大鲵(Andrias davidianus)作为经济价值较高的冷水两栖动物，营养美味，肌肉中必需氨基酸种类齐全，脂肪中富含多不饱和脂肪酸、DHA等，皮肤中含有胶原蛋白及明胶，享有“水中人参”的美誉[1-2]。人工育种技术的突破及工厂化养殖和仿生态养殖技术的完善，促进了大鲵养殖产业的迅猛发展[3]。大鲵作为张家界的特色动物资源养殖规模已达200万尾[4]。但养殖大鲵多以鲜活个体出售，提高了消费门槛，并且大鲵加工产品较为单一，多为保健品，阻碍了大鲵产业的发展[1]。冷冻调理制品具有食用方便、风味多样和便于销售等特点，符合天然、便利、健康和美味等消费需求。

红糟作为世界最古老的发酵型酒精饮料之一的红曲黄酒的酒糟，香气独特，且富含天然红色素，具有降低血脂、降血压、抗突变、抗疲劳等生理活性[5-6]。余睿智[7]在葡萄酒发酵过程中加入大鲵低聚糖肽，发现添加大鲵低聚糖肽的葡萄酒香气物质显著增加，其中大鲵低聚糖肽葡萄酒中苯乙醇的含量是不加大鲵低聚糖肽获得的葡萄酒中含量的2.68倍。随着经济的发展和生活节奏的加快，为了节省时间，越来越多的消费者更倾向于选择便捷的冷冻调理食品。邓立青[8]以变性淀粉、小麦粉、食盐等作为辅料，制备的鱿鱼冷冻调理制品香气诱人、质地爽脆。结合大鲵品质特色和现有糟鱼技术，开发具有大鲵特色的精深加工产品，可开拓大鲵消费市场。

本文以大鲵为研究对象，通过响应面分析法优化香糟大鲵调理加工工艺参数，重点评价腌制工艺对产品品质及滋味物质的影响，以期为香糟大鲵冷冻调理制品的开发提供支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大鲵，金鲵农业生物科技有限公司提供。大鲵宰杀放血、烫漂去除黏液后，放入-18 ℃冰箱预冷至0 ℃左右，冷链运至实验室后低温冻藏(-80 ℃)；香辛料(姜、桂皮、小茴香、陈皮、丁香、草果、山奈、花椒、罗汉果、朝天椒、香茅草等)，内江菜市场；调味料(葱、姜、蒜、白糖、盐、味精、生抽、白酒、猪骨白汤等)，欧尚超市；红糟，宁德市蔡氏水产有限公司。

氯化钠、氢氧化钠、高氯酸、甲基红、亚甲基蓝、酚酞、铬酸钾、硝酸银、0.01 mol/L盐酸、乙醚、硫酸钾、硫酸铜、浓硫酸等(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；正庚烷、氨基酸标准品、核苷酸标准品(色谱纯)，Sigma公司。

1.2 仪器与设备

KDN-103F定氮仪、SZCD脂肪测定仪，上海纤检仪器有限公司；TMS-Pro质构仪，美国Food Technology Corporation公司；HI2216pH计，哈纳沃德仪器(北京)有限公司；PMB35水分含量测定仪，英国艾德姆衡器公司；Chroma Meter CR400色差计，日本Minolta公司；DZ400S真空包装机，上海帆铭机械有限公司；L28500氨基酸自动分析仪，日本日立公司；1100液相色谱，美国 Agilent公司。

1.3 实验方法

1.3.1 香糟大鲵加工工艺流程

工艺流程：将-80 ℃下保存的大鲵进行流水解冻，清洗后去骨、分块(约3 cm宽)，加入一定量的盐、生姜、生抽和白酒等放入5 ℃下24 h预腌去腥，加入一定比例的冷却至室温的卤汤和其他调味料(红糟、盐、白糖、料酒、生抽、味精、猪骨白汤等)，放入密封袋后封口，置于4 ℃温度下腌制3 d入味，腌制结束后去除腌制料，将鱼块真空密封，放入-18 ℃下冻藏。

卤汤制备：称取一定量的干姜、桂皮、小茴香、陈皮、丁香、草果、山奈、花椒、罗汉果、朝天椒和香茅草等，加入50～60 ℃水浸泡30 min去灰除腥，过滤，再按质量百分比加入水，煮沸后小火煮30 min，获得卤汤。

冷冻调理过程针对危害分析与关键控制点(hazard analysis critical control point，HACCP)中关键控制点，腌制入味环节不仅影响风味的形成，也改变产品质构和保水性，故针对腌制环节进行单因素和多因素优化。腌制结束去除腌制料后进行感官评分、盐分、水分含量、水分活度、pH、挥发性盐基氮(total volatile base nitrogen，TVB-N)、脂肪、蛋白质及肌肉弹性等指标的测定；将-18 ℃冻藏的香糟大鲵调理制品流水解冻，肌肉搅拌成肉糜后进行游离氨基酸和呈味核苷酸的测定。

1.3.2 感官评定

参考文献[9]选取10名具有食品感官评定知识人员，进行大鲵及红糟审评标准及审评方法的培训，分别对产品的外观、气味、滋味、口感4个指标进行感官评价。感官评价标准见表1，感官评分结果按照外观、气味、滋味、口感分别占0.2、0.2、0.35、0.25的权重计算分值[10-11]。

1.3.3 盐分测定

盐分含量参照SC/T 3011—2001《水产品中盐分的测定》中硝酸银沉淀滴定法进行测定。

1.3.4 理化指标的测定

水分含量按照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》测定；水分活度(water activity，Aw)按照GB 5009.238—2016《食品安全国家标准 食品水分活度的测定》中的第二法水分活度仪扩散法进行测定；pH值按照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》进行测定；TVB-N含量按照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》进行测定；脂肪和蛋白质含量分别参照GB 5009.6—2016和GB 5009.5—2016进行测定。

1.3.5 游离氨基酸的测定

参考CHEN等[12]和周纷等[13]的方法并略有改动，称取样品4.0 g(精确到0.001 g)，加入30 mL三氯乙酸溶液(质量分数5%)并进行匀浆，超声5 min后室温静置2 h，10 000 r/min离心(4 ℃)10 min，吸取20 mL 上清液于烧杯中，用6 mol/L NaOH溶液和1 mol/L NaOH溶液调节pH值至2.0，最后用超纯水定容至50 mL，用0.22 μm水相滤膜过滤后打入进样瓶待上机测定。

测试参数设定：分离柱(4.6 mm×60 mm)，树脂为阳离子交换树脂；分离柱温度57 ℃；1通道流速0.4 mL/min；2通道流速0.35 mL/min；流动相：pH 3.2、3.3、4.0、4.9的柠檬酸钠和柠檬酸的混合缓冲液以及质量分数4%的茚三酮缓冲液。

1.3.6 呈味核苷酸测定

参考周纷等[13]的方法并略有改动。称取样品10.0 g(精确到0.001 g)，加入20 mL高氯酸溶液(质量分数10%，4 ℃预冷)，匀浆后超声5 min，10 000 r/min离心(4 ℃)15 min后取上清液，向沉淀中加入用10 mL 高氯酸溶液(质量分数5%，4 ℃预冷)，再次离心取上清液，合并2次上清液，用6 mol/L的KOH溶液调节pH值至5.8，静置30 min后取上清液定容至100 mL，摇匀后用水相0.22 μm的滤膜打入进样瓶，待上机测定，整个过程均在0～4 ℃条件下操作。

测试参数设定：ODS-3色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：A为甲醇溶液，B为0.02 mol/L磷酸二氢钾和磷酸氢二钾溶液，用磷酸调至pH值为6.5，等梯度洗脱；流速1 mL/min；柱温28 ℃；进样量10 μL；检测波长254 nm。

1.3.7 滋味强度值计算

滋味物质的味道强度值(taste activity value，TAV)按公式(1)计算：

(1)

式中：C代表样品中滋味物质的绝对浓度值，T代表该滋味物质的阈值，同单位下计算。

1.3.8 味精当量值的计算

味精当量(equivalent umami concentration，EUC)用于计算鲜味强度，参考WANG等[14]的计算方法，按式(2)计算：

EUC=∑aibi+1 218(∑aibi)(∑ajbj)

(2)

式中：EUC为味精当量，以单位质量大鲵肉中谷氨酸钠(monosodium glutamate，MSG)的质量表示，g MSG/100g；ai 为鲜味氨基酸的量，g/100g；bi为转化系数(Glu，1；Asp，0.077)；aj为5’-核苷酸的量，g/100g；bj为转换系数[肌苷酸(IMP)，1；鸟苷酸(GMP)，2.3；腺苷酸(AMP)，0.18]；协同常数为 1 218。

1.3.9 单因素实验

为了考察各因素对香糟大鲵品质的影响，在恒定因素为加盐量3.0%、腌制时间3 d、腌制温度4 ℃条件下，研究加盐量(2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%)、腌制时间(1、2、3、4、5 d)和腌制温度(2、4、6、8、10 ℃)对香糟大鲵调理制品的水分含量、肌肉色泽(a*值)、肌肉弹性和感官评分等指标的影响。

在香糟大鲵腌制过程中，红糟中的红曲色素随着腌制进程逐渐渗透到鱼肉中，使得鱼肉a*值逐渐增大，因此可通过a*值判别腌制的进程，理想的a*值范围预示着较好的腌制入味程度。鱼肉弹性是鱼体质构特性的重要指标之一，是肌肉对外力抵抗的体现。水分含量可影响鱼肉嫩度及贮藏，故控制水分含量可改善鱼肉的品质。感官评定是具有专业知识的人员运用味觉、视觉、触觉和嗅觉等人体感觉对产品气味、外观、口感和滋味等进行综合性评价的一种方法，能够综合反映食品的品质状态。综上，故选择肌肉色泽(a*)、鱼肉弹性、水分含量和感官评定为考察指标进行单因素实验。

1.3.10 响应面法优化大鲵的调理工艺

根据单因素实验结果，采用软件Design-Expert设计3因素3水平的Box-Behnken试验，研究响应值以及最佳变量的组合。表2为响应面因素水平表。

1.3.11 数据处理

采用Excel和SPSS 25软件进行数据统计。所有实验检测均作3次平行，测定结果以“x±SD”表示，对实验数据进行方差分析，以P<0.05为显著，P<0.01为极显著。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 加盐量的影响

腌制是用盐或其他调味品渗入物料，达到入味的目的。加盐量对糟味大鲵调理制品品质的影响如图1所示，随着NaCl添加量的增加，肌肉a*值逐渐增大，添加量达到3%时，大鲵鱼肉的a*值达到理想值，此时肌肉弹性和感官评分达到最大值，而水分含量随着加盐量增加一直减少。综合考虑弹性、色泽、水分含量和感官评分等，加盐量3.0%为宜。

2.1.2 腌制时间的影响

腌制在鱼肉内外渗透压达到平衡时，水分和盐离子等达到交换平衡。腌制时间对糟味大鲵调理制品品质影响如图2所示，大鲵肌肉水分含量随着腌制时间延长先下降后趋于平稳，在腌制3 d时达到平衡，此时感官评分达到最大值，而肌肉弹性也在3 d以后趋于平稳，肌肉a*值达到理想值。综合考虑弹性、色泽、水分含量和感官评分等，腌制时间选择3 d为宜。

2.1.3 腌制温度的影响

温度越高，离子运动越快，腌制速率越快，而温度过高无法抑制微生物的生长，尤其杂菌的生长会影响产品品质，导致腐败变质。因此为平衡腌制速率和产品品质，选择合适的腌制温度尤为重要。腌制温度对糟味大鲵调理制品的影响如图3所示，随着腌制温度的升高，大鲵肌肉水分含量逐渐降低，肌肉弹性在8 ℃ 时达到最大值，肌肉a*值随温度升高而增大。感官评分在4 ℃时达到最大值，随着温度升高，感官评分逐渐降低，然而6 ℃和8 ℃时感官评分仍高于90分。综合考虑弹性、色泽、水分含量和感官评分等，腌制温度选择6 ℃为宜。

2.2 响应面优化结果与分析

2.2.1 响应面试验设计结果

选取糟味大鲵腌制过程中的加盐量(A)、腌制温度(B)和腌制时间(C) 3个因素为自变量，以感官评定结果(Y)为响应值进行中心组合实验，实验设计及结果见表3。17个实验点中，12个析因实验，5个中心实验，析因点为自变量取值在A，B，C所构成的三维顶点，零点为区域的中心点，零点实验5次，用以估计实验误差。

2.2.2 感官评定与腌制条件数学模型的建立

肌肉的a*值、鱼肉弹性及含水量是考察糟味大鲵腌制工艺的重要指标，对不同腌制条件下的这3项指标进行测定，并对相应产品进行感官评定。对实验数据使用Design-Expert软件进行二次回归拟合，得到感官评定分值与腌制条件的回归方程：

Y=91.69-3.18A+0.14B-0.059C-2.54AB-1.75AC-0.38BC-8.95A2-2.47B2-2.11C2

通过Design-Expert软件进行方差分析，验证回归模型及各参数的显著性，结果见表4。

对结果进行ANOVA分析检验，由表4可知，感官评分的模型回归的显著性和可靠性极高(P<0.000 1<0.01)，失拟项不显著(P=0.132 1>0.05)，并Design-Expert分析得出R2和校正R2分别为0.989 2、0.975 3，表明方程拟合度较高，模型高度显著。一次项A和交互项AB、AC以及二次项A2、B2、C2具有极显著影响，而交互项BC影响不显著。其中各因素影响程度为A>B>C，即加盐量>腌制温度>腌制时间。该模型能够较好地描述糟味大鲵调理制品加工工艺参数对其感官评分的影响。

加盐量、腌制时间和腌制温度交互作用对感官评定的影响见图4。由图4可看出，在加盐量3.0%、腌制时间3 d和腌制温度6 ℃的条件下，NaCl添加量与腌制时间以及腌制温度与NaCl添加量之间的交互作用均为显著(P<0.05)。当腌制温度一定时，随着加盐量的增加，产品感官品质提高，在加盐量达到2.90%时产品品质最佳，随后加盐量继续增加，感官开始下降。随着腌制时间的延长，感官评定分值先升高后降低，在腌制时间达到73.40 h产品品质最佳;随着腌制温度的升高，感官评定分值先上升后下降，在温度为6.25 ℃时产品品质最佳。因此，只有适宜的加盐量、腌制温度和时间，鱼肉口感才会最好。

2.3 理化性质分析

不同的腌制方式会使产品形成不同的风味，同时也会改变产品的理化特性[15]。为了研究腌制加工后大鲵营养成分和理化指标的变化，分别测定了原料大鲵和糟味大鲵调理制品的基本营养成分和理化指标，结果如表5。

由表5可知，原料大鲵与大鲵冷冻调理制品除粗蛋白和脂肪外，其他基本营养成分和理化指标均有显著性差异(P<0.05)。原料大鲵经腌制入味后盐分质量含量由(0.14±0.03)%上升为(3.17±0.10)%，属于低盐制品(盐分<6.0%)，符合健康饮食理念，且有助于大鲵冷冻调理制品的贮藏和色泽的保持[16]。水分含量由(79.68±1.19)%降低为(71.83±2.75)%，鱼肉Aw由0.992±0.001降至0.966±0.001，但大鲵冷冻调理制品水分含量和Aw仍然较高，属于低盐高湿制品，抑菌作用将会减弱[17]。水分含量的下降使得蛋白质和脂肪浓缩进而相对含量上升，说明营养品质得到提高[18]。腌制过程会伴随物质的析出及蛋白质等大分子的降解，使得大鲵肌肉的pH值从6.02±0.03降低到5.61±0.04，pH值显著降低，改善了肉质的品质。

TVB-N含量表征鱼的新鲜度和安全性。原料大鲵的TVB-N含量为(5.92±0.08) mg/100g(≤13 mg/100g)，属于一级品；蛋白质的降解使得产品中的游离氮增加，因此大鲵冷冻调理制品的TVB-N含量升高到(15.87±0.45) mg/100g(≤30 mg/100g)。综上，原料大鲵经腌制后，各项营养指标提升，含水量、Aw和pH值有所降低。

2.4 游离氨基酸含量及分析

游离氨基酸不仅可以增强食品的滋味，也可间接改变食品的风味[13,19]。不同的氨基酸因官能团的不同呈现出鲜味、甜味、硫味和苦味等，不同滋味天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸等鲜味氨基酸，在一定程度上影响着动物蛋白的鲜味[20-21]。

从原料大鲵和大鲵冷冻调理制品中均检测出的17种游离氨基酸如表6所示，由于蛋白质和多肽的降解，总游离氨基酸由原料大鲵中的1 172.07 mg/100g 增加到1 441.09 mg/100g。其中，大鲵冷冻调理制品中Ala、Pro、Asp、Glu、Gly和Ser 6种呈味氨基酸的含量均高于原料大鲵，呈味氨基酸总量显著增加，由原料大鲵的438.52 mg/100g增加到624.82 mg/100g，尤其鲜味氨基酸Asp和Glu分别由原料大鲵中的66.35 mg/100g和126.62 mg/100g增加到92.29 mg/100g和212.82 mg/100g，分别增加了39.10%和68.08%。而对滋味有不好贡献的含硫氨基酸Met和Cys含量则分别下降了32.63%和13.57%。因而通过冷冻调理，大鲵肌肉中游离氨基酸对滋味的贡献得到明显提升。

2.5 呈味核苷酸分析

大鲵冷冻调理制品鲜味不仅与游离呈味氨基酸有关，同时呈味核苷酸也起着重要作用。戊糖与碱基通过糖苷键形成核苷，核苷与磷酸通过酯键形成核苷酸，当核苷5′-位上的—OH与磷酸基团发生酯化时表现出鲜味活性，其中IMP和AMP是对鱼类鲜味贡献最大的核苷酸，且在增强食品的鲜味方面二者存在协同效应[22-23]。

由表7可知，相比原料大鲵，大鲵冷冻调理制品中ATP、ADP和AMP均无显著变化，而呈味较强的IMP和GMP含量均有增加，分别由原料大鲵中的(11.10±0.89) mg/kg和(15.50±0.24) mg/kg增加到(55.85±3.26) mg/kg和(18.90±0.11) mg/kg，分别增加了4.03倍和0.22倍；呈味核苷酸总量由(174.41±0.56) mg/kg增加到(223.50±0.74) mg/kg。

2.6 大鲵冷冻调理制品滋味强度值的比较分析

TAV是样本中各呈味物质的含量与其对应的阈值之比，当TAV大于1时，具有滋味活性，对整体滋味轮廓具有显著贡献，值越高，贡献越大[24]。大鲵原料和冷冻调理制品游离氨基酸和呈味核苷酸TAV值见图5。由图5可看出，对原料大鲵整体滋味轮廓具有显著贡献的为Glu、Arg、Val、His和Met这5种游离氨基酸，而大鲵冷冻调理制品中有Glu、Ala、Arg、Val、His和Met 6种游离氨基酸TAV值大于1，且Glu的TAV值均为最大，其他游离氨基酸对整体滋味起修饰作用。大鲵冷冻调理制品中6种呈味氨基酸的TAV值均增大，呈味核苷酸中IMP的TAV值显著增大(P<0.05)，表明大鲵冷冻调理制品的滋味得到改善与提升。

2.7 EUC分析

YAMAGUCHI等[25]对呈味核苷酸及游离氨基酸之间的相互作用进行感官实验，提出味精当量评价模型，即使用EUC表示鲜味游离氨基酸与鲜味核苷酸两者之间的协同效应。由表8可看出，原料大鲵和大鲵冷冻调理制品肌肉的EUC分别为1.01 g MSG/100g和3.08 g MSG/100g，所具有的鲜味强度分别相当100g肌肉中有1.01 g和3.08 g味精产生鲜味，而味精阈值为0.03 g/100mL，此时大鲵原料和大鲵冷冻调理制品均呈现强烈的鲜味。大鲵原料经冷冻调理后EUC提高了2.05倍，表明大鲵经腌制加工可使制品的鲜味明显提升。

3 结论

本研究采用响应面法优化冷冻调理工艺，旨在开发糟味大鲵冷冻调理制品，所得最佳条件为：加盐量2.90%、腌制温度6.25 ℃、腌制时间73.40 h，此条件下生产的大鲵冷冻调理制品色泽红润，鱼肉紧密有弹性，具有独特糟香味。经冷冻调理工艺后大鲵营养得到改善，蛋白质含量[(18.55±0.17)%]和脂肪含量[(2.07±0.17)%]均高于原料大鲵，且调理后其属于低盐制品[盐分含量(3.17±0.10)%]，符合健康饮食理念。

冷冻调理后大鲵制品的鲜味和滋味都得到明显提升。总游离氨基酸由1 172.07 mg/100g增加到1 441.09 mg/100g。其中，Ala、Pro、Asp、Glu、Gly和Ser 6种呈味氨基酸总量显著增加(由438.52 mg/100g增加到624.82 mg/100g)，尤其鲜味氨基酸Asp和Glu分别增加了39.10%和68.08%。呈味核苷酸总量由(174.41±0.56) mg/kg增加到(223.50±0.74) mg/kg，Glu、Ala、Arg、Val、His和Met这6种游离氨基酸TAV值大于1，对制品整体滋味轮廓具有显著贡献；EUC则由1.01 g MSG/100g提升到3.08 g MSG/100g，增加了2.05倍。该研究为开发大鲵冷冻调理制品和提高大鲵的利用价值提供了科学的理论基础。

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Process optimization and taste evaluation of frozen aromatic fish (Andrias davidianus)

MA Donglin1,2,GUO Quanyou1*,LI Baoguo2,FENG Guangpeng1,YANG Xu1, WANG Haihua3,JIANG Chaojun1,MA Benhe3

1(East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China) 2(School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China) 3(Jiangxi Fisheries Research Institute, Nanchang 330039, China)

ABSTRACT In order to develop frozen conditioning products of Andrias davidianus, response surface analysis was used to optimize the processing technology from the amount of salt, marinating time and temperature, and to evaluate the physical and chemical properties, umami and flavor substances. The best process conditions obtained by sensory evaluation were by the addition of salt at 2.90% and marinating for 73.40 h at 6.25 ℃. After the Andrias davidianus was frozen and conditioned, the protein (18.55±0.17)% and fat (2.07±0.17)% content were significantly increased, the product contained (3.17±0.10)% salt which was a low-salt product. The total amount of flavored amino acids was significantly increased, in which the raw material Andrias davidianus increased from 438.52 mg/100g to 624.82 mg/100; meanwhile, the total amount of flavored nucleotides were increased from (174.41±0.56) mg/kg to (223.50±0.74) mg/kg. Moreover, there were 6 kinds of free amino acids Glu, Ala, Arg, Val, His and Met in the frozen preparation of Andrias davidianus. The taste activity value was greater than 1, which had a significant contribution to the overall taste profile of the product. The equivalent umami concentrations increased by 2.05 times. Therefore, the taste and umami taste of the products have been significantly improved. This study provides theoretical guidance for the deep processing of Andrias davidianus.

Key words Andrias davidianus; frozen conditioning products; taste nucleotides; free amino acids

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.027559

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第一作者：硕士研究生(郭全友研究员为通信作者，E-mail:dhsguoqy@163.com)

基金项目：国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”专项(2018YFD0901704);中国水产科学研究院基本科研业务费资助项目(2020TD68)

收稿日期：2021-04-06，改回日期：2021-04-22