郫县豆瓣是我国有名的传统发酵调味品，拥有悠久的历史，因其色泽红亮、酯香浓厚、味道鲜美，是经典川菜必不可少的调味品之一，被誉为“川菜之魂”[1]。豆瓣曲是郫县豆瓣生产重要的半成品之一，是以蚕豆、面粉为原料，接种米曲霉培养得到的富含多种微生物及酶类的曲料。豆瓣曲采用生料制作，自然发酵的制曲方式，具有微生物数量丰富、菌群结构复杂、高酶活性的特点。制曲是郫县豆瓣生产必不可少的工序之一，目的是利用微生物在原料上生长代谢，达到各类微生物及生物酶富集的作用，便于后续发酵的启动，因此制曲是郫县豆瓣生产的关键控制点。
原料是影响传统发酵食品品质的重要因素之一，目前国内外相关研究报道较多。如成林等[2]、张清文等[3]对酒曲的研究表明不同粮食酿造的酒曲对酒的品质会有不同程度的影响。同时沈馨等[4]研究发现不同原料酿造黄酒的滋味品质存在显著差异，其中以籼糯米、粳糯米为原料酿造的黄酒品质优于大米。LEE等[5]在关于原料对醪糟品质特征影响的研究中发现，粳米制得的醪糟乙醇和总酸含量高于其他原料，小麦粉和大麦制得的醪糟分别含总糖与还原糖最高。乔鑫[6]发现不同品种大豆对黄豆酱中的挥发性物质有不同程度的影响，其中湖北孝感大豆(XG-01)和湖北汉南大豆(HN-01)酿造的黄豆酱风味更好。YAMANA等[7]在有关原料对谷物类和豆类酱油调味品成分和鲜味影响的研究中显示，谷物原料制成的酱油调味料糖类含量高，豆类原料制成的酱油调味料氨基酸含量高。目前国内关于豆瓣曲的研究主要集中在制曲工艺、菌种、有害代谢产物调控等方面，关于原料对豆瓣曲品质的影响还未见报道，因此开展相关研究十分有必要。
本研究对相同工艺下不同品种蚕豆制备豆瓣曲的理化、酶活性及微生物数量等品质指标进行差异分析，旨在通过探究不同品种蚕豆对豆瓣曲品质的影响，考察不同品种蚕豆对豆瓣酱生料制曲的适应性，筛选适宜加工郫县豆瓣的蚕豆品种，为今后郫县豆瓣酿造专用蚕豆品种的选择提供数据参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
材料：曲精购自济宁玉园生物有限公司；蚕豆由四川省农业科学院作物所提供，具体信息见表1。
试剂：碳酸钠、三氯乙酸、盐酸、氢氧化钠、乳酸、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、干酪素、福林酚试剂、硫酸铜、硫酸钾、硫酸、对硝基苯酚、乙酸钠、无水乙酸钠、乙酸、37%甲醛、乙酰丙酮、浓硫酸，均为分析纯，L-酪氨酸(生化试剂)，成都市科隆化学品有限公司；乙腈，色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司；平板计数琼脂、孟加拉红培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司。
表1 蚕豆品种信息
Table 1 Broad bean cultivars information
编号样品品种收获时间来源CH19成胡192019年5月四川省农业科学院作物所CH23成胡232019年5月四川省农业科学院作物所CDDB成都大白2019年5月四川省农业科学院作物所TCX通蚕鲜2019年5月四川省农业科学院作物所YD云豆26622019年5月四川省农业科学院作物所SCZG未知2019年5月市场自购
1.2 仪器与设备
752G紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；DZKW-4恒温水浴锅，北京中兴伟业仪器有限公司；pHSJ-4F型pH计，梅特勒型-托利多国际贸易(上海)有限公司；LC-2030 型高效液相色谱仪(配紫外检测器)、RID-20A型示差折光检测器，日本岛津制作所；Carbomix H-NP10色谱柱， 美国赛分科技有限公司；TGL-20bR冷冻离心机、TGL-20bR冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂;VORTEX-2旋涡混合器，美国GENE公司;Agilent 1260 Infinity II高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；Ultimate Amino Acid(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，月旭科技(上海)股份有限公司;TP-214型分析天平，美国Denver公司;KQ-500DE型超声波清洗仪，昆山市超市仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 豆瓣曲的制备
参考李洁芝等[8]的方法，将蚕豆瓣放入沸水中漂烫3 min后立即捞出，冷水冷却至常温，沥干水分与15%和0.003%的曲精均匀混合(以蚕豆瓣质量计)，平铺于簸箕内，铺上棉布，在30 ℃曲房内制曲48 h，每12 h翻1次，即得豆瓣曲。
1.3.2 豆瓣曲理化指标的测定
pH的测定：采用pHSJ-4F型pH计直接测定。
总酸及氨基酸态氮含量：根据GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮测定》进行测定。
还原性糖含量：采用3,5-二硝基水杨酸法[9]进行测定。
酸性、中性蛋白酶活性：参照GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》进行测定。
细菌总数的测定：根据GB 4789.2—2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》中方法进行。
霉菌、酵母菌总数的测定：根据GB 4789.15—2016《食品微生物学检验 霉菌和酵母菌计数》测定。
水分含量：根据GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》进行测定。
游离氨基酸和有机酸含量：根据李雄波[10]所建立的方法进行测定。
1.4 感官品质评价
对豆瓣曲进行感官评定，由10名具有品评经验的人员组成评品小组，对豆瓣曲的气味、颜色各方面进行感官评价，满分40分，具体感官评价标准见表2。
表2 豆瓣曲感官评价指标
Table 2 Sensory evaluation index of bean paste koji
指标描述及评分孢子/菌丝状态(10分)孢子较少,菌丝不明显或没有菌丝(1～3)长满浅黄色孢子,分布均匀(4～7)孢子丰满,呈金黄色,分布均匀(8～10)外形(10分)外形不完整,碎粒多(1～3)外形完整,有部分碎粒(4～7)外形完整,无碎粒(8～10)颜色(10分)曲芯外层泛黄,内部呈乳白色(1～3)曲芯外层为黄色,内层浅黄(4～7)曲芯内外呈丰满的黄色(8～10)气味(10分)曲香味淡,有异味(1～3)曲香较淡,无异味(4～7)曲香浓郁无异味(8～10)质地(10分)较硬,蓬松度差(1-3)较软且蓬松(4～7)柔软且蓬松(8～10)综合评分(50分)差(<25分)良(25～40分)优(>40分)
1.5 数据处理
每次数据采集分别选择3个制曲平行样，对指标进行平行检测，采用Excel 2016 进行原始数据处理，结果采用“平均值±标准差”表示。用Origin 2108、SIMCA14.1作图，IBM SPSS Statistics 23对数据进行S-N-K两两比较和LSD单因素差异分析，显著水平定为0.05，置信区间为95%。
2 结果与分析
2.1 不同品种蚕豆成曲微生物数量差异分析
细菌、霉菌和酵母菌是制曲过程中的重要微生物，同时也是郫县豆瓣发酵过程中主要菌种，对甜瓣子发酵阶段影响较大。由图1可知，豆瓣曲中细菌、霉菌和酵母菌数量差异明显(P<0.05)，不同品种蚕豆成曲中细菌是主要微生物，与前人研究中细菌的数量特征一致[11]；SCZG、CH23、TCX和CH19豆瓣曲中细菌数量较高，YD和CDDB豆瓣曲中细菌数量相对较低；豆瓣曲中霉菌数量较多，不同品种间霉菌数量差异较小；不同品种蚕豆成曲中酵母菌数量存在显著差异，其中YD和SCZG豆瓣曲中酵母菌数量显著低于其他品种豆瓣曲。有资料显示碳源是限制微生物生长的第一因素，其主要为微生物生长提供能量，而侯美玲等[12]研究发现可溶性淀粉为最佳碳源，不同品种豆瓣曲中微生物数量出现差异，可能与蚕豆中可溶性淀粉、葡萄糖含量有直接关系，从而导致豆瓣曲的风味、色泽出现差异。
图1 不同品种蚕豆制曲成曲微生物指标
Fig.1 Microbial indexes of different cultivars of broad bean into koji 注：不同字母表示差异显著(下同)
2.2 不同品种蚕豆成曲酶活性差异分析
制曲的主要目的就是利用各种微生物在原料基质上生长繁殖，积累淀粉酶，蛋白酶等重要生物酶，这些生物酶对甜瓣子发酵阶段风味物质的形成有重要影响。由图2-A所示，各豆瓣曲中淀粉酶活性差异明显，CH19豆瓣曲淀粉酶活性最高，CH23、CDDB和TCX豆瓣曲淀粉酶活性差异不明显；SCZG和YD豆瓣曲的淀粉酶活性最低，这与王翠玲等[13]有关淀粉酶活性差异分析结果一致。
由图2-B可知，豆瓣曲中性蛋白酶活性远远高于酸性蛋白酶活性，表明制曲过程中米曲霉主要分泌中性蛋白酶，这与李峰等[14]研究结果一致。不同品种蚕豆制备的豆瓣曲之间中性蛋白酶活性差异显著(P<0.05)，其中CH23、CDDB豆瓣曲的中性蛋白酶活性相对较高，其次是CH19和YD豆瓣曲，TCX、SCZG豆瓣曲的中性蛋白酶活性较低；豆瓣曲中酸性蛋白酶活性整体较低，而郫县豆瓣发酵处于低酸状态下，因此酸性蛋白酶可能在后续发酵过程中发挥较大的作用。
2.3 不同品种蚕豆成曲有机酸含量
有机酸作为豆瓣重要的风味物质，通常由微生物代谢和大分子物质水解产生，但制曲的环境、体系中微生物种类以及原料对有机酸的生成有影响[15]。由图3可知，豆瓣曲中主要检测出6种有机酸，包括草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、乳酸以及乙酸。其中柠檬酸、琥珀酸、乳酸以及乙酸是豆瓣中的主要呈酸物质[16]，苹果酸为豆瓣曲中主要有机酸，在CH23豆瓣曲中含量最高，CH19和SCZG豆瓣曲次之，TCX最少；酒石酸、柠檬酸、草酸含量相对较高，在各豆瓣曲中均有检测出，但CH19豆瓣曲不含酒石酸，资料显示柠檬酸与苹果酸以及酒石酸共同作用可使豆瓣味道更浑厚饱满[17]；豆瓣曲中乳酸和乙酸含量相对较少，乙酸只在CH19和TCX豆瓣曲中检测出，有机酸含量有较大差异，其主要与豆瓣曲发酵过程中各微生物的生存活动状态[18]以及原料中碳源物质含量[19]有关。
A-淀粉酶活性；B-蛋白酶活性
图2 不同品种蚕豆制曲成曲淀粉酶活性和蛋白酶活性
Fig.2 The activity of amylase and proteaseof different cultivars of broad bean into koji
图3 不同品种蚕豆制曲成曲有机酸含量
Fig.3 Organic acid content of different cultivars of broad bean into koji
2.4 不同品种蚕豆制曲游离氨基酸含量
氨基酸是一种重要的呈味物质，其种类反应了原料中蛋白质的组成，小分子呈味肽赋予豆瓣独特的风味和口感，以鲜味、甜味、苦味为主的游离氨基酸影响着豆瓣的风味[20]。由图4可知，在豆瓣曲中检测出17种氨基酸，且含量差异较明显；豆瓣曲中谷氨酸、亮氨酸以及精氨酸含量较高，资料显示谷氨酸、精氨酸和亮氨酸是豆瓣发酵过程中主要氨基酸[21]，其中谷氨酸被认为是郫县豆瓣风味的主要来源[22]，在CDDB豆瓣曲中含量最多，其次为CH23、TCX豆瓣曲；赖氨酸、丝氨酸、脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸与豆瓣的甜鲜味、苦味有关，在各豆瓣曲中含量相对较高；组氨酸、异亮氨酸、门冬氨酸、酪氨酸、胱氨酸、甘氨酸也是风味物质的来源，含量相对较低；蛋氨酸含量最少，但对产品呈香呈味以及增鲜有良好的辅助作用。不同豆瓣曲中氨基酸的含量和种类有较明显的差异，除了微生物与酶以外，蚕豆中蛋白质的含量及组成也会影响游离氨基酸的产生[23]。
图4 不同品种蚕豆制曲成曲氨基酸含量
Fig.4 Amino acid content of different cultivars of broad beans into koji
2.5 不同品种蚕豆成曲的理化指标差异分析
对6种不同品种豆瓣曲理化指标进行统计分析，结果如表3所示，水分和pH的相对标准偏差<10%，品种间差异较小；总酸、氨基酸态氮和还原糖含量均>10%，品种间差异明显，其中CH19、CH23、CDDB和SCZG蚕豆制备的豆瓣曲总酸含量较高，TCX和YD豆瓣曲总酸含量较低；TCX豆瓣曲的氨基酸态氮含量最高，其次为CH19、CH23、CDDB豆瓣曲，SCZG与YD豆瓣曲含量最低；CH23和CH19豆瓣曲还原糖含量较高，TC豆瓣曲的含量最低，其他豆瓣曲还原糖含量无明显差异。值得注意的是，CH系列和CDDB豆瓣曲各项指标之间无较大差异，表现出相似的品质特征。
表3 不同品种蚕豆成曲理化指标
Table 3 The physical and chemical indexes of different cultivars of broad beans′ koji
样品水分/%豆瓣曲pH总酸/[g·(100g)-1]氨基酸态氮/[g·(100g)-1]还原糖/[g·(100g)-1]CH1926.78±0.19c6.42±0.01b0.88±0.10a0.29±0.01b7.13±0.25aCH2325.58±0.43cd6.35±0.01c0.80±0.02a0.30±0.01b7.49±0.16aCDDB29.21±0.25b6.30±0.00d0.83±0.03a0.32±0.01b6.29±0.08bTCX32.04±0.58a6.70±0.00a0.71±0.02ab0.41±0.00a4.01±0.08cSCZG24.99±0.25d6.31±0.00d0.88±0.01a0.22±0.00c6.72±0.16bYD24.64±0.89d6.36±0.01c0.59±0.09b0.20±0.01c6.27±0.10b相对标准偏差/%9.660.4437.6216.5912.83
注：同组数据中不用字母表示差异显著
2.6 不同品种蚕豆成曲理化风味指标PCA
PCA通过降维的方法，将多个指标转化为几个综合指标，从而能更好地反应样品间的差异性，呈现样品间集群与离群的特点[24]。由图5-A可知，6种不同品种蚕豆制曲成曲分布在不同象限，被分成三类，表明不同品种蚕豆制曲成曲间品质存在差异。CDDB、CH23、SCZG以及CH19主要集中分布在第二象限，被分成一类，说明该4种豆瓣曲的品质相似。TCX与YD豆分别位于一、四象限，被分成二类，说明豆瓣曲品质与其他品种豆瓣曲有明显的差异。由图5-B可知，TCX和YD豆瓣曲主要受乳酸和pH的影响，游离氨基酸对CDDB、CH23、SCZG以及CH19豆瓣曲的影响最大。
1-氨酸;2-异亮氨酸;3-缬氨酸;4-苏氨酸;5-丝氨酸;6-脯氨酸; 7-门冬氨酸;8-亮氨酸;9-酪氨酸;10-赖氨酸;11-精氨酸;12-胱氨酸; 13-谷氨酸;14-甘氨酸;15-蛋氨酸;16-丙氨酸;17-苯丙氨酸 A-不同品种豆瓣曲聚类PCA图;B-为理化风味指标载荷矩阵图
图5 基于PCA不同品种蚕豆成曲及风味理化指标
Fig.5 Based on PCA of different cultivars of broad beans′koji and flavor physical and chemical indicators
2.7 不同品种蚕豆成曲感官品质分析
由表4可知，不同品种豆瓣曲的颜色评分无明显差异，其他评分项得分有较明显的差异，其中CH19、CH23、和CDDB豆瓣曲整体得分较高，均在40.0分以上；SCZG和TCX豆瓣曲的质地、气味和孢子/菌丝状态不佳，感官评分在37.25分左右；YD豆瓣曲整体的分较低，仅34.0分。CH19、CH23和CDDB豆瓣曲的感官得分在40.0分以上，说明使用成胡系列蚕豆可能更适于制作豆瓣曲；TCX、YD和SCZG豆瓣曲感官得分分别为36.0、34.0、38.5，可作为良性豆瓣曲，与PCA结果一致。
表4 不同品种蚕豆曲成曲感官得分 单位：分
Table 4 Sensory scores of different cultivars of broad beans′ koji
得分项CH19CH23CDDBTCXYDSCZG孢子/菌丝状态9.09.08.57.07.07.8外形8.08.18.57.37.08.0颜色8.58.08.08.08.08.0气味8.08.58.07.26.08.2质地7.57.07.06.56.06.5总分41.040.640.036.034.038.5
3 结论
对6种不同品种蚕豆豆瓣曲的各项质量指标进行分析，发现不同品种蚕豆豆瓣曲的各项质量指标存在较明显的差异，其中CH19、CH23和CDDB豆瓣曲的微生物总数、酶活性、还原糖、游离氨基酸和有机酸含量等豆瓣曲重要质量指标综合表现优于其他品种，说明其豆瓣曲具有良好的质量品质，适宜作为发酵郫县豆瓣的蚕豆品种；TCX豆瓣曲水分、pH和氨基酸态氮含量最高，SCZG豆瓣曲具有较高的还原糖和最高的总酸含量，而TCX和SCZG豆瓣曲的微生物总数、酶活活性、有机酸、游离氨基酸等重要质量指标不及CH19、CH23和CDDB豆瓣曲，前者后期发酵得到甜瓣子和豆瓣酱品质可能也劣于后者；YD豆瓣曲各项指标均偏低，说明其制备的豆瓣曲质量差，不适于制备郫县豆瓣。通过PCR发现CH19、CH23、CDDB和SCZG豆瓣曲品质相似，与YD和TCX豆瓣曲有明显的区别；最后结合感官评价发现CH19、CH23、和CDDB豆瓣曲整体得分均在40.0分以上；SCZG和TCX豆瓣曲的质地、气味和孢子/菌丝状态不佳，感官评分在37.25分左右；YD豆瓣曲整体得分较低，仅34.0分，与PCA结果一致。综上所述，在实际豆瓣曲的生产中，可选用CH19、CDDB和CH23蚕豆作为制作郫县豆瓣的原料；YD蚕豆质地较硬，成曲品质差，不适于制作郫县豆瓣；而氨基酸态氮含量较高的TCX豆瓣曲和还原糖含量较高的SCZG豆瓣曲具有产生多种风味物质的基础，因此TCX和SCZG蚕豆适宜制备香味浓郁的老豆瓣。
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