酱香型白酒采用堆积和窖内2种发酵方式进行多轮次发酵，生产周期长达1年。堆积是为后续窖内发酵提供微生物、酶类、风味物质及其前体等，从而赋予酱香型白酒独特的风味[1-2]。随后由窖池内部的封闭环境结合窖泥所形成的多微共酵体系将中间物质转化为产物。已有研究表明，由温度差异所构成的窖内发酵环境的差异致使窖内不同部位的酒醅分别产酱香、醇甜和窖底香[3-4]。已有研究证实温度是影响发酵过程的主要因素之一，余培斌等、陈丙友等[5-6]的研究表明，温度是通过影响发酵过程中酒醅的理化指标、微生物生长代谢等从而对原酒质量产生重要影响的。而在白酒实际生产应用中，其他香型白酒已实现通过温度信息干预生产过程，如浓香型白酒已实现使用温度信息来判断和调节产、质量的变化情况[7-9]。赵健光等[10]总结云南小曲白酒发酵过程的量化指标并调节指标将出酒率提高至60.3%。综上所述，跟踪监测酱酒生产的发酵温度对分析发酵过程从而指导生产具有一定意义。
此外，酱酒的多轮次发酵工艺致使不同轮次发酵酒醅的理化性质不同、微生物群落也存在差异，各轮次酒也具有明显的特征[11-14]。因此，本文以全周期多轮次发酵为聚焦点，通过对酱酒生产周期的醅温及其他相关参数进行全面监测分析，在定量水平上了解发酵过程醅温演替的变化规律，为构建酱香型白酒优良的发酵体系提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
酒醅样品、原酒样品，仁怀市某酱香酒酒厂；浓HCl、NaOH、葡萄糖、NaCl、蛋白胨、酵母膏，国药集团化学试剂有限公司；氨苄青霉素、制霉菌素，生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.2 仪器与设备
岛津GC-2010Plus气相色谱仪，日本SHIMADZU公司；HSP-250生化培养箱，上海精宏实验设备有限公司；SIN-R200D无纸记录仪、Pt100温度探头，杭州联测自动化技术有限公司；超净工作台，苏州净化设备有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 酒醅温度测定点与取样点的分布
堆积内部各测温点分布如图1-a所示；窖池内部以窖池纵向分布于窖池壁处(B)、窖池中心(C)及两点间中点(M)，再以窖池横向分布于窖池上(S)、中(Z)、下(X) 3层，共9个点，分布如图1-b所示。设置室温记录点1个，设置每10 min记录1次温度，待发酵结束后使用无纸记录软件读取温度数据。取堆腰表0 cm、堆腰内60 cm、堆腰内150 cm这3个位置点酒醅100 g为堆积检测样品；另取窖池内9个位置点的入、出窖酒醅100 g，按照上、中、下层混合并及时进行窖内发酵酒醅样品检测。
a-堆积尺寸及测温点分布；b-窖池尺寸及测温点分布
图1 堆积及窖池尺寸与测温点分布
Fig.1 The size of stacking and pit and the arrangement of sampling point
1.3.2 均温计算方法
全周期共采集33 536条堆积温度数据，349 920条窖内温度数据。优化各测温点的数值，整体均温的计算如公式(1)所示：
(1)
式中：
酒醅均温，℃；Tn，EC某一区域实际温度，℃；V0，酒醅EC总体积，m2；Vi，某一区域EC体积，m2；ki，系数比。
1.3.3 酒醅理化指标及微生物数量测定
理化指标如水分含量、酸度、还原糖、淀粉含量测定采用白酒发酵酒醅分析方法[15]。酵母菌、细菌等微生物计数采用稀释涂布平板法，其中酵母菌涂布于YPD培养基(添加100 mg/L氨苄青霉素)，30 ℃培养2 d进行计数；细菌涂布于LB培养基(添加100 mg/L制霉菌素),37 ℃培养1 d进行计数[16]。
1.3.4 原酒风味物质含量测定
取各轮次窖内上、中、下层醅所得成品酒为样品，用气相色谱法测定挥发性风味成分，以质量浓度20 g/L的乙酸正丁酯溶液作为内标溶液，色谱柱为LZP-930，操作条件参考万清徽的方法进行[17]。
2 结果与分析
2.1 全周期生产操作参数及相关分析
酱香型白酒生产全周期生产操作参数相关数据统计如附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20220228.1600.010.html)所示，结合图2表明，酱酒生产为二次投粮，八次加曲发酵，用曲量随周期先增后减。一～四轮次的出酒量、淀粉/酒精转化率明显高于其他轮次，总体呈“中间高，两头低”的趋势。
图2 不同轮次出酒量对比
Fig.2 The comparison of the yield of liquor produced in different rounds
2.2 发酵过程酒醅理化指标及微生物数量分布情况
2.2.1 理化指标
酒醅理化性质对分析发酵状态具有重要作用[18-19]。由图3和图4可知，(1)堆积前后，各位置点理化数值变化甚微，由此可推测堆积不是微生物代谢的主要阶段。(2)分析酒醅理化的周期变化可知，酒醅经逐次发酵后水分含量均值由40.87%逐渐升高至56.95%(质量分数)；酸度均值由3 mmol NaOH/10g酒醅增长至62.3 mmol NaOH/10g酒醅，其中下、造沙时期窖内发酵产酸多，升酸幅度高达21 mmol NaOH/10g酒醅；还原糖均值在0.7%～2.79%(质量分数)逐步增长，堆积前后呈增长趋势，而窖内发酵前后呈下降趋势；每轮次的酒醅淀粉消耗量的平均值为3.04%，含量由36%降至11.4%(质量分数)。(3)比较各层酒醅发现，下层酒醅水分含量及酸度最大；中层酒醅所含还原糖含量最高；上层酒醅淀粉平均消耗量为3.17%，中层为3.3%，下层为2.65%(中层>上层>下层)。
2.2.2 微生物数量
全周期微生物数量跟踪对比如图5和图6所示，(1)堆积后酒醅微生物数量均有增加，其中酵母菌增幅较大，在1.52×107～5.87×107 CFU/g。(2)堆积后细菌值于二轮次达最大值2.04×107 CFU/g后减少；酵母菌则呈“w”型变化，于一轮次达最大值6.02×107 CFU/g后减少。(3)各轮次酒醅经窖内发酵所含细菌和酵母均大幅减少，其中细菌以2～3个数量级减少，酵母更是以2～5个数量级减少，因此五、六轮次中的酵母极少。(4)下沙、造沙微生物数量多，一～六轮次，发酵后微生物数量值呈“中间高，两头低”的趋势，其中二轮次最高。此外各层酒醅微生物数量显示，上层细菌少至4.51×105 CFU/g，而酵母多达7.48×104 CFU/g；中层次之；下层细菌多达1.30×106 CFU/g，酵母少至2.22×104 CFU/g。
a-水分含量；b-酸度；c-还原糖含量；d-淀粉含量
图3 不同轮次堆积发酵酒醅理化指标的空间对比
Fig.3 The comparison of the space among the physicochemical indexes of the stacked fermentation grain in different rounds
a-水分含量；b-酸度；c-还原糖含量；d-淀粉含量
图4 不同轮次窖内发酵酒醅理化指标的空间对比
Fig.4 The comparison of the space among the physicochemical indexes of the pit fermentation grain in different rounds
a-细菌数量；b-酵母菌数量
图5 不同轮次堆积发酵酒醅微生物数量的对比
Fig.5 The comparison of the number of microorganisms of the stacked fermentation grain in different rounds
2.3 发酵过程酒醅温度分布动态分析
2.3.1 发酵过程平均温度变化动态分析
酒醅温度是反映发酵状态最直观的方式之一，如图7所示，全年室温均值为20.68 ℃，波动范围为7.1～33.9 ℃；堆积均温在22.04～44.24 ℃，窖池均温在23.37～41.64 ℃，均随室温波动呈先降后升的趋势。(1)季节对发酵存在影响。堆积发酵温度呈“v”型缓慢上升，室温越高，其堆积醅起始温度越高。此外，室温对窖内发酵也存在影响，秋冬季节醅温降温急剧，降幅在4.52～11.17 ℃；春夏季节醅温逐步升高并保持在30～35 ℃，且二～四轮次温度符合“前缓，中挺，后缓落”的变化趋势。(2)下沙、造沙时室温低，堆积醅温高，窖内降温快。结合前述分析，此阶段为前期准备阶段，酒醅酸度低，淀粉含量高，大曲的投入提供了微生物并在堆积时大量繁殖，因而均温可快速升至44 ℃以上。堆积后酵母虽大量繁殖，但综合分析得知，此时窖内发酵是以细菌代谢为主，淀粉消耗量较大，且大量产酸抑制了酵母作用，因此此阶段产酒量少。一～四轮次室温的回升，醅的酸度抑制微生物不如前期般大量繁殖，故而堆积醅温升温变缓并在30～35 ℃变化。与此同时室温的升高得以维持窖内发酵热，较适宜酵母生长代谢，因此此阶段产酒量大，淀粉/酒精转化率高，是以酒精发酵为主的主要发酵期。其中一轮次是由非酒精发酵过渡到酒精发酵的关键转折期。五、六轮次为收尾发酵阶段，室温较高，酒醅淀粉含量低、酸度高，因此非酒精发酵相对活跃，产酒量低，淀粉/酒精转化率低。(3)发酵前后细菌数量远大于酵母数量，但细菌与酵母的数量变化趋势大致相同，前期准备期酵母受细菌产酸抑制，而主发酵期酵母数量缓慢上升，这说明随着季节室温、加曲量及其他工艺参数等变化，酵母与细菌间的演替和相互作用得以体现，同时也直接表现在醅温变化、原酒产量的结果中。
a-细菌数量；b-酵母菌数量；c-发酵后细菌数量；d-发酵后酵母菌数量
图6 不同轮次窖内酒醅微生物数量的对比
Fig.6 The comparison of the number of microorganisms of the pit fermentation grain in different rounds
a-堆积内部均温；b-窖池内部均温
图7 不同轮次发酵过程均温变化趋势
Fig.7 The trend of the average temperature of the fermentation grains in different rounds
2.3.2 窖池内部酒醅温度具体分析
窖池不同位置点的酒醅温度变化如图8所示。由图8可知,(1)下沙至一轮次时期，低温区为SB、SM、SC 3点构成的窖池上层区域，均温在13.02～29.36 ℃，高温区由ZM、ZC、XM、XC 4点围成，此区均温为35.08～44.96 ℃。二～六轮次时期，低温区为由SB、ZB、XB 3点构成的窖壁区域，均温为20～33.63 ℃，高温区不变，均温为30.75～48.53 ℃。由此看出，窖池内部存在温度场，热量由窖池中心向周围层层传递。(2)初始阶段的醅温对发酵过程存在一定影响，入窖醅温在30～35 ℃，发酵呈“前缓、中挺、后缓落”的趋势。而窖醅温的不均匀性导致各位置点的醅温变化趋势大致相似。(3)发酵产热、传热不均致使温度分区，前期准备及收尾发酵阶段温度分区不规则是入窖醅温差异大或发酵力弱导致；主发酵期窖内温度分区规律，且中、高温区域温度变化趋于一致，此阶段产生大量的发酵热弱化了不均匀性对发酵过程带来的影响。各位置点醅温的差异随周期推进而减小。
a-下沙轮次；b-造沙轮次；c-一轮次；d-二轮次；e-三轮次；f-四轮次；g-五轮次；h-六轮次
图8 不同位置窖内酒醅温度变化对比
Fig.8 The comparison of the temperature changes of the pit fermentation grains at different position
2.4 原酒风味物质含量变化
全周期不同轮次各位置点酒醅所得原酒挥发性风味物质含量如附表2(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20220228.1600.010.html)及图9所示，(1)造沙轮次、一轮次发酵酒醅所得原酒挥发性风味物质中醇、酯含量高，酸相对低，酒体整体偏酸涩；二、三、四轮次原酒中醇低、酯低，酸低，三者差异较小，酒体较协调，此时期原酒口感为最佳；后期五、六轮次原酒醇高、酯高、酸低，酒体相对粗糙。这与尚柯[20]研究结果相一致。推测前期窖池各位置点醅温差值大，且发酵力不足，故而造成风味物质含量差异较大，后期醅温差值减小，故而差异随之减小。(2)窖内存在的“浓度场”对原酒成分组成有一定影响，如下层醅所含细菌多，酸度大，所得原酒酸含量高，中层还原糖含量高，所得原酒醛含量高；窖池上层醅所得原酒醇、酯、酸含量差异小，下层较大。(3)原酒中所含酯类物质约为8种，含量占比为28.34%；酸类物质为8种，占比为13%；可知酱酒是酯、酸含量较高的白酒，且各类物质种类丰富度随周期推进均有增加。
a-上层酒醅；b-中层酒醅；c-下层酒醅
图9 不同轮次各位置酒醅所得原酒风味物质含量的对比
Fig.9 The comparison of the flavor substance content of the liquor obtained from different positions of the fermented grains in different rounds
3 讨论
酱酒生产周期可划分为3个主要阶段：下沙、造沙为前期准备阶段，此阶段以非酒精发酵为主，细菌产酸高，产酒精相对较少；一～四轮次为主发酵期，此时室温适宜，产酒量大，淀粉/酒精转化率高，酵母发酵相对活跃；五、六轮次为收尾发酵期，气候炎热，淀粉含量低，产酒量下降，淀粉/酒精转化率低，非酒精发酵相对活跃。
原酒产量呈“中间高、两头低”趋势，风味特征围绕上述3个阶段分别具备明显特征，此现象背后是工艺始终围绕“控制适当的醅温和均衡的发酵”这一核心开展。一是“季节性生产”，利用室温变化防止过高或过低醅温带来的负面影响，主发酵期控制醅温保持在30～35 ℃，为微生物提供适宜的生长温度；二是“控制加曲量”，多次加曲保证了多次糊化、糖化后的酒醅淀粉含量，同时通过变化加曲量以弱化室温、醅的酸度高等因素对发酵的直接影响，形成相对平缓的发酵趋势；三是“堆积与窖内发酵结合”，堆积产热多，而窖内发酵以降温为主，二者协调作用也为平衡细菌和酵母两大主要菌群演替和相互作用，以保证适当的发酵进行。
无论堆积或是入窖发酵，固态发酵传热特点导致了非均匀发酵，其中存在温度场和浓度场是主要特征之一。从入窖温度分布可以看出，发酵初始阶段的不均匀性是造成实际发酵过程波动的原因之一，其次，环境温度(室温)对堆积和入窖发酵期间酒醅温度的影响较大，环境温度的波动变化也是影响发酵效果的重要因素。这些现象对酱酒生产产生了负面的影响，在今后的发酵系统及装备、工艺研究中应设法改进。
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