入细菌菌悬液100 μL，于37 ℃条件下过夜培养后弃去孔内液体，用无菌PBS缓冲液漂洗1次。再向各孔中加入50 μL的不同浓度供试药液和100 μL的液体培养基，在37 ℃恒温培养箱中摇床培养24 h，肉眼观察每个孔中是否产生浑浊，未见培养液浑浊的最低药物浓度即为MIC。每个梯度的供试药液重复3次，并设阴性对照组(50 μL空白溶剂)[12-13]。
2 结果与分析
2.1 抑菌效果初筛
由表1和图1可知，4种药材的提取物原液对9种肠道致病细菌都有一定的抑菌作用，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径最大，且具有显著差异(P<0.05)。4种药材对福氏志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阴沟肠杆菌也表现出较强的抑菌作用(P<0.05)。
表1 药材提取液原液对不同细菌的抑菌效果
Table 1 Antibacterial effects of extracts of different medicinal materials on different bacteria
细菌抑菌圈直径/mm生味连酒味连生雅连酒雅连金黄色葡萄球菌24.5±1.9a23.9±0.8a21.5±0.6a21.3±0.9a产气肠杆菌9.3±0.3c11.2±0.5d10.1±1.0de13.4±1.2cd肺炎克雷伯氏菌10.4±0.1c12.2±0.4cd10.7±0.3de11.7±0.6de福氏志贺氏菌15.2±1.4b15.1±2.2b14.6±0.4bc15.9±1.4b大肠杆菌10.1±0.1c10.1±0.2d9.7±0.3de9.5±0.2e鼠伤寒沙门氏菌9.2±0.3c10.1±0.5d9.0±0.2e10.2±0.2e小肠结肠炎耶尔森氏菌15.5±0.7b14.3±0.8bc12.1±1.3cd14.3±1.0bc阴沟肠杆菌11.8±2.8c10.3±0.9d15.5±2.5b14.4±0.6bc普通变形杆菌11.5±0.2c10.6±0.9d10.3±0.1de10.5±1.0e
注：n=3±s；表中同列数据后的小写英文字母用以表示数据经最小显著性差异法(least significant difference，LSD)法相互检验后差异是否呈显著，其中若首字母不同表示向下比较差异显著(P<0.05),首字母相同表示向下比较差异不显著(P>0.05)，首字母后其他字母相同表示向上比较差异不显著(P>0.05)(下同)
图1 四种药材对9种肠道致病菌的抑菌效果
Fig.1 Antibacterial effect of 4 medicinal materials on 9 kinds of intestinal pathogenic bacteria
2.2 甲醇提取物及各极性段萃取物的抑菌作用
由表2和图2可知，4种药材对金黄色葡萄球菌抑菌效果表现出一致的趋势，即ME>BE>WE>PE>EAE，表明除ME外，对金黄色葡萄球菌起抑菌效果的成分主要存在于BE和WE部位。味连与雅连相比，无论是生品还是炮制品，均表现出对金黄色葡萄球菌更强的抑菌性(P<0.05)。4种药材的ME部位、味连BE、WE部位对福氏志贺氏菌的抑菌效果最好(P<0.05)，4种药材的ME部位对福氏志贺氏菌的抑菌效果无显著差异(P>0.05)，而各极性部位有显著差异(P<0.05)。对阴沟肠杆菌的抑菌效果最强的为生雅连和酒雅连的ME和WE部位，且显著高于生味连和酒味连(P<0.05)，说明雅连对阴沟肠杆菌有更好的抑菌效果。生、酒味连及酒雅连的ME部位对小肠结肠炎耶尔森氏菌的抑菌效果最好，且酒雅连ME的抑菌效果强于生雅连ME(P<0.05)，说明雅连经酒制后，对小肠结肠炎耶尔森氏菌的抑菌效果有明显增强。酒味连ME和BE部位、酒雅连ME部位对肺炎克雷伯有最好的抑菌效果，且显著强于生品(P<0.05)，说明酒制之后的黄连对肺炎克雷伯菌有更好的抑菌效果。
通过比较味连和雅连ME部位的抑菌活性可得，味连对金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌的抑菌性强于雅连(P<0.05)，对福氏志贺氏菌、肺炎克雷伯抑菌活性两者差异不显著(P>0.05)，而对阴沟肠杆菌的抑菌性显著弱于雅连，说明黄连的品种不同，对某些特定的细菌的抑菌效果亦有不同。
经过酒制后，雅连和味连对肺炎克雷伯氏菌抑菌活性均明显增强，而对阴沟肠杆菌的抑菌活性减弱，说明炮制会影响黄连对某些细菌的抑菌效果。
4种药材的抑菌活性最强部位为ME部位，除ME外，黄连抑菌效果最强的部位主要存在于BE部位和WE部位。
表2 黄连不同炮制不同极性部位对肠道致病菌的抑菌效果
Table 2 Antibacterial effects of different polar parts of Coptis herbs on intestinal pathogenic bacterias
中药饮片部位抑菌圈直径/mm金黄色葡萄球菌福氏志贺氏菌阴沟肠杆菌小肠结肠炎耶尔森氏菌肺炎克雷伯氏菌ME23.7±0.6a∗15.4±0.8ab∗11.7±0.7c15.4±0.6a∗10.6±0.1bcdPE17.4±1.0def8.5±0.7f8.2±0.7f11.9±0.9cde10.0±0.4bcd生味连EAE10.1±0.6kl13.3±1.4bcde10.9±0.8c11.6±1.0cdef7.9±0.4gBE20.4±0.6c14.8±1.2abc∗10.6±0.9cd10.2±1.0gh10.2±0.6cdeWE17.1±0.9efg15.2±1.1ab∗8.8±0.5def10.6±0.6efgh9.8±0.2efME23.1±0.4ab∗15.2±0.9ab∗11.1±0.4c15.5±0.6a∗12.2±0.3a∗PE15.7±0.6fg8.2±0.5f8.5±0.6f12.3±0.5cd10.7±0.3bcd酒味连EAE10.6±1.0kl11.9±0.4de10.3±0.4cde10.2±0.5fgh8.4±0.3gBE19.7±0.5cd14.7±1.2abc∗10.9±0.4c12.9±0.6bc11.8±0.7ab∗WE18.7±0.8cde14.6±0.7abc∗8.7±0.5ef11.2±0.5defg10.6±0.3bcdME21.0±0.4bc15.1±0.8abc∗15.3±0.5a∗12.2±0.4cde10.9±0.4bcPE13.1±0.5hij8.6±0.4f8.7±0.7ef10.3±0.2fgh8.9±0.6fg生雅连EAE11.3±1.2jkl8.9±0.8f8.8±0.5def9.6±0.4h10.2±0.4cdBE19.6±0.7cd13.8±1.0bcd13.7±0.5ab∗11.1±0.5defg9.6±0.3efWE14.9±1.1gh11.1±0.4e14.2±0.4ab∗9.8±0.3h10.1±0.6cdeME20.9±1.1bc15.6±0.8a∗14.6±0.6ab∗14.2±0.6ab∗11.6±0.6ab∗PE12.4±1.2ijk8.3±0.2f8.8±0.5def12.9±0.3bc8.8±0.5gh酒雅连EAE9.2±0.6l9.2±0.6f9.0±0.5de10.1±0.3gh10.1±0.2cdBE19.7±1.2cd12.8±0.5cde13.5±0.8b11.8±1.0cdef10.2±0.7cdWE14.7±1.9ghi13.3±1.2bcde14.0±1.0ab∗11.4±0.4cdefg10.5±0.5c
注：*表示对不同肠道致病菌抑菌活性最佳的各极性部位(P<0.05)
2.3 最小抑菌浓度值的测定
由表3可知，4种黄连对肠道致病菌均有一定的抑菌活性，其中生味连对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强，其MIC值可达3.125 mg/mL。黄连对福氏志贺氏菌的MIC值在6.25～12.5 mg/mL左右，而对其他细菌MIC值为12.5～25 mg/mL。
a-生味连；b-酒味连；c-生雅连；d-酒雅连
图2 各黄连的不同极性部位对5种肠道致病菌的抑菌效果
Fig.2 Antibacterial effects of polar parts of different Coptis herbs on 5 kinds of intestinal pathogenic bacterias
表3 黄连提取液原液对肠道致病菌的最小抑菌浓度 单位：mg/mL
Table 3 MIC of extracts of Coptis herbs against intestinal pathogenic bacterias
中药饮片金黄色葡萄球菌福氏志贺氏菌阴沟肠杆菌小肠结肠炎耶尔森氏菌肺炎克雷伯菌生味连3.1256.25～12.512.5～2512.512.5～25酒味连6.256.25～12.512.5～2512.512.5生雅连6.2512.512.512.5～2512.5～25酒雅连6.2512.512.5～2512.512.5～25
3 结论与讨论
本实验分析比较了味连及雅连对食品中常见9种肠道致病菌的抑菌活性，结果显示，黄连表现出广谱抑菌活性，对供试菌株均有不同程度的抑菌活性，其中对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强。
研究发现黄连的品种、炮制前后都会对抑菌活性产生影响：味连对金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌的抑菌效果更佳，而雅连对阴沟肠杆菌抑菌作用更强。经过酒制后，雅连和味连对肺炎克雷伯氏菌抑菌活性均明显增强，原因可能是经过酒制，能提高多种生物碱等其他抑菌物质的溶出率[14-15]，从而影响抑菌效果，但进一步的抑菌机理和机制还有待深入探究。
4种中药饮片的抑菌活性最强的部位为ME部位，说明黄连的抑菌效果是多种抑菌物质协同作用的结果。除ME外，黄连抑菌效果最强的部位为BE和WE部位，即正丁醇部位和水部位，推测其主要的抑菌成分是与极性较大的生物碱或者酸性成分有关[16]。
实验通过比较黄连品种、炮制等因素对肠道致病菌的抑菌作用影响，但是选取的菌种、黄连的种类及炮制品的种类有限。在下一步的研究中，可进一步全面比较黄连品种和不同炮制品之间的抑菌活性差异，为后期对黄连抑菌成分的单体化合物的靶向分离及鉴定奠定基础[17-20]，以发现新的具有较强抑菌活性的天然单体化合物，进一步阐释黄连的抑菌机理，并对不同黄连品种的开发利用提供参考。
[1] 马继兴. 神农本草经辑注[M].北京:人民卫生出版社, 1995:25.
MA J X.Notes of Shen Nong′s Herbal Classics[M].Beijing:China People′s Publishing House, 1995:25.
[2] 倪林英, 陈铁柱, 方清茂.不同历史时期本草著作中四川省道地药材分布的演变[J].中国中药杂志, 2021, 46(6):1 564-1 573.
NI L Y, CHEN T Z, FANG Q M.Evolution of Sichuan Dao-di herbs recorded in ancient works of materia medica of different historical periods[J].China Journal of Chinese Materia Medica, 2021, 46(6):1 564-1 573.
[3] 周瑞, 项昌培, 张晶晶, 等.黄连化学成分及小檗碱药理作用研究进展[J].中国中药杂志, 2020, 45(19):4 561-4 573.
ZHOU R，XIANG C P, ZHANG J J, et al.Research progress on chemical compositions of Coptidis Rhizoma and pharmacological effects of berberine[J].China Journal of Chinese Materia Medica, 2020, 45(19):4 561-4 573.
[4] 吴晓青, 时晓媞, 任瑶瑶, 等.雅连炮制工艺研究及不同炮制品中7个生物碱的含量测定[J].世界科学技术-中医药现代化, 2019, 21(8):1 649-1 655.
WU X Q, SHI X T, REN Y Y, et al.Study on preparation method and determination of 7 alkaloids in different processed products of Coptidis deltoidea[J].Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology,2019, 21(8):1 649-1 655.
[5] HUSSAIN M A, DAWSON C O.Economic impact of food safety outbreaks on food businesses[J].Foods, 2013, 2(4):585-589.
[6] QUINTO E J,CARO I, VILLALOBOS-DÉLGADO L H.et al.Food safety through natural antimicrobials[J].Antibiotics, 2019, 8(4):208-238.
[7] EMMANUEL C, UDAYASHANKAR A,MISHRA J. Study on bacteriocin producing lactic acid bacteria with antibacterial and antioxidant properties isolated from plant wastes[J].Journal of Pure and Applied Microbiology, 2017, 11(2):1 033-1 038.
[8] 曾兰君, 包晓玮, 赵紫叶, 等.刺山柑萃取物抑菌活性及稳定性[J].食品与发酵工业, 2020, 46(8):131-135.
ZENG L J, BAO X W, ZHAO Z Y, et al.Study on the antibacterial activity and stability of extracts from Capparis spinosa L.[J].Food and Fermentation Industries, 2020, 46(8):131-135.
[9] 王婷婷, 李大鹏, 徐晓燕, 等.黄连、连翘对几种常见食品污染菌的体外协同抑菌效果[J].食品与发酵工业, 2011, 37(5):70-72.
WANG T T, LI D P, XU X Y, et al.The in vitro synergy of Coptis chinensis and Forsythia suspensa against several common microorganisms causing food contamination[J].Food and Fermentation Industries, 2011, 37(5):70-72.
[10] BALDE M A, TUENTER E, TRAORÉ M S, et al.Antimicrobial investigation of ethnobotanically selected Guinean plant species [J].Journal of Ethnopharmacology, 2020, 263:113232.
[11] 周吉, 陈章元, 蔡芹, 等.响应面法优化黄连-罗汉果药对中降糖成分的超声提取工艺研究[J].化学研究与应用, 2019, 31(6):1 021-1 027.
ZHOU J, CHEN Z Y, CAI Q, et al.Optimize ultrasonic-assisted extraction process of the hypoglycemic components from rhizome coptidis Sriatia grosvenorii compound by response surface method[J].Chemical Research and Application, 2019, 31(6):1 021-1 027.
[12] 钟美, 江丹, 黄亮.对改良的三种最小抑菌浓度测试方法的探讨[J].分析与检测, 2016(2):75-79.
ZHONG M, JIANG D, HUANG L.Study on three improved methods for determination of the minimum inhibitory concentration[J].Analysis and Detection, 2016(2):75-79.
[13] 谢思露, 赵茂吉, 杨朝国.水飞蓟宾对表皮葡萄球菌的抑菌机制研究[J].中药药理与临床, 2018, 34(6):58-64.
XIE S L, ZHAO M J, YANG C G.Antibacterial mechanism of Silibinin on Staphylococcus epidermidis[J].Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica， 2018, 34(6):58-64.
[14] 郭玲燕, 魏永利, 吴芳, 等.酒制黄连的研究进展[J].中国药房, 2019, 30(22):3 164-3 168.
GUO L Y, WEI Y L, WU F, et al.Research progress of wine-processed Coptis chinensis[J].China Pharmacy, 2019, 30(22):3 164-3 168.
[15] LIU Y F, WANG B, SHU S H, et al.Analysis of the Coptis chinensis genome reveals the diversification of protoberberine-type alkaloids[J].Nature Communications, 2021, 12(1):3 276-3 293.
[16] 王安琪, 袁庆军, 郭宁, 等.黄连属药用资源及其异喹啉生物碱的研究进展[J].中国中药杂志, 2021, 46(14):3 504-3 513.
WANG A Q, YUAN Q J, GUO N, et al.Research progress on medicinal resources of Coptis and its isoquinoline alkaloids[J].China Journal of Chinese Materia Medica, 2021, 46(14):3 504-3 513.
[17] 谢川东, 文燕, 曾昱伟, 等.黄连抗菌活性成分研究[J].湖北农业科学, 2018, 57(23):85-88.
XIE C D, WEN Y, ZENG Y W, et al.Antibacterial activity component of Coptis chinensis franch[J].Hubei Agricultural Sciences, 2018, 57(23):85-88.
[18] HAO Y M, HUO J H, WANG T, et al.Chemical profiling of Coptis rootlet and screening of its bioactive compounds in inhibiting Staphylococcus aureus by UPLC-Q-TOF/MS[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2020, 180:113089.
[19] LOU G H, XIONG H J, GAN Q X, et al.UPLC-Q-Orbitrap HRMS analysis of Coptis chinensis aerial parts and its regulatory activity on glucose-lipid metabolism[J].Revista Brasileira de Farmacognosia, 2021, 31(1):24-31.
[20] LU Y Z, WU N, FANG Y T, et al.An automatic on-line2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl-high performance liquid chromatography method for high-throughput screening of antioxidants from natural products[J].Journal of Chromatogr A, 2017, 1 521:100-109.