体外消化模型是模拟人类消化时真实的生理条件，是研究摄入物质的变化、相互作用以及营养物质生物可及性的有用工具[1]。真实的消化过程十分复杂且涉及多个器官以及激素、神经调节，简单来说可分为机械剪切和酶促转化，其中储存、混合、研磨和排空的机械剪切过程主要在胃阶段，大分子分解以及水和营养物吸收的酶促转化过程主要在小肠阶段[2]。为了充分了解食物对健康的影响以及与饮食相关的疾病，例如心血管疾病和2型糖尿病[3]，学者越来越多地开展对食品消化过程的研究。但体内消化有着高技术高成本及道德伦理的约束，因此学者对体外消化模拟的研究愈来愈丰富。理想的体外消化模型应该具备以下特点：(1)在短时间内提供准确的结果；(2)可作为快速分析不同成分的食物或食物结构的工具[1,4]。
1 体外消化模型概述
体外消化是近二十年的研究热点之一，普遍适用于蔬菜、乳制品、烘焙食品、肉类食品、海鲜食品和鸡蛋食品[1]，其较多的是对上消化道进行模拟研究，可分为静态、半动态和动态模型。各模型具有不同的消化参数：(1)消化流程中所包含的步骤数量和类型不同(根据研究目的的不同，可以包括口腔、胃和小肠的部分或所有阶段，在某些情况下，还可以包括大肠发酵阶段)；(2)每个阶段消化液的化学组成、酶浓度以及盐缓冲液、生物聚合物、表面活性剂等成分不同；(3)机械应力以及在消化过程中流体流动不同，施加应力的大小和方向、模型的几何形状等不同[1,5]。
1.1 静态模型概述
静态体外消化模型是最简单也是应用最广泛的体外消化模型，实验材料相对廉价易得，可分为仅含胃相或肠相的单隔室和包括口腔、胃、小肠的多隔室。其模拟参数都是固定的，这意味着每个相的分泌物比率、pH值以及生物活性剂浓度在整个相都是恒定的[6]。由于简化了消化过程，无法模拟消化过程中的机械力、流体动力及生化环境的变化，故静态模型主要用于条件假设和目的筛选[2]。
研究表明，不同的模型参数会使静态模型呈现不同程度的差异性[2,5]。而标准的静态体外消化模型(INFOGEST)将参数标准化，使各实验间的可比性增强，是一套适合成人的食品静态体外消化模型。自2014年发表以来[7]，已被学者广泛应用在食品体外消化模拟中[1,5]并在2019年进一步完善为INFOGEST 2.0[8]。该模型的消化过程分为3个阶段。首先是准备阶段：酶活性和胆汁的测定；模拟唾液(simulated salivary fluid，SSF)、模拟胃液(simulated gastric fluid，SGF)、模拟肠道液(simulated intestinal fluid，SIF)的制备和pH测试。其次是消化阶段：(1)口腔阶段：食物和SSF进行1∶1混合，加入CaCl2及唾液淀粉酶，在37 ℃、pH=7的条件下混合孵育2 min。(2)胃阶段：口腔食糜和SGF以1∶1混合，加入胃蛋白酶、胃脂肪酶在37 ℃、pH=3的条件下混合孵育2 h。(3)肠阶段：胃食糜与SIF以1∶1混合，加入胆汁、胰酶在37 ℃、pH=7的条件下混合孵育2 h。最后是取样阶段，根据具体实验目的选择不同的消化阶段取样[8]。
将牛奶在人体内的消化研究对比INFOGEST静态消化模型模拟的牛奶体外消化以及模拟脱脂奶粉的体外消化对比脱脂奶粉在猪体内的消化研究发现，体内体外消化有着良好的相似性[9-10]。这证明了INFOGEST静态消化模型在食品应用中的可靠性。有研究报道，通过INFOGEST静态消化模型从3种分离蛋白(胶原蛋白、玉米蛋白和乳清蛋白)和5种食物(高粱粉、小麦麸皮、花生、黑豆和木豆)中得出木豆是最适合人体营养需求的蛋白食物[11]。FERNANDES等[12]等则通过INFOGEST静态消化模型模型分析了3种Carolino水稻(Carolino white-Cw、Carolino brown-Cb 和 Carolino Ariete brown-CAb)的淀粉消化，定性定量地描述了米饭的消化过程，并实现了与其他实验室进行联网比对。INFOGEST静态消化模型也存在着局限性，其仅适用于胃、肠端点的取样研究[1,6]，无法准确地模拟更复杂的体内条件，如生化环境的动态变化、物理剪切力和研磨力的作用，这些可能会对较大颗粒食物的分解和营养物质的释放产生影响。
1.2 半动态模型概述
半动态消化模型是至少模拟一个胃肠道的动态特征，介于复杂的动态模型和更简单的静态模型之间的中间系统，主要用于胃阶段，模拟了食糜的pH值变化或控制酶促释放等动态过程。目前大多数半动态模型的研究都集中在模拟胃液pH值的动态变化和胃蠕动力、剪切力等力学研究[6]。胃液pH和胃动力对蛋白质水解有一定影响，尤其是胃蛋白酶活性的改变。胃液pH的变化影响蛋白质构象和结构，继而影响蛋白水解性，也会影响其他常规营养素的消化[6,13]。研究中通常使用pH-stat法控制液体分泌进而控制pH值，还可以结合计算机自动化控制滴定来模拟梯度变化。若采用半动态模型来研究胃行为，需仔细考虑混合机制，大多数半动态模型通常使用的是磁力搅拌器，但这可能会破坏模拟胃内食物的结构变化。最后，应该考虑模拟胃的形状，它可能会影响剪切力。胃是J形器官，这种形状的结构模拟比较困难，因此圆柱形状容器是半动态模型中最常见的形状[2,6]。
与静态模型相比，半动态模型可以获得有关胃阶段营养物的消化及食物结构变化的动力学数据，而不仅仅是提供不考虑可能的结构变化下的胃、肠消化端点的评估[14]。这对于理解营养物的消化、食物的结构变化、生物利用度以及吸收动力学等研究至关重要。特别是对于一些容易排空或者对胃消化中pH值敏感的食物，半动态模型可以更好地了解食物的分解和营养释放，以便更好地设计膳食[13]。例如，可通过体外消化模拟来了解食品的消化机制，逆向设计出不同营养消化率的食品来满足不同人群的营养和健康需求[15]。半动态模型的容量比动态模型的大，且更为简单、低成本，它也可以轻松地适应其他消化参数的变化，如pH值，酶的分泌速率等。它们通常不涉及复杂的软件，所以被改编为成年人以外的其他年龄段的消化模型就较为简单[6]。MULET-CABERO等[14]基于INFOGEST静态消化模型，重点模拟了胃液分泌和排空的瞬时特性，设计了一个适用于成年人上消化道的半动态消化模型，该模型可以轻松地用于世界各地的实验室和各种食品中。
1.3 动态模型概述
相较于静态和半动态模型，动态模型更复杂也更接近人体内的消化过程，近年来开发了多种动态消化模型，可简单分为单隔室和多隔室。其研究主要集中在几何学、物理力学和生物化学三方面的模拟[16]。
1.3.1 单隔室动态模型
Dynamic Gastric Model(DGM)是由食品研究所(Norwich，UK)开发的，结合了计算机和数学建模来模拟人胃消化过程中生化过程和机械过程的模型[17]。重点模拟了胃粘膜的分泌和蠕动收缩，系统可根据计算出的排空速度和食物基质的物理特性来调整酸和酶的添加，比较进食和禁食状态及研究不同基质对营养物质的影响。该系统底部设有pH电极，配合胃壁加酸加酶装置，可根据实际的膳食动态来调整分泌物的添加。且装置下端由一个桶和一个活塞组成，通过上下运动对胃窦内容物施加剪应力，桶顶部设计的可弯曲环，在每次击打时食物会通过这个环，配合酸化推注，模拟了人胃节奏性的蠕动收缩[17-18]。该剪切力是经过实验验证的，这种剪切力得到验证的模型还有Human Gastric Simulator(HGS)、和TIM-agc[16]。
由于它能够精准地处理膳食过程，模拟胃在正常生理范围内的混合、运输和分解力，且在总消化期间内的任何时间点都可采集样品，这使得DGM也越来越多地被制药业用作研究食品基质对药物制剂的影响以及药物的运输。如CHESSA等[19]探究食物对缓释剂型(例如亲水性基质)生物性能的影响时，发现对比传统的药典测试，DGM可以提供关于剂型特性更详细的机械信息。但DGM仅模拟了胃腔的行为，如果要充分研究营养素或生物活性物质的消化，则需要与模拟口腔、大肠的系统联用[18]。
除了应用较多的DGM模型外还有HGS、Artificial colon(ARCOL)等模型。HGS的特点是模拟胃壁的连续蠕动及收缩力的幅度、频率与体内报道的相似。该系统主要由一个模拟胃腔的乳胶容器和一系列固定在皮带上的滚轮组成，这些滚轴由电机和滑轮驱动以产生乳胶壁的连续收缩。它还结合了胃液分泌、排空系统和温度控制，能够准确模拟动态消化过程，以详细研究摄入食物的物理化学性质的变化[20]。其可容纳膳食及分泌物的体积为0.9～1.0 L，适合于量大的样品分析，典型样本(餐)大小为150～300 g，对于某些高价值的化合物或成分，会产生较高的成本。而ARCOL模型是模拟人或动物结肠环境下消化道单阶段的发酵模型，通过微生物群来维持代谢活性，搭配透析纤维以模拟被动吸收，可评估单次或重复使用目标化合物(食品成分、益生菌、药物等)对肠道菌群组成及活性的影响[16,18]。
1.3.2 多隔室动态模型
相较于单隔室，多隔室系统会更加全面、精准，有类似于DIDGI®、TNO Gastro-Intestinal Model(TIM)这种相对成熟的模型，也有很多处于不同研发阶段的新兴系统。DIDGI®是由法国国家农业研究所INRA 开发的一种两室(胃和小肠)体外动态胃肠消化系统。胃、小肠两个连续隔室都由配有水浴泵的玻璃夹套包围，并配备温度、pH以及氧化还原传感器和变速泵。由StoRM软件控制计算机从体内研究中获得例如进餐数量、持续时间、胃和小肠的 pH曲线、不同隔室的分泌率以及胃和小肠的排空率等参数，来建立消化方程，实现体外消化模拟。胃和肠间还可以放置带孔(2 mm)聚四氟乙烯膜，以模拟人体幽门的筛分效果[18,21]。该系统致力于探究胃肠道中食物的分解机制、确定消化过程中释放的分子及确定食物基质的结构影响食物消化和营养的生物可及性、生物利用度的机理。最后，将这一系列研究转化为数学模型，以便逆向设计出更符合人类营养健康需求的食物。REYNAUD等[22]以DIDGI®模型测得豆腐在胃、十二指肠和回肠的消化参数对比于小猪体内的消化，显示其蛋白质分解模式基本一致，且总体动力学高度相似。
TIM是1990年代初期开发的多隔室模型，从一个实验室设置开发成一个机柜系统平台。该系统旨在模拟真实的胃肠道内腔动态条件及预测存在于各种食品和药物基质中摄入化合物的生物可及性[16]。将系统模型的可控性和再现性与生理学参数相结合，如混合、膳食转运、pH曲线、消化持续时间、分泌率和消化液体的成分以及消化的吸收。这些参数组合作为特定的消化环境由计算机输入模拟。其参数设置包括不同物种(人、狗、猪)、不同年龄(婴儿、成人、老年人)以及某些特殊病理的膳食消化数据，都是从体内研究中获得的[23-24]。TIM-1是TIM平台最常用的配置，包括胃、十二指肠、空肠和回肠4个隔室，由蠕动阀泵PVP连接，通过控制柔性壁外循环水温实现控温及改变柔性壁上压力来实现混合。消化产物中水溶性成分是通过膜透析去除，亲脂性成分通过50 nm 过滤器去除，该过滤器可通过胶束保留脂肪滴。TIM-1还是高脂肪膳食模拟的经典系统[16,25]。Tiny-TIM是TIM-1的简化版，与TIM-1相比旨在提高通量，只有一个小肠腔室，没有回肠流出物[26]。该平台还有侧重对胃内容物混合均质及胃的排空模拟的TIMagc系统、对大肠消化模拟的TIM-2。即使在今天，它仍是一个持续的优化过程，例如模拟婴儿胃肠道状况或老年人胃肠道[16,18]。
模拟人体肠道微生物生态系统的Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem(SHIME®)模型，与体内胃肠道微生物群落的研究对比显示两者有着良好的相似性[27]，继而还开发了对照研究的TWINSHIME®系统，以及TripleSHIME和QuadSHIME模型。SHIME®还在持续不断研发中，最新进展有自动化控制(即液体转移，pH，冲洗)、数据采集以及模拟小肠等[16,18]。Engineered Stomach and small INtestine(ESIN)系统创新在胃腔结构的模拟，可重现体内观察到的胃排空的两相性质。但是ESIN是一种新模型，到目前为止，它仅在液体消化过程的制药应用中得到验证[28]。SIMulator of the Gastro-Intestinal tract(simgi®)是由计算机控制模拟胃肠消化、大肠微生物群代谢转化的模型。其优势在于灵活，允许在不同隔室中分开工作或联合执行，在急性和慢性条件下都可控制食物运输，且接近人类的真实体积。透明窗口的设计可以随时从胃内容物中取样，并观察食物的消化过程，但缺少肠道吸收模拟，系统参数还需要体内实验进一步验证[18]。
2 体外消化模型的应用
2.1 营养物质的消化研究及功能性食品的开发
虽然各体外消化模型无法完全复刻体内的消化过程，但对于蛋白质、碳水化合物、脂肪及微量元素和植物化学物质的生物可及性分析及预测它们在体内消化的结果时还是非常有用的[19,22,29]。其中淀粉的消化一直是研究的重点，JENKINS等[30]通过临床试验首次验证了食物血糖指数与淀粉消化之间的相关性，继而修改成以GR曲线面积来监测淀粉的消化[6,29]。ENGLYST等[31]通过体外模拟胃肠道消化，创新性地将淀粉分为快速消化淀粉、慢消化淀粉和抗性淀粉进行研究，极大推进了淀粉消化研究的进程。值得注意的是，胃的排空对血糖反应的影响较大，若采用静态模型研究淀粉的消化，可能会低估其水解量[6,29]。关于蛋白质的消化研究除了常见指标——蛋白质消化率校正后的氨基酸分数和氨基酸评分外[6]，对蛋白质消化物的功效性探究也越来越多，例如牛奶miRNAs的功效性就存在争议，其是否能够在消化过程中保持稳定性，通过肠细胞进入人体的吸收循环系统？RANI等[32]通过肠上皮细胞模型(caco-2)模拟牛奶胃肠消化来评估牛奶miRNAs消化、吸收和转运的稳定性，验证了牛奶miRNAs的功效性，使其成为牛奶中具有功能和生物活性的成分。有研究表明，静态模型可提供同体内有着良好相似性的蛋白质消化结果，由于pH值动态变化和蠕动运动对蛋白质的影响较大，(半)动态模型在蛋白质消化动力学方面极具研究潜力[6]。
体外消化模型除了应用于营养物质的消化分析，也可用于功能性食品的开发，在功能性食品开发的配方方面，SUCCI等[33]在含有80%可可和高总酚含量的黑巧克力上添加不同益生菌菌株，通过体外消化模拟及益生菌存活率测定，发现GG和F19菌株最佳。与传统的益生菌产品(酸奶)相比，这种黑巧克力是一种可在常温下较长时间保存的即食益生菌食品。在功能性食品开发的加工工艺方面，AHMAD等[34]将白藜芦醇采用纳米技术封装在3种不同的淀粉(荸荠、马蹄、莲藕)中，经过体外消化模拟以及测定其包封率、粒径和Zeta电位，结果显示纳米包封体系具有更好的热稳定性、较高的抗糖尿病和抗肥胖活性。
2.2 食物中生物活性化合物消化后的抗氧化性研究
近些年食品中多酚类、维生素和类胡萝卜素等生物活性化合物的潜在功能的研究日益增长。因为这些化合物可以通过Hydrogen Atom Transfer(HAT)、Single Electron Transfer-Proton Transfer(SET-PT)及Sequential Proton Loss Electron Transfer(SPLET)机制清除自由基达到抗氧化效果[35]，有利于预防糖尿病、高血糖等代谢疾病[36]。这些物质的有效性很大程度上取决于其生物可及性，受化学环境、食物基质、与其他成分相互作用、加工工艺等影响[35]。有研究表明，生物活性化合物的含量与其消化产物的抗氧化性有时是正相关有时负相关或呈无相关性[1,6,35]。QUAN等[36]以苹果汁、橙汁、葡萄汁、柚子汁及猕猴桃汁5种食物采用静态模型模拟胃、肠室的消化并对消化物进行ABTS测定评估消化物的抗氧化力，发现苹果汁的抗氧化活性与总酚含量呈正相关，但橙汁和葡萄汁呈负相关性。造成这种矛盾实验结果的原因可能是：(1)食物基质的影响，如有研究发现麸皮的研磨和静电分离提高了香豆酸和芥子酸的生物可及性[37]；(2)不同消化模型的生理条件不同，从而影响酚类成分的消化。基于pH值对各类次级代谢产物清除自由基机制的影响，不同酸碱环境下其抗氧化活性是显著不同的[35]，例如芦丁、绿原酸在pH=1.5、5.8时，具有很好的亲水亲油性，可以跨膜转运并被吸收，pH=7.8时，其水溶性不强，不能被吸收[38]。当然，不同实验室间矛盾的实验结果还可能是样本中营养成分的相互作用、抗氧化性的测定方法不同等原因。
为了深入了解这些生物活性化合物的消化过程，充分发挥其潜在的有益作用，需要对模型的选择及消化产物的测定逐步达成共识[35,39]。模型的多样性不仅会妨碍各实验室研究结果的比较，还增加矛盾结果出现的可能性。因此，应该仔细考量试验的研究目的，选择最适合的消化模型。对于深入了解消化对某一种物质的影响时，基于有限的样本量或消化高相关性的要求，显然动态模型更为适合[39]。WANG等[40]采用TIM-1系统模拟鸡蛋在胃肠道的消化并对消化产物进行抗氧化性分析，确定了4种多肽、鉴定出抗氧化活性最高的肽含量，证明了煮熟鸡蛋在消化中会产生更强的抗氧化肽，这对人体氧化应激有益。为进一步研究消化过程，还可采用动态消化系统与细胞模型耦合的形式。如果是假设分析或对样本进行筛选，则相对简单高效的静态模型更为适合[39]。PAPILLO等[41]对5种不同食物基质(苹果、菠菜、核桃、红豆和全麦)进行多步酶解的静态消化模拟，并测定各个步骤消化和未消化食材的总抗氧化能力，结果显示核桃具有最高的总抗氧化能力值。
2.3 食物过敏的消化性研究
食物过敏是人体对食物产生不利的免疫应答反应，分为IgE介导和非IgE介导两大类[42]。虽然具体的过敏反应机制尚未明确，但过敏都存在一个普遍现象：即消化障碍。20世纪90年代中期，发表了第一篇以消化障碍来筛选食物过敏原的文章，继而开发了以SGF评估食物过敏蛋白潜在致敏性的体外消化试验[43]，欧洲食品安全局也采纳了这一观点，但是也有研究表明，食物过敏原与消化稳定性没有严格的关系[44-45]，过敏原不一定有消化障碍。BØGH等[45]通过IgE结合、诱导或致敏能力来评估致敏性，研究表明消化可能消除、减少、无影响甚至增加食物过敏原的致敏性。一方面因为“不完全”过敏原(如Bet V1等)容易被分解。另一方面是因为消化率的测定会受众多因素影响，具体有：(1)消化系统的情况(pH值、表面活性剂、美拉德等食品加工及食物基质)不同[46]；(2)蛋白酶与过敏原的比率及蛋白酶活性的测定方法不同；(3)评估蛋白质和多肽的方法不同。基于没有共同的物理化学性质能够真正区分食物过敏原和非过敏蛋白，体外消化模拟依旧是目前用于评估新蛋白质致敏性的重要方法[44]。
PINTO等[47]通过模拟胃肠道消化对Mo-CBP3蛋白进行了早期的食品安全评估。体外消化模型可提供一个蛋白质相对完整性的消化及其引发过敏反应可能性的信息，这需要人们就蛋白质的稳定性与过敏原的相关性达成共识且建立标准化的分析条件[44]。其中关于消化过程的模拟，不少研究人员对SGF中模拟的生理条件进行了调整，如胃蛋白的浓度和pH值等，这些调整不利于实验间的比较。越来越多的学者呼吁建立标准化的消化模型，其中有对静态SGF模型的改良建议也不乏考量模拟动态生理环境的声音[44,48]。体外消化模型除了可对新蛋白质致敏性进行预测外，还可用于降低致敏性加工工艺的筛选，STASIO等[49]将整个生花生和烤花生进行对比研究，将口腔、胃和十二指肠消化模型与刷状缘膜酶结合起来，以模拟肽的空肠降解。结果显示烘烤提高了花生的消化率、降低了变应原性，肠肽酶进一步破坏了花生过敏原的特定结构域从而降低了致敏性。
3 结论与展望
由于体外消化模型相较于体内更方便快捷、重现性好、成本低且无道德约束，其越来越受到欢迎且广泛应用于食品领域。目前虽然在改进体外消化模型方面已经取得重大进展，但未来仍有大量工作需要改进：(1)大多数体外消化系统很少结合胃肠道的形态和解剖结构；正如上述阐明消化模型是从几何学、物理力学和生物化学三方面去模拟消化，为了构建更真实的体外消化模型，需要多考虑肠道形态学和解剖学细节，如肠绒毛、皱纹等。(2)目前消化系统没有一个包括从口腔到大肠的全部步骤；消化是一个连续且复杂的过程，从口腔的咀嚼、吞咽到结肠的吸收作用都不可或缺。将口腔装置与胃肠道系统、细胞模型耦合可更真实地模拟体内的消化过程。(3)体内和体外的相关性还需要更多更广泛的试验来验证。(4)关于模型的选择和结果的解释说明；哪个模型最准确地反映消化的过程？哪个模型成本最低？人们势必会在生理相关性和经济性之间综合考虑。
体外消化模型在食品中的应用从最初的消化率、稳定性到结构变化、生物可及性、抗氧化性和结构分析，逐步发展到功能性食品的开发、转基因食品过敏原的安全性评估，其应用面越来越广泛、探究的点越来越深。面对未知的问题，选择不同的体外消化模型工具，必然会产生不同的试验参数，这不利于实验间的比较和进一步消化分析。因此，在相似的研究需要下，应该逐步达成生理条件的共识，形成标准化，从而促进目标物的消化研究，也为模型的完善积累经验。综上所述，构建一个被广泛认可和应用的体外消化模型是一个需要长时间积累及不断地改进技术的过程。
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