近年来，随着产品多元化发展和人们营养健康意识的增强，消费者对高品质食品的需求日益增长。非浓缩还原(not from concentrate，NFC)果汁，即鲜榨果汁，因其最大程度地保留了果汁原有的风味和口感，符合人们对健康、天然、安全食品的追求而受到广泛关注[1-2]。中国是世界上苹果种植规模最大、产量最高的国家[3]，而苹果汁是重要的苹果深加工产品之一，可以有效地解决苹果采后过剩问题，并增加苹果产品的附加值。虽然我国苹果汁市场仍以浓缩汁为主，但NFC苹果浊汁的市场占有率正在不断增长。与苹果浓缩汁相比，NFC苹果汁不仅含有更多的果肉纤维和更饱满的口感，多酚和果胶的含量也更加丰富[4]，但浑浊不稳定、易分层已严重制约了NFC苹果汁产业的发展[5]。
影响苹果浊汁浑浊稳定性的主要因素是果汁中分子间的相互作用和颗粒的聚合，其沉淀颗粒物主要包含多酚、蛋白质和果胶[6]，不溶性淀粉也是造成苹果浊汁沉淀的主要原因之一[7]。虽然，目前已有不少研究关注NFC果汁的品质及其稳定性，但主要集中在对比不同加工方式和贮藏期[8-9]，对原料加工特性的研究较少。另外在实际生产中，用以榨汁的苹果原料多来源于采摘后的库存苹果，冷藏过程中催熟气体(如乙烯)的释放会造成苹果出现后熟，随着贮藏时间延长，乙烯等气体不断累积，苹果逐渐成熟直至衰老[10]。然而，原料后熟对NFC苹果汁浑浊混定性的研究还未见报道。
因此，本研究以华硕、富士、嘎啦、金冠、澳洲青苹等5个品种的苹果作为研究对象，并模拟苹果果实采摘后，4 ℃冷库贮藏，测定不同后熟度的苹果原料制作的NFC苹果汁的理化特性(pH值、可溶性固形物和可滴定酸)、浑浊稳定性(浊度、ζ-电位和粒度)和沉淀敏感物质(不溶性淀粉、总酚、可溶性蛋白和果胶)的变化趋势，进而分析影响NFC苹果汁浑浊稳定性的重要因素，为改善NFC苹果汁浑浊稳定性提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
苹果原料均产自云南昭通，由昭通超越农业有限公司提供，于2019年9月收获，共采收了色泽、质构差异较大的5个商业品种作为研究对象，分别为华硕、富士、嘎啦、金冠和澳洲青苹，采收果实均无机械损伤和病虫害(图1)。苹果采摘后于4 ℃冷库贮藏，根据贮藏时间分为3个后成熟阶段，分别为刚采摘(Ⅰ)、冷藏30 d(Ⅱ)和冷藏60 d(Ⅲ)。
抗坏血酸(食品级)，麦克林生化科技有限公司；可溶性淀粉标准品、没食子酸标准品、半乳糖醛酸标准品和考马斯亮蓝G250，上海阿拉丁生化科技有限公司；其余试剂均为分析纯，上海源叶生物科技有限公司。
a-苹果果实；b-苹果果汁
图1 不同品种和后成熟度的苹果果实和果汁
Fig.1 Different cultivar and late ripening stages of apple fruits and juice
1.2 仪器与设备
JYZ-E3榨汁机，九阳股份有限公司；L-550离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；FE28型pH计，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；TD-45数显糖度计，北京金科利达电子科技有限公司；UV-6100S型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；Spectra Max M5多功能酶标仪，美国Molecular Devices公司；907型自动电位滴定仪，瑞士万通公司；Agilent 1200高效液相色谱仪、1260系列蒸发光散射检测器，美国Agilent公司；Asahipak NH2P-50 4E色谱柱，日本Shodex公司。
1.3 实验方法
1.3.1 苹果汁的制备
为了降低压榨过程中NFC苹果汁的褐变程度，首先将苹果去皮、去核、切块，用螺旋榨汁机进行榨汁，并加入0.500 g/L食品级抗坏血酸[8]。苹果汁经过胶体磨和高压均质(20 MPa)后，混匀分装至150 mL塑料瓶。部分样品在处理后立即测定浊度、ζ-电位和粒度，其余样品用液氮进行速冻，并于-18 ℃冷冻保存，需测定其他品质指标前，水浴解冻至室温。
1.3.2 pH值、可溶性固形物、可滴定酸的测定
首先将果汁混匀，采用pH计测量每个样品的pH值；采用数字折光仪测定可溶性固形物，结果以°Brix表示。所有测量在室温下进行，均重复3次。
采用电位滴定法测定样品的可滴定酸[9]，首先取10 g果汁稀释至250 mL，通过自动电位滴定仪用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液滴定至终点pH 8.1，每个样品均进行3次平行实验。记录消耗NaOH标准溶液的体积，最终结果以苹果酸计。可滴定酸的含量计算如公式(1)所示：
可滴定酸
(1)
式中：V为滴定消耗氢氧化钠溶液体积，mL；C为氢氧化钠溶液浓度，0.1 mol/L；W为果汁质量，g；K为苹果酸折算系数，0.067。
1.3.3 浊度的测定
果汁的浊度采用紫外分光光度计法测定[9]。取10 mL苹果汁在室温4 200×g离心15 min，取上清液在660 nm下测定吸光值，每个样品均进行3次平行实验。浊度计算如公式(2)所示：
浊度=100-100×10-Abs
(2)
式中：Abs为样品在660 nm下的吸光值。
1.3.4 ζ-电位的测定
ζ-电位的测定首先将5 mL苹果汁在4 ℃下离心(4 200×g)15 min后，取上清液，在室温条件下用动态光散射纳米粒度分析仪测定ζ-电位[11]。控制温度为10 ℃，选择水为溶剂的参比体系。每个样品均进行3次平行实验。
1.3.5 粒度的测定
采用动态光散射法测定苹果汁粒度大小和分布，首先将苹果汁加入到以水为介质的烧杯中，样品稀释后用激光束照射，每个样品进行3次平行实验。
1.3.6 不溶性淀粉的测定
采用碘量法测定样品中不溶性淀粉的含量[7]。首先取5 mL果汁，通过1 000×g离心20 min，收集沉淀，并将沉淀物悬浮于2 mol/L NaOH中溶解，并用0.1 mol/L醋酸缓冲液(pH 4.6)稀释。用碘量法测定沉积物中的不溶性淀粉。每个样品进行3次测定。
1.3.7 单糖的测定
参照YI等[12]的方法测定苹果汁中的单糖含量，并稍作修改。将10 mL果汁与500 μL试剂1{150 g/L K4[Fe(CN)6]}和500 μL试剂2(300 g/L ZnSO4)混匀，静止30 min后，8 000×g离心20 min，上清液过0.45 μm过滤糖的分析使用高效液相色谱系统结合蒸发光散射检测器，5 μL稀释提取液通过Asahipak NH2P-50 4E色谱柱在30 ℃下等度洗脱(75%体积分数乙腈-水)，流速为1 mL/min。以葡萄糖标准溶液的保留时间进行鉴别。用标准溶液的校准曲线进行定量。每个样品的提取和分析重复3次。
1.3.8 总酚的测定
总酚的提取和测定参照WANG等[13]的方法。首先，将2 mL苹果汁中加入8 mL的80%(体积分数)的甲醇溶液，常温超声提取15 min，8 000×g离心15 min，取上清液，即为多酚粗提液。重复上述操作2次保证提取完全。采用福林酚法测定总酚含量。福林酚试剂用蒸馏水按1∶9(体积比)稀释，取0.4 mL 多酚提取液样品与2 mL稀释的福林酚试剂混合，加入1.8 mL 75 g/L的Na2CO3溶液，常温避光下反应2 h，用酶标仪测定765 nm处的吸光值，总酚含量以100 mL样品含有相当于mg没食子酸表示(mg没食子酸/100 mL)。每个样品进行3次平行实验。
1.3.9 可溶性蛋白的测定
采用考马斯亮蓝法[14]测定果汁中的可溶性蛋白。取苹果汁0.5 mL加入试管，然后在其中加入4.5 mL 的蛋白质反应液，用漩涡振荡器快速混匀后，静置2 min，再用紫外分光光度计测定595 nm下的吸光值。用0.50 mL的蒸馏水代替果汁作为空白，每个样品进行3次平行测定。
1.3.10 果胶的测定
按照FRAEYE等[15]方法提取苹果汁中的醇不溶性物质。将50 mL苹果汁与320 mL 95%(体积分数)乙醇混合后，用打浆机搅拌3次，每次6 s，抽滤得到沉淀，将沉淀再次与160 mL 95%乙醇混合，重复上述操作，最后用丙酮冲洗得到白色、均一的粉末，于40 ℃烘箱中干燥至恒重。用分光光度计按照比色法测定果胶含量。在10 mg乙醇不溶物中加入5 mL浓硫酸-四硼酸钠溶液(0.015 mol/L)后立刻放入冰水浴中，避免温度上升过快。用混合器混合后，放在100 ℃水浴中加热5 min，反应后立刻放入冰水浴中，直到达到室温。加入0.1 mL间苯基苯酚溶液，混合后于520 nm处读取吸光值。每个样品进行3次平行实验。
1.4 数据统计与分析
采用Excel 2010软件对实验数据进行处理，采用SPSS 19.0软件对实验数据进行显著性分析，采用Tukey检验分析显著性水平(P<0.05)，采用Origin 8.0作图。
2 结果与分析
2.1 NFC苹果汁理化特性分析
pH值、可溶性固形物和可滴定酸是NFC果汁加工重要的品质控制理化指标。如表1所示，不同品种的苹果浊汁pH值存在显著差异，嘎啦苹果汁的pH值最高(3.88～4.02)，其次是华硕(3.79～3.92)，澳洲青苹的pH值最低(3.12～3.24)。随着不断后熟，苹果汁pH值呈现上升趋势。高丽萍等[16]在NFC草莓汁也发现相似的趋势。
表1 不同品种和后熟度NFC苹果汁pH值、可滴定酸和可溶性固形物
Table 1 pH value, total soluble solids, and titratable acids of NFC apple juice during late ripening
理化指标后熟度华硕富士嘎啦金冠澳洲青苹Ⅰ3.79±0.01Da3.68±0.01Ca3.88±0.01Ea3.62±0.01Ba3.12±0.01AapH值Ⅱ3.87±0.01Cb3.87±0.01Cb4.00±0.01Db3.70±0.01Bb3.18±0.01AbⅢ3.92±0.01Dc3.87±0.01Cb4.02±0.01Ec3.82±0.01Bc3.24±0.01AcⅠ0.97±0.18CDb0.73±0.09BCa0.64±0.01Aa0.66±0.02Aa1.16±0.05Db可滴定酸/%Ⅱ0.19±0.12Aa0.29±0.03Bb0.23±0.01Bb0.21±0.03Ab0.31±0.01AaⅢ0.19±0.01Ca0.29±0.0Bc0.23±0.02Ac0.21±0.01Bc0.31±0.01DaⅠ10.67±0.25Cb12.23±0.21Db11.17±0.06Cb9.27±0.25Ab10.03±0.15Ba可溶性固形物/ °BrixⅡ10.03±0.15Ba12.30±0.10Db11.57±0.06Ca9.60±0.10Aa11.40±0.10CbⅢ9.90±0.20Ba10.73±0.15Ca11.27±0.06Db8.47±0.06Aa11.20±0.00Db
注：同行不同大写字母表示品种间差异显著(P<0.05)；同列不同小写字母表示成熟度间差异显著(P<0.05)
可滴定酸是体现NFC果汁酸度的重要指标。品种对NFC苹果汁可滴定酸含量的影响显著，其可滴定酸含量由高到低依次为：澳洲青苹(1.16%)> 华硕(0.97%)> 富士(0.73%)> 金冠(0.66%)> 嘎啦(0.64%)，与NFC苹果汁pH值呈正相关。随着贮藏期延长，苹果汁可滴定酸含量均呈现下降趋势，进一步验证了NFC苹果汁在后熟过程pH值上升的趋势。这可能是因为果实成熟过程中有机酸转变为碳水化合物或者被氧化，导致有机酸含量下降[16]。王志华等[17]在“塞外红”苹果中也发现相似的变化趋势。
品种和后熟度对苹果汁可溶性固形物影响显著。富士的可溶性固形物含量最高(约12.23 °Brix)，其次是嘎啦(约11.17 °Brix)、华硕(约10.67 °Brix)和澳洲青苹(约10.03 °Brix)，金冠苹果浊汁的可溶性固形物含量最低(约9.27 °Brix)，对应甜味依次减弱。随后熟度增加，澳洲青苹的可溶性固形物含量增加，这可能是由于淀粉转化成了可溶性糖[7]，而华硕、富士和金冠苹果汁的可溶性固形物含量出现先升高后下降的趋势这可能是因为苹果贮藏中后期淀粉被转化殆尽，果实开始衰老，可溶性固形物作为果实的呼吸底物不断被消耗导致其逐渐下降[16]。嘎啦苹果汁的可溶性固形物含量未发生显著变化。
2.2 NFC苹果汁浊度分析
浊度能直接反映出果汁体系的稳定性，其值越大，果汁体系越稳定[18]。由图2可知，不同品种苹果汁浊度差异显著，采摘初期(Ⅰ)，华硕苹果汁的浊度最低，仅为4.21，嘎啦苹果汁的浊度最高(27.89)。随着不断后熟，NFC苹果汁的浊度增加，这与赵光远等[6]的研究结果一致。后熟阶段Ⅱ时，金冠的浊度上升值至最大，约为45.05，其次是嘎啦(23.81)，而富士和澳洲青苹的增长量较少，分别为3.14和5.33。华硕的浊度在前2个阶段未发生显著性变化。在第Ⅲ阶段时，华硕、富士、金冠和澳洲青苹NFC苹果汁的浊度均增加，嘎啦苹果汁的浊度减少，这可能是由于果胶含量的变化导致的[19]。
浊度变化与观察到的苹果汁浑浊稳定状态一致(图1-b)。后熟初期，苹果浊汁均出现肉眼可见的分层沉淀，对应浊度值低。随着成熟度增加，嘎啦和金冠的混浊稳定性在第Ⅱ阶段得到显著改善，浊度值分别增加至59.79和48.98。富士和澳洲青苹则在第Ⅲ阶段达到稳定状态，浊度值分别为33.06和59.85。在Ⅲ阶段，嘎啦苹果汁底部再次出现肉眼可见的沉淀，与浊度先上升后下降的趋势一致。华硕的混浊稳定性未随成熟度增加得到改善，果汁始终呈现上层液体透明、下层是沉淀的分层状态。
图2 不同品种和后熟度NFC苹果汁浊度
Fig.2 Turbidity of NFC apple juice with different varieties and during late ripening 注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
2.3 NFC苹果汁粒度分析
苹果浊汁中果肉颗粒以悬浮状态分散于果汁体系，蛋白质(约40%)、酯类(30%)、原花青素(5%)、多糖(5%)、果胶(2%)等是构成果肉颗粒的主要组分[4]。苹果浊汁的悬浮稳定性遵循斯托克斯沉速公式，颗粒大小直接影响颗粒的沉降速度：苹果浊汁颗粒的粒径与沉降速率成正比，粒径越大，沉降速率越快[4]。
不同品种NFC苹果汁的粒径分布随后熟度变化规律如图3所示，苹果浊汁的粒径分布主要呈典型双峰分布[5]。不同品种之间的粒度分布不同。采摘初期(Ⅰ)，华硕和富士苹果汁的粒径分布规律相似，小颗粒粒径为8～10 μm，大颗粒粒径在300 μm左右。嘎啦和金冠中大颗粒占比较大，粒径分布主要在200 μm左右，澳洲青苹汁中小颗粒占比大，粒径分布集中于10 μm左右。粒径分布范围与YI等[12]测得的苹果汁粒径分布结果相似。随着后熟度增加，华硕、富士和嘎啦3种果汁的大粒峰面积减小，苹果汁的粒径分布只呈现1个峰，分别位于20、30和60 μm左右，表明样品中颗粒分布更加均匀。金冠苹果浊汁则在0.6和1.2 μm处出现2个新峰，说明体系中小颗粒增加。总体来说，后熟度越高，苹果浊汁的粒径分布越均匀，粒度变小，使得苹果汁浑浊稳定性提高。这可能是由于成熟过程中苹果细胞壁结构不断分解，使得果汁中的悬浮颗粒更分散、更细小造成的[13,20]。
2.4 NFC苹果汁ζ-电位分析
苹果汁是一个胶体体系，ζ-电位可以表征胶体颗粒之间相互作用，用于评估胶体系统的稳定性。当所有颗粒都具有较大的正或负ζ-电位时，它们将相互排斥，并且具有分散稳定性，反之，当颗粒的ζ-电位绝对值较低时，则没有力阻止粒颗粒聚集在一起[21]。胶体系统稳定与不稳定的分界线通常在+30或-30 mV，一般认为，ζ-电位绝对值大于30 mV时系统是稳定的[21]。
a-华硕；b-富士；c-嘎啦；d-金冠；e-澳洲青苹
图3 不同品种和后熟度苹果汁的粒度分布
Fig.3 Pareicle size distribution of NFC apple juice with different varieties and during late ripening
如图4所示，苹果汁中悬浮颗粒整体带负电，且ζ-电位的绝对值均小于30 mV，说明苹果浊汁是不稳定的胶体系统。不同品种NFC苹果汁ζ-电位差异显著，采摘初期(Ⅰ)，华硕的ζ-电位绝对值最大(-4.36)，其次是金冠(-4.06)、富士(-3.92)和嘎啦(-3.30)，澳洲青苹的ζ-电位绝对值最小(-2.62)。在后熟阶段Ⅲ，从大到小依次为：金冠(-4.84)>华硕(-4.53)>富士(-4.35)>嘎啦(-4.34)>澳洲青苹(-3.53)。随成熟度增加，NFC苹果汁对应的ζ-电位绝对值均呈现上升趋势，反映出苹果浊汁的胶体系统越来越稳定。这与赵光远等[6]的研究结果一致，随着苹果原料贮藏时间延长，果汁中带负电荷的果胶含量增加，从而增加了浊汁体系的悬浮粒子的ζ-电位，提高了苹果汁的浑浊稳定性。
图4 不同品种和后成熟度苹果汁ζ-电位
Fig.4 ζ-potential of apple juice with different varieties and during late ripening
2.5 NFC苹果汁沉淀敏感物质
影响苹果浊汁浑浊稳定性的主要因素是果汁中分子间的相互作用和颗粒的聚合，其沉淀颗粒物主要包含多酚、蛋白质和果胶[6]，不溶性淀粉也是造成苹果浊汁沉淀的主要因素之一[7]。
不同品种不溶性淀粉含量随成熟度变化如图5-a所示。后熟初期，苹果浊汁不溶性淀粉含量差异显著，其中澳洲青苹淀粉含量最高，约5.20 mg/mL，其次是富士(4.26 mg/mL)、嘎啦(4.23 mg/mL)和金冠(3.58 mg/mL)，华硕的不溶性淀粉含量最低，约为2.31 mg/mL。澳洲青苹早期淀粉含量高与SORRIVAS等[11]的研究结果一致，未成熟苹果汁的淀粉含量高达8.00 mg/mL。随成熟度增加，NFC苹果汁中的不溶性淀粉呈现下降趋势，与CARR
N等[7]研究结果相似。后熟过程中淀粉含量降低，逐渐降解成可溶性单糖(葡萄糖)，可以提高苹果浊汁甜味和浑浊稳定性[4]。图5-b展示NFC苹果汁葡萄糖含量随后熟度变化规律。采摘期，富士、嘎啦、金冠和澳洲青苹葡萄糖含量没有显著性差异，约为10 mg/mL，华硕苹果汁葡萄糖含量略高，约12.90 mg/mL。随着成熟度增加，苹果的葡萄糖含量升高，与淀粉的降解紧密相关。
酚类和蛋白质的聚合被认为是造成苹果汁沉淀的重要因素[22]。不同品种苹果汁在3个后熟阶段蛋白质含量如图5-c所示。在采摘初期，5种苹果汁的蛋白质含量均在25 μg/mL左右。随着后熟度增加，除华硕外，富士、嘎啦、金冠和澳洲青苹果汁蛋白质含量增加，至后熟阶段Ⅲ，金冠苹果汁的蛋白质含量最多，约为35.14 μg/mL，其次是澳洲青苹(31.82 μg/mL)、富士(30.68 μg/mL)和嘎啦(30.60 μg/mL)。这可能因为苹果果肉随成熟度增加，结构变得松散，在榨汁机械力的作用下，细胞内容物更易渗出[23]。
图5-d展示了不同品种苹果浊汁总酚含量随后熟度的变化。采摘初期，苹果汁的酚类物质含量高且品种间差异显著。华硕的总酚含量最高，约为291.63 mg没食子酸/100mL，其次是澳洲青苹(288.56 mg没食子酸/100mL)和嘎啦(270.94 mg没食子酸/100mL)，金冠和富士的总酚含量相对较低，分别为197.95和165.58 mg没食子酸/100mL。随后熟度增加，5种苹果汁酚类物质含量减少，至后熟阶段Ⅲ，含量低，约为1.59～6.96 mg没食子酸/100mL。这与卫世乾[24]的研究结果一致，苹果采摘后冷藏期间总酚含量呈现下降趋势。酚类物质减少，导致酚类-蛋白质聚合物减少，进而对苹果汁混浊稳定性起到促进作用。
苹果果胶是苹果浊汁云状体系的重要组成部分。苹果果胶对于维持浊汁稳定性具有积极作用，能够包裹在浊汁体系内的颗粒外，为相互作用的颗粒提供保护涂层，进而增加体系稳定性[25]。如图5-e所示，5种苹果汁在采摘初期果胶含量较低，华硕、富士、嘎啦、金冠和澳洲青苹的果胶含量分别为1.31、2.83、7.58、0.66和0.81 mg/mL。随后熟度增加，华硕、富士、金冠和澳洲青苹NFC苹果汁的果胶含量呈上升趋势，这与赵光远等[6]的研究结果一致，刚采摘的苹果中原果胶含量高，且不溶于水。而随着贮藏时间的延长，苹果逐渐成熟，苹果内的原果胶酶将苹果中的原果胶转变成水溶性果胶，有利于增加体系的稳定性。嘎啦苹果汁的果胶呈现先上升后下降的趋势，这与NG等[18]研究结果变化趋势一致。
a-不溶性淀粉；b-葡萄糖；c-总酚；d-可溶性蛋白；e-果胶
图5 不同品种和成熟度NFC苹果汁中不溶性淀粉、葡萄糖、总酚、可溶性蛋白和果胶含量
Fig.5 The concentration of insoluble starch, glucose, total phenols, soluble protein, and pectin in NFC apple juice with different varieties and during late ripening
3 结论
浑浊稳定性差是制约NFC苹果汁产业发展的重要因素，而品种和后成熟度对其浑浊稳定态有着显著的影响。对比不同品种发现，富士、嘎啦、金冠和澳洲青苹NFC苹果浊汁的浑浊稳定性随后成熟度的增加呈现上升趋势，而华硕苹果浊汁浑浊稳定性差，后成熟对其影响不显著，均出现显著的分层沉淀，较不宜选为NFC苹果浊汁的加工原料。品种和成熟度对NFC苹果浊汁浑浊稳定性的影响与其沉淀敏感物质组成和含量不同紧密相关。不同品种和后熟度原料苹果的不溶性淀粉、总酚、可溶性蛋白质和果胶含量均存在显著性差异，当不溶性淀粉、总酚、可溶性蛋白质等沉淀敏感物质含量高时，体系较不稳定，而当果胶含量增加时，可以有效改善果汁体系的浑浊稳定性。随着不断后熟，苹果中的不溶性淀粉逐渐转化为可溶性单糖，同时总酚含量降低，果胶含量增加，使得后熟的苹果浊汁浑浊稳定性更高。总体来说，选择合适的品种和后成熟度可以有效提高NFC苹果浊汁的浑浊稳定性。
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