母乳不仅是婴儿生长发育所需的最佳营养物质，而且对婴儿肠道微生物群的构成起着重要的作用[1]。奶粉喂养婴儿的肠道菌群构成不同于母乳喂养的婴儿，主要表现为高丰度的肠球菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、梭菌属等厌氧菌和较少的双歧杆菌属、拟杆菌属和乳杆菌属[2-3]；而母乳喂养婴儿的肠道菌群中双歧杆菌属占主导地位，85%的母乳喂养婴儿的优势微生物是双歧杆菌，此外还有较少的葡萄球菌属、链球菌属和乳杆菌属[4-5]。这一差异与母乳中含有的乳酸菌和丰富的人乳低聚糖[6]有关。人乳低聚糖是一种天然的益生元，对新生儿肠道菌群的形成、发展和组成起着至关重要的作用[7]。大量研究证实母乳喂养的婴儿患新生儿坏死性小肠结肠炎、过敏、腹泻、细菌感染等疾病的几率远远低于奶粉喂养的婴儿[8-9]。
在配方奶粉中适当添加益生元是目前常用的母乳模拟手段。目前，我国应用最多的是将低聚半乳糖和低聚果糖按照9:1的比例[10]混合加入新生儿配方奶粉，以提供与人乳相当的益生元效果。ABOULOIFA等[11]研究表明，低聚果糖和低聚木糖可以显著提高分离自传统发酵橄榄油的乳酸菌在低pH和0.3%胆盐环境的存活率，以及菌株的疏水性和自聚集性。张鹏宇等[12]研究发现不同低聚糖配伍后可以促进特定乳酸菌的生长。目前有关母乳源乳酸菌利用低聚糖能力的研究较少，因此系统探讨不同低聚糖对母乳源乳酸菌生长特性的影响，构建合理的益生菌-低聚糖组合具有广阔的应用前景。
母乳源乳酸菌是配方奶粉中应用前景广阔，在配方奶粉中适当添加低聚糖及母乳源益生菌能够模拟母乳的肠道菌群导向作用。本研究分别以6种低聚糖或其组合作为主要碳源，研究其对母乳源乳酸菌的体外促生长作用，以筛选对母乳源乳酸菌具有生长促进作用的低聚糖，为配方奶粉的开发提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
副干酪乳杆菌M48(Lactobacillus paracasei M48)、副干酪乳杆菌M60(L.paracasei M60)、副干酪乳杆菌M64(L.paracasei M64)、副干酪乳杆菌M71(L.paracasei M71)、鼠李糖乳杆菌M53(Lactobacillus rhamnosus M53)、植物乳杆菌M113(Lactobacillus plantarum M113)、短双歧杆菌grx05(Bifidobacterium brevis grx05)、两歧双歧杆菌S16(Bifidobacterium bifidum S16)，由江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室分离自湖南地区健康女性的母乳。
低聚果糖、低聚半乳糖(纯度>95%)，量子高科(中国)生物股份有限公司；菊粉、低聚木糖(纯度>99%)、水苏糖(纯度>90%)，浙江一诺生物科技有限公司；2′-岩藻糖基乳糖(纯度>95%)，德国BASF公司；葡萄糖、胰蛋白胨、无水乙酸钠、K2HPO4·7H2O、柠檬酸二铵、MgSO4·7H2O、MnSO4·7H2O、酵母膏、牛肉膏、吐温80，国药集团化学试剂有限公司。
MRS液体培养基(g/L)：葡萄糖 20，胰蛋白胨 10，无水乙酸钠 5，K2HPO4·7H2O 2，柠檬酸二铵 2，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·7H2O 0.05，酵母膏 5，牛肉膏 10，吐温80 1 mL/L，调节pH至6.5，121 ℃灭菌15 min后冷却备用(双歧杆菌培养基则另外添加莫匹罗星锂盐 50 mg/L及半胱氨酸盐酸盐500 mg/L)。
低聚糖MRS液体培养基：以低聚糖代替 MRS 培养基中的葡萄糖，添加量为 20 g/L。
1.2 仪器设备
BXP-16恒温培养箱，上海力辰邦仪器科技有限公司；JF-SX-500型全自动灭菌锅，日本TOMY公司；SW-CJ-1FD型超净工作台，苏州净化设备有限公司；PHS-25型酸度计，上海雷磁仪器厂；FP-110-C型全自动生长曲线分析仪，芬兰Bioscreen公司；1510型酶标仪，美国Thermo公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌株活化
将用甘油保藏的菌种接种于普通MRS液体培养基中，划线纯化，挑取单菌落并连续活化3次，用于后续实验。
1.3.2 乳酸杆菌生长曲线的测定
将菌悬液以3%的接种量分别接种于各低聚糖MRS液体培养基中，将接入菌后的液体培养基振荡均匀后，取200 μL加于培养板中，每种培养基做3个平行，用全自动生长曲线仪记录菌株的生长情况，直至48 h停止。以普通MRS液体培养基和不添加葡萄糖的MRS培养基为阳性对照和阴性对照。以培养时间为横坐标，吸光度(OD600值)为纵坐标，绘制生长曲线。
1.3.3 双歧杆菌生长曲线的测定
将菌悬液以3%的接种量分别接种于各低聚糖MRS液体培养基中，将接入菌后的液体培养基放置厌氧袋中，于37 ℃恒温培养箱厌氧培养，分别于0、4、8、12、16、20、24 h取出相应试管，使用酶标仪测定OD600值。以普通MRS液体培养基和不添加葡萄糖的MRS培养基为阳性对照和阴性对照。以培养时间为横坐标，吸光度(OD600值)为纵坐标，绘制生长曲线。
2 结果与分析
2.1 母乳源乳酸菌的低聚糖利用特性比较
母乳源乳酸菌在添加不同低聚糖MRS液体培养基的生长曲线如图1所示。4株副干酪乳杆菌M48、M60、M64、M71在以菊粉和低聚果糖为唯一碳源的MRS培养基中的OD600均高于葡萄糖组，其中副干酪乳杆菌M60在低聚半乳糖培养基中的生长速率也高于葡萄糖组(图1-a～图1-d)，最大生物量为1.149，高于阳性对照组(表1)，说明副干酪乳杆菌对菊粉及低聚果糖的利用情况普遍较好，部分菌株还可以利用低聚半乳糖，这可能是由于低聚果糖和菊粉都是由β-D-呋喃果糖连接，副干酪乳杆菌的β-果糖苷酶能利用低聚果糖和菊粉[13]。
鼠李糖乳杆菌M53在各种低聚糖培养基中生物量均显著低于MRS组(图1-e)，说明鼠李糖乳杆菌M53仅可以较好利用低聚半乳糖，对低聚果糖、菊粉等低聚糖的利用较弱(表1)，这与LANGA等[14]研究结果基本一致。植物乳杆菌M113的整个生长周期中，在低聚果糖及低聚半乳糖培养基中的OD600值均略高于阳性对照组(图1-f)，说明M113可以较好利用低聚果糖及低聚半乳糖，而陈韫慧等[15]发现植物乳杆菌AR514对菊粉的利用度最高，说明乳酸菌在利用低聚糖时存在菌株特异性。
2株双歧杆菌在低聚半乳糖和水苏糖培养基中的OD600值均高于阳性对照组(图1-g和图1-h)，说明它们能很好的利用低聚半乳糖和水苏糖。尽管低聚木糖被称为“超强双歧因子”[16]，但grx05、S16在低聚木糖中的OD600值仅为0.076和0.065，几乎没有生长，说明本研究中母乳源不同种的双歧杆菌对低聚糖的利用情况类似，且与上述文献中的菌株不同。所有菌株在2′-岩藻糖基乳糖、低聚木糖中的生长曲线和阴性对照组较接近，且OD600值均低于0.300，与其他实验组及阳性对照组存在显著性差异(P<0.05)，说明8株母乳源乳酸菌对2’-岩藻糖基乳糖和低聚木糖的利用均较弱。尽管2′-岩藻糖基乳糖能够调节婴儿肠道菌群[17]，本文分离到的母乳源乳酸菌均无法利用2′-岩藻糖基乳糖，说明人乳低聚糖中的成分并非全部能够促进母乳源乳酸菌的生长，可能存在调节免疫、黏附等功能[18]。
a-副干酪乳杆菌M48；b-副干酪乳杆菌M60；c-副干酪乳杆菌M64；d-副干酪乳杆菌M71；e-鼠李糖乳杆菌M53； f-植物乳杆菌M113；g-短双歧杆菌grx05；h-两歧双歧杆菌S16
图1 不同低聚糖作为碳源时母乳源乳酸菌的生长曲线
Fig.1 Growth curve of lactic acid bacteria from breast milk with different oligosaccharides as carbon source 注：Control-无葡萄糖；Glucose-葡萄糖；FOS-低聚果糖；GOS-低聚半乳糖；Inulin-菊粉；2′-FL-2′岩藻糖基乳糖； XOS-低聚木糖；Stachyose-水苏糖(下同)
表1 不同低聚糖作为碳源时母乳源乳酸菌的最大生物量
Table 1 Maximum biomass of lactic acid bacteria from breast milk with different oligosaccharides as carbon source
菌株最大生物量(OD600)MRS低聚果糖低聚半乳糖菊粉2′-岩藻糖基乳糖低聚木糖水苏糖副干酪乳杆菌M480.614±0.035c1.208±0.013b0.429±0.008e1.288±0.010a0.226±0.011f0.205±0.013f0.502±0.016d副干酪乳杆菌M601.032±0.023d1.384±0.026b1.149±0.080c1.449±0.010a0.307±0.004f0.249±0.012f0.574±0.016e副干酪乳杆菌M641.074±0.031b1.338±0.027a0.546±0.016c1.329±0.019a0.227±0.008e0.243±0.004e0.486±0.002d副干酪乳杆菌M711.013±0.016b1.260±0.034a0.572±0.013c1.286±0.020a0.226±0.010d0.256±0.021d0.563±0.020c鼠李糖乳杆菌M531.571±0.006a0.409±0.015e0.883±0.026b0.560±0.003c0.259±0.010f0.247±0.004f0.510±0.004d植物乳杆菌M1131.351±0.013c1.494±0.016a1.383±0.039b0.436±0.009e0.192±0.011g0.224±0.007f0.782±0.013d短双歧杆菌grx050.666±0.003b0.299±0.003c0.721±0.006a0.229±0.007d0.177±0.001e0.076±0.005f0.720±0.003a两歧双歧杆菌S160.652±0.008c0.292±0.002f0.686±0.004a0.217±0.008e0.189±0.001f0.065±0.001g0.675±0.003b
注：同一行不同上标字母表示有显著性差异(P<0.05)(下同)
由表2可知，副干酪乳杆菌M49、M60、M64、M71在低聚果糖和菊粉培养基中的最大比生长速率均显著高于MRS组(P<0.05)，说明了4株副干酪乳杆菌对低聚果糖和菊粉的利用速率较高。鼠李糖乳杆菌M53在所有实验组的最大比生长速率均低于阳性对照组，低聚半乳糖组的最大比生长速率为0.335/h，说明M53对低聚糖利用情况整体较弱，仅在低聚半乳糖中生物活力较强。植物乳杆菌M113在低聚果糖作为发酵底物时的最大比生长速率提高幅度较大，另外，在以水苏糖为碳源培养时的最大比生长速率也较高，说明M113对低聚果糖及水苏糖的利用速率较强，可能是由于M113的β-呋喃果糖苷酶、α-半乳糖苷酶活力较高[19]。2株双歧杆菌低聚半乳糖组和水苏糖组的最大比生长速率显著高于其它实验组(P<0.05)，其中，两歧双歧杆菌S16这2组的最大比生长速率高于阳性对照组，说明双歧杆菌对低聚半乳糖和水苏糖的利用较强。
表2 不同低聚糖作为碳源时母乳源乳酸菌的最大比生长速率 单位：h-1
Table 2 Maximum specific growth rate of lactic acid bacteria from breast milk with different oligosaccharides as carbon source
菌株最大比生长速率MRS低聚果糖低聚半乳糖菊粉2′-岩藻糖基乳糖低聚木糖水苏糖副干酪乳杆菌M480.140±0.013d0.268±0.001a0.180±0.012c0.218±0.008b0.052±0.001f0.028±0.001g0.106±0.002e副干酪乳杆菌M600.187±0.023c0.268±0.011b0.279±0.009ab0.297±0.010a0.083±0.001e0.041±0.001f0.140±0.017d副干酪乳杆菌M640.286±0.009c0.388±0.011a0.231±0.005d0.326±0.014b0.064±0.003f0.054±0.001f0.089±0.017e副干酪乳杆菌M710.256±0.010c0.349±0.024a0.198±0.018d0.282±0.007b0.044±0.002f0.040±0.001f0.086±0.008e鼠李糖乳杆菌M530.404±0.001a0.170±0.011c0.335±0.009b0.130±0.006d0.051±0.002f0.051±0.001f0.108±0.005e植物乳杆菌M1130.374±0.017cd0.530±0.006a0.386±0.010c0.354±0.016d0.018±0.001e0.027±0.001e0.476±0.017b短双歧杆菌grx050.247±0.001a0.082±0.001d0.220±0.001b0.031±0.001f0.051±0.001e0.025±0.001g0.218±0.001c两歧双歧杆菌S160.188±0.004ca0.073±0.001d0.198±0.004b0.032±0.001f0.037±0.001e0.017±0.001g0.206±0.002a
2.2 非母乳源乳酸菌的低聚糖利用特性比较
为比较母乳源乳酸菌和非母乳来源乳酸菌的低聚糖利用特性，本研究测试了可用于婴幼儿食品的鼠李糖乳杆菌GG、HN001[20]和长寿老人肠道来源的植物乳杆菌Q58在不同低聚糖培养基中的生长曲线。鼠李糖乳杆菌GG、HN001与鼠李糖乳杆菌M53类似(图2-a和图2-b)，都只利用低聚半乳糖，可能是由于鼠李糖乳杆菌是已知产胞外β-半乳糖苷酶的乳杆菌[21]，但HN001对低聚半乳糖的利用显著高于人源乳酸菌的LGG和M53(P<0.05)，表明不同来源的鼠李糖乳杆菌对低聚半乳糖的利用具有差异性。植物乳杆菌Q58对低聚果糖和低聚半乳糖的利用较强(图2-c)，与植物乳杆菌M113类似，但是M113在低聚糖环境下的生长速度和生长量均大于Q58；植物乳杆菌对低聚果糖和低聚半乳糖的利用是否具有广谱性，需要进一步研究。WATSON等[22]研究了68株人源及动物源乳杆菌和双歧杆菌对10种碳源的代谢能力，发现大多数乳杆菌和双歧杆菌对低聚半乳糖的利用较强，与本实验研究结果一致。
a-鼠李糖乳杆菌GG；b-鼠李糖乳杆菌HN001；c-植物乳杆菌Q58
图2 不同低聚糖作为碳源时其他来源乳酸菌的生长曲线
Fig.2 Growth curves of lactic acid bacteria from other sources with different oligosaccharides as carbon source
2.3 低聚果糖/低聚半乳糖组合对乳酸菌生长的影响
为探究不同低聚糖组合是否具有更强的乳酸菌促进作用，将低聚果糖和低聚半乳糖分别以4∶1、3∶2、2∶3和1∶4的质量比例进行配伍后，以20 g/L的添加量加入到无葡萄糖的改良MRS培养基中，并与添加等量低聚果糖、低聚半乳糖和乳糖进行比较，测定副干酪乳杆菌M71、植物乳杆菌M113、鼠李糖乳杆菌GG、鼠李糖乳杆菌HN001的生长情况。
由图3可知，除鼠李糖乳杆菌HN001可以利用乳糖以外，其余3株菌均不利用乳糖，因此，添加益生元对乳酸菌的生长促进非常必要。在混合低聚糖中，副干酪乳杆菌M71表现出对低聚果糖的选择性利用，其生物量的增长取决于低聚果糖的含量(图3-a)；植物乳杆菌M113在达到稳定期时6组低聚糖培养基发酵液OD600值无显著性差异(P>0.05)(图3-b)，说明6个组的增殖效果相同，可能是由于M113可以同时利用低聚果糖和低聚半乳糖，因此2种低聚糖的比例变化对其生长情况无明显影响。鼠李糖乳杆菌GG、HN001的生物量随低聚半乳糖的比例提升而升高(图3-c和图3-d)，在复配培养基中达到稳定期时的OD600值均低于只添加低聚半乳糖培养基。实验结果表明，低聚果糖与低聚半乳糖混合对母乳源乳酸菌的生长没有叠加的增殖效果。
a-副干酪乳杆菌M71；b-植物乳杆菌M113；c-鼠李糖乳杆菌GG；d-鼠李糖乳杆菌HN001
图3 乳酸菌在不同比例低聚果糖/低聚半乳糖组合中的生长曲线
Fig.3 Growth curve of lactic acid bacteria in different proportions of fructooligosaccharides/galactooligosaccharides combinations 注：FOS-低聚果糖；GOS-低聚半乳糖；Lactose-乳糖
3 结论
本实验测试了8株母乳源乳酸菌对低聚半乳糖、低聚果糖、2′-岩藻糖基乳糖、菊粉、低聚木糖、水苏糖及复配低聚果糖/低聚半乳糖组合的代谢情况。不同菌株表现出不同的低聚糖利用特性，母乳来源的4株副干酪乳杆菌和植物乳杆菌可以较好的利用低聚果糖；植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及双歧杆菌均能代谢低聚半乳糖；双歧杆菌可较好的代谢水苏糖副干酪乳杆菌可利用菊粉且增殖作用明显；而2′-岩藻糖基乳糖和低聚木糖对母乳源乳酸菌无明显的生长促进作用。在复配组合中菌株的生长情况由乳酸菌可利用的低聚糖含量决定，低聚果糖与低聚半乳糖混合对母乳源乳酸菌的生长没有叠加的增殖效果。本研究有助于更加科学地认识低聚糖和母乳来源益生菌之间的关系，为选择和开发低聚糖、益生菌以及合生元产品提供一些参考。
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