玉米醇溶蛋白是玉米中的主要贮藏蛋白，含有大量的非极性氨基酸，如谷氨酸(21%～26%)、亮氨酸(20%)、脯氨酸(10%)和丙氨酸(10%)，可溶于60%～90%(体积分数)的乙醇-水溶液，强的分子间二硫键和疏水相互作用构成了复合物形成的基础，已被美国食品药品监督管理局批准为安全的食品加工原料[1]，因其具良好的生物相容性、独特的溶解性、良好的降解性、成膜性等优点[2-3]，成为食品、药品、组织材料等众多行业的研究热点。在食品行业中，常用于食品包埋剂、包装材料、黏合剂以及与其他食品原料复合使用[4-6]。
淀粉作为一种在食品生产加工中常用的辅助原料，具有分布广、成本低、易降解等优点。许多研究表明，在蛋白质中添加外源淀粉，可以改变蛋白质的组织结构，在两者的共同作用下复合凝胶特性得到改善[7-9]。将普通马铃薯淀粉和改性马铃薯淀粉添加到肌原纤维蛋白中，复合凝胶的强度和持水性得到改善；木薯淀粉和马铃薯淀粉的添加能对虾蛄肌原纤维蛋白凝胶特性产生显著的影响，薯类淀粉和卡拉胶的加入使得肌原纤维凝胶的质构特性得到提升。目前的研究主要集中在淀粉对鱼类、鸡肉等肉类蛋白凝胶特性的影响方面，而对植物蛋白凝胶特性的影响研究较少。因此，本文选用吸水膨胀性强的马铃薯淀粉为研究对象，将不同质量分数的马铃薯淀粉添加到玉米醇溶蛋白中，对比分析各复合体系的凝胶特性，研究马铃薯淀粉对玉米醇溶蛋白的影响，为拓展马铃薯淀粉在玉米醇溶蛋白制品的开发应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
马铃薯淀粉、玉米醇溶蛋白，美国Sigma公司；氢氧化钠、考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白等试剂均为分析纯，成都科龙化工试剂公司。
1.2 仪器与设备
TGL-18MS高速冷冻离心机，上海卢湘仪仪器有限公司；UltraScan Pro测色仪，美国Hunter Lab公司；LGJ-10真空冷冻干燥机，北京松原华兴科技有限公司；Spectrun100傅里叶红外光谱仪，美国Perkin-Elmer公司。
1.3 实验方法
1.3.1 马铃薯淀粉-玉米醇溶蛋白复合凝胶的制备
将玉米醇溶蛋白溶于氢氧化钠溶液(pH 12)，固定蛋白质量浓度60 mg/mL不变，再分别加入溶液总量6%、9%、12%、15%、18%(质量分数)的马铃薯淀粉(预实验表明6%以下的淀粉添加量不能形成成型的复合凝胶)，磁力搅拌混合均匀。混合溶液以1 ℃/min的速率水浴加热到85 ℃，保温30 min后取出，立即用冰水冷却至室温，再置于4 ℃冰箱过夜。制备好的凝胶测试前在室温下(25±1) ℃平衡30 min，方可用于测定。
1.3.2 复合凝胶持水性测定
参照FOEGEDING[10]的方法稍作修改。取1 g凝胶样品于离心管8 000 r/min离心20 min，吸取离心液，称量离心前后样品质量。按公式(1)计算，得到凝胶持水性：
持水性
(1)
式中：m为离心管质量，g；m1为离心前凝胶加离心管质量，g；m2为离心后凝胶加离心管质量，g。
1.3.3 复合凝胶质构特性的测定
采用质构仪进行质构分析。参数设置如下：探头型号：P/0.5，测前速度：2.0 mm/s；测定速度：0.5 mm/s；测后速度：2.0 mm/s；压缩形变：50%；触发力：5 g。
1.3.4 反复冻融处理
参考潘治利等[11]的方法并略作调整。将制备好的凝胶放入-18 ℃冰箱冻藏1 d后，取出于室温下融解，以此为1个循环。反复冻融3次，进行持水性、质构特性测定。
1.3.5 复合凝胶白度的测定
采用色度测定仪测定凝胶样品的L*(亮度值)，a*(红度值)和b*(黄度值)。参考PARK[12]的方法计算样品白度，计算如公式(2)所示：
白度
(2)
1.3.6 复合凝胶溶胀率的测定
参考王燕[13]的方法略作修改。将干燥凝胶浸泡在氢氧化钠溶液(pH 12)中12 h，称量浸泡前后样品重量，根据公式(3)计算样品平衡溶胀率：
溶胀率
(3)
式中：Ws是溶胀平衡后水凝胶的质量, g；Wd为凝胶干重, g。
1.3.7 复合凝胶化学作用力的测定
参照GOMEZ-GUILLEN等[14]的方法并略作调整。准确称取1 g凝胶样品，分别加入9 mL蛋白质变性剂0.05 mol/L NaCl、0.6 mol/L NaCl、0.6 mol/L NaCl + 1.5 mol/L尿素、0.6 mol/L NaCl + 8 mol/L尿素、0.6 mol/L NaCl + 8 mol/L尿素 + 1.5 mol/L β-巯基乙醇，混合均质，放在4 ℃下静置2 h，10 000 r/min离心10 min，吸取上清液。用a、b、c、d、e分别表示用考马斯亮蓝法测定的上述5种上清液中溶解的蛋白质的含量。不同试剂所溶解的蛋白质含量之差表示各种作用力的含量。b-a表示离子键的含量；c-b表示氢键的含量；d-c表示疏水相互作用的含量；e-d表示二硫键的含量。
1.3.8 傅里叶红外光谱扫描
参考OGUTU等[15]的方法。凝胶样品冷冻干燥后，取0.5 mg于玛瑙研钵中，按质量比1∶50加入干燥的溴化钾粉末，混匀研细后制片，扫描范围4 000～400 cm-1。
1.3.9 数据分析
每个样品平行测定3次，结果以平均值±标准偏差表示。采用Minitab 17进行数据分析，Origin 2018作图。
2 结果与分析
2.1 复合凝胶的制备
图1为添加6%、9%、12%、15%、18%马铃薯淀粉与玉米醇溶蛋白制得的复合凝胶。由图1可知，在淀粉添加量为6%时，凝胶形状不规则，中部较稀疏，气体灌入导致鼓起，未达到完整凝胶的效果。淀粉添加量为12%时，凝胶表面平整，但边缘相对不平滑。淀粉添加量达到18%时，凝胶的形态结构较为完整，其硬度增强。
a-淀粉添加量为6%；b-淀粉添加量为9%；c-淀粉添加量为12%； d-淀粉添加量为15%；e-淀粉添加量为18%
图1 不同马铃薯淀粉添加量制得的复合凝胶的形貌
Fig.1 Morphology of composite gels prepared by adding different amounts of potato starch
2.2 复合凝胶持水性分析
不同马铃薯淀粉添加量和反复冻融对复合凝胶持水性的影响如图2所示。未冻融的复合凝胶，马铃薯淀粉添加量为9%时，持水性为81.68%，比添加量为6%时提高了27.41%(P<0.05)。添加量为18%时，持水性最大，为94.50%。表明未冻融的复合凝胶的持水性随着淀粉添加量的增加而增加。这与杨明等[16]的研究结果类似，马铃薯淀粉的添加使整个体系形成了更致密的淀粉-蛋白网状结构，有效地截留住更多水分，提高了复合凝胶持水力。
冻融1、2、3次的复合凝胶的持水性也随淀粉添加量的增加呈上升趋势。相同的淀粉添加量下，冻融后的复合凝胶持水能力下降，这可能与冻融后复合凝胶的结构遭到破坏，束缚水的能力减弱有关。冻融3次的凝胶持水性上升，可能是因为多次冻融后凝胶网络结构改变成海绵状，将析出的水分再次吸收[17]。
图2 冻融次数和马铃薯淀粉添加量对玉米醇溶 蛋白凝胶持水性的影响
Fig.2 Effects of freezing-thawing times and potato starch addition on water-holding capacity of zein gel(P<0.05) 注：不同大写字母表示同一淀粉添加量不同冻融次数间差异显著， 不同小写字母表示同一冻融次数不同马铃薯淀粉添加量间差异显著 (P<0.05)(下同)
2.3 复合凝胶质构特性分析
马铃薯淀粉添加量和反复冻融处理对玉米醇溶蛋白复合凝胶质构特性的影响如图3所示。随着淀粉添加量的增加，复合凝胶的硬度和咀嚼性都随之显著增强(P<0.05)。当添加量为18%，冻融2次处理时，复合凝胶达到最大硬度2 127.7 g，最大咀嚼度1 709.7 g，这与刘静雪等[18]的研究结果相一致。淀粉加入后，在加热形成凝胶的过程中淀粉分子相互缠绕、填充，被包裹在蛋白中形成更加紧密的网状结构[19-20]，硬度和咀嚼性可能因此得到提升。而且马铃薯淀粉中的支链淀粉中长链成分多，会使老化速度加快[21]，也使得凝胶的硬度增大。冻融0次和冻融1、2次的复合凝胶弹性均随淀粉添加量的增加呈先增加后降低的趋势，冻融3次的凝胶弹性变化不明显(P>0.05)。其中，冻融0次的凝胶弹性变化最明显，当淀粉添加量为15%时，弹性最大(0.960 5)，是添加量为6%时的1.58倍。而淀粉添加量为18%时，复合凝胶弹性下降。其原因可能是马铃薯淀粉中支链淀粉多，易膨胀糊化形成富有弹性的胶体[22]，但是淀粉含量过高导致体系中的游离水分减少，出现多余的淀粉颗粒，弹性反被削弱[23]。
内聚性是凝胶内部的结合能力。冻融0次的复合凝胶，随马铃薯淀粉添加量的增加，内聚性呈先降低后增加的趋势，冻融后的复合凝胶内聚性变化相对不明显。同一马铃薯淀粉添加量下，冻融后凝胶的硬度、咀嚼性、弹性和内聚性均比未冻融的好。硬度和咀嚼性的大小在反复冻融次数间表现出显著性差异(P<0.05)。弹性与内聚性在冻融与未冻融的凝胶之间表现出显著差异，但是冻融1、2、3次之间差异不明显。这可能与冻融使淀粉-蛋白结构空隙中的水分凝结成细小的冰晶，改变内部水分存在状态与空间结构有关。
因此，综合考虑复合凝胶的硬度、咀嚼性、弹性和内聚性4种质构特性以及加工条件与生产成本等因素，淀粉添加量15%，冻融2次处理的复合凝胶质构特性较好，为实际的生产应用提供参考。
a-硬度；b-咀嚼性；c-弹性；d-内聚性
图3 冻融次数和马铃薯淀粉添加量对玉米醇溶蛋白凝胶质构特性的影响
Fig.3 Effects of freeze-thaw cycles and potato starch addition on texture of zein gel
2.4 复合凝胶白度分析
复合凝胶的白度随马铃薯淀粉添加量的增加而增大(图4)。玉米醇溶蛋白呈黄色，白度较低。而马铃薯淀粉呈白色，添加到玉米醇溶蛋白中，使复合凝胶的白度增加。此外，HONG等[24]研究表明，L*值受到凝胶内部水分含量影响，水分含量增加，光反射发生改变，L*值增大。而随着淀粉添加量的增多，凝胶持水性会增强，凝胶内部水分变多，白度因此随之变大。
图4 马铃薯淀粉添加量对玉米醇溶蛋白凝胶白度的影响
Fig.4 Effect of potato starches on the whiteness of zein gel
2.5 溶胀率
复合凝胶溶胀前后的形貌有明显的差异，溶胀后复合凝胶都有一定的膨胀。玉米醇溶蛋白复合凝胶溶胀性随着马铃薯淀粉添加量的增加而降低(图5)，添加量为15%时溶胀率增加，继续增加到18%，溶胀率再次下降；淀粉添加量为6%和15%时溶胀性能较优，12%时较差。这可能是因为淀粉的添加填充了蛋白的内部结构，使复合凝胶内部可弹性收缩膨胀的空间小，影响了溶胀率[25]。王燕[13]制备玉米醇溶蛋白复合凝胶作为药物的载体，发现溶胀能力较弱的凝胶缓释效果好，此时选用12%淀粉添加量的复合凝胶较为合适。高靖阳[21]利用淀粉基气凝胶制备得到新型固体材料，要求凝胶吸湿溶胀效果好，此时6%淀粉添加量的复合凝胶较为合适。
图5 不同马铃薯淀粉添加量下zein复合凝胶溶胀率
Fig.5 Swelling ratio of zein gels with different amounts of potato starch
2.6 复合凝胶化学作用力分析
在淀粉蛋白凝胶的形成过程中，化学作用力是决定凝胶特性的重要因素，通过共价键(二硫键)和非共价键(氢键、疏水相互作用)共同作用稳定凝胶内部网络结构[26]。凝胶网络的形成是蛋白质间、蛋白质与溶剂之间作用力相互平衡的结果，离子键、氢键、疏水相互作用和二硫键等是形成和维持凝胶的主要作用力。用不同试剂处理凝胶后，凝胶中作用力间的平衡被破坏。不同试剂所溶解的蛋白质含量之差表示各种作用力的含量[27]。如图6所示，随马铃薯淀粉的增加，氢键含量呈先减小后增加的趋势；二硫键含量随淀粉添加量的增加先下降后上升；离子键和疏水相互作用先上升后下降。表明马铃薯淀粉的添加会对复合凝胶的化学作用力产生影响。从整个马铃薯淀粉-玉米醇溶蛋白复合凝胶体系来看，氢键和疏水相互作用的贡献较大，在复合凝胶网络结构中起主要作用；离子键和二硫键贡献较小。这与许多研究认为凝胶形成过程中非共价键作用更大的结论相一致[28]。O′KANE等[29]研究认为氢键和疏水相互作用是保证复合凝胶结构稳定的主要作用力。因此，在研究淀粉添加量对玉米醇溶蛋白复合凝胶化学作用力的影响时应重点关注氢键和疏水相互作用，但是二硫键和离子键的作用也不能忽略。
2.7 复合凝胶傅里叶红光谱分析
不同马铃薯淀粉添加量下玉米醇溶蛋白分子间结构和分子内作用力的变化(图7-a)。不同波段的吸收峰的峰形、峰高、峰位等图谱信息能反映出分子间结构和相互作用的差别[30]。以马铃薯淀粉添加量为6%时的复合凝胶为例，重要的吸收峰主要包括3 419.17 cm-1处由于亲水性O—H产生的特征峰；2 925.17 cm-1处显示C—H伸展振动的峰；由C
O伸缩振动引起的酰胺Ⅰ带(1 700～1 600 cm-1)，在1 614.80 cm-1处左右；以及因各种基团相互影响而产生的在1 107.61 cm-1处的吸收峰[6]。随着淀粉添加量的变化，各复合凝胶的红外光谱走向大致相同，但主要峰位的对应波数有发生轻微的偏移，表明淀粉添加量会改变复合凝胶的分子构象。淀粉添加量为9%时，酰胺Ⅰ带的特征峰对比淀粉添加量6%时发生明显红移，约在1 633.05 cm-1处，之后淀粉量继续增加，发生位移较小。因此淀粉的添加可能会对CO结构产生一定影响，且添加量从6%增加到9%时影响最为明显。
a-氢键；b-二硫键；c-离子键；d-疏水相互作用
图6 马铃薯淀粉添加量对玉米醇溶蛋白复合凝胶化学作用力的影响
Fig.6 Effect of potato starch addition on chemical forces of zein gels
酰胺Ⅰ带(1 700～1 600 cm-1)是能灵敏反映不同结构蛋白质和多肽振动频率变化的特征谱带，因此常常被用于分析蛋白质的二级结构[31]。将此段谱带进行分峰拟合，拟合后根据各子峰的面积，可计算得到如图7-b所示的复合凝胶的二级结构及其所占的比例。复合凝胶二级结构占比β-折叠>β-转角>无规则卷曲≈α-螺旋。玉米醇溶蛋白在溶液中的结构以α-螺旋为主，溶剂蒸发过程中一部分α-螺旋会转变成β-折叠，再重组构型[30,32-33]。二级结构的变化在淀粉添加量从6%增加到9%时最明显，β-转角含量显著增加，β-折叠、无规则卷曲和α-螺旋均减少；淀粉添加量继续增加，二级结构相对来说变化不明显。说明淀粉的添加会对复合凝胶二级结构产生影响。并且结合淀粉添加量对复合凝胶持水性和质构特性的影响，可以推测β-折叠的减少，β-转角的增加可能有助于提高复合凝胶的持水性和质构特性。
a-红外光谱图；b-二级结构含量图
图7 不同马铃薯淀粉添加量下玉米醇溶蛋白 复合凝胶红外光谱图和二级结构含量图
Fig.7 Infrared spectrum and secondary structure content of zein gel under different potato starch content
3 结论
马铃薯淀粉的添加可以改善玉米醇溶蛋白的凝胶特性。随着马铃薯淀粉添加量的增加，复合凝胶的硬度、咀嚼性和弹性均呈总体上升趋势；持水性和白度也不同程度的增大。冻融处理对复合凝胶的质构特性和持水性均产生了一定影响，综合考虑复合凝胶的硬度、咀嚼性、弹性和内聚性4种质构特性以及加工条件与生产成本等因素，淀粉添加量15%，冻融2次处理的复合凝胶质构特性较好，为实际的生产应用提供参考。氢键和化学作用力是凝胶形成的主要作用力。马铃薯淀粉的添加改变了凝胶的一级结构和二级结构。本研究为马铃薯淀粉在玉米醇溶蛋白制品的开发应用提供了一定的理论基础。
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