肌原纤维蛋白属于盐溶性蛋白，在低盐(<0.3 mol/L NaCl/KCl)及水溶液条件下蛋白溶解度差[1]，易聚集成纤维丝，将功能基团掩埋于内部，因此表现出较差的理化和功能特性[2]，限制了其加工利用程度，特别是在流体类、蛋白饮品类研究中少见[3-4]，市场上也未见商品化的成品。目前改善低盐条件下肌原纤维蛋白的溶解度主要有糖基化法[5-6]、氨基酸增溶法[7-9]、超声波法[10-11]、高压均质法等[12-13]。动态高压微射流(dynamic high pressure microfluidization，DHPM)是近几年发展起来的一种新技术，在改性大分子方面具有显著的效果[14-15]。其原理是在高压的作用下，液体物料获得一个很高的动能，经过分流后，细流以更高的速度在反应腔发生对击，其中的大分子同时受到高速撞击、强烈剪切、高频震荡、瞬时压降等作用，结构和理化性质得到改善[16]。相关研究表明，DHPM能破碎蛋白结构，使粒径减少，结构改变，溶解度增加，进而提升蛋白的功能特性[17-19]。目前关于DHPM改性蛋白主要集中在植物蛋白、乳蛋白等[20-21]，对肌原纤维蛋白的研究还未见报道。本实验主要探讨了DHPM压力和次数对低盐肌原纤维蛋白溶解度及其结构的影响，旨在扩大肌原纤维蛋白的应用范围和丰富其产品种类。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜鸡胸肉，湖南省湘佳牧业股份有限公司；NaCl、NaOH、甲醇、冰醋酸，重庆市钛新化工有限公司；Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、MgCl2·6H2O、四水酒石酸钾钠，上海源叶生物科技有限公司；CuSO4·5H2O，Aladdin；甘氨酸，Macklin；乙二胺四乙酸，Biosharp公司；叠氮化钠，成都市科龙化工试剂厂，以上皆为分析纯。尼罗蓝，Adamas公司；荧光白，上海阿拉丁试剂公司；非预染蛋白Marker 26614(10～200 kDa)，Thermo公司；Tris，biotopped公司；溴酚蓝，coolaber公司；牛血清蛋白，Biofroxx公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；Tris、考马斯亮蓝R250，上海拓旸生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
5810型台式高速离心机，德国Eppendorf公司；SYNERGYH1MG型全波长酶标仪，美国基因公司；TGL-16型医用冷冻离心机，四川蜀科仪器有限公司；MCR302模块化旋转与界面流变仪，安东帕(上海)商贸有限公司；ZEN 3690马尔文粒度分析仪，英国马尔文公司；M-110EH-30超微量流动态高压纳米分散仪，加拿大Microfluidics公司；UV—5100紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；DXR2激光共聚焦显微拉曼光谱仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；Mini-PROTEAN型电泳槽、伯乐电泳仪，美国Bio-Rad公司；LSCM800激光共聚焦显微镜 laser scanning confocal microscope，德国卡尔蔡司公司。
1.3 实验方法
1.3.1 肌原纤维蛋白的提取
参考文献[22-24]的方法，略作修改：将新鲜鸡胸肉清洗干净，去除膜，并搅碎成肉糜，加入4倍体积的缓冲液A(0.1 mol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2·6H2O，1 mmol/L EDTA，20 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.0)进行提取，冰水浴匀浆60 s(10 000 r/min)，再离心15 min(4 ℃，8 500 r/min)，重复离心操作3次，收集沉淀物，即肌原纤维蛋白粗提物。之后将沉淀物分散在4倍体积的冰浴混合液B(0.15 mol/L NaCl，1 mmol/L NaN3，20 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.0)中，冰水浴匀浆60 s(6 000 r/min)，离心15 min(4 ℃，8 000 r/min)，重复操作2次，收集沉淀物，之后加入8倍体积的缓冲液B(pH 6.25)，匀浆后用3层无菌纱布过滤，之后再进行离心(4 ℃，8 000 r/min，15 min)，所得沉淀即为纯的肌原纤维蛋白，置于4 ℃冰箱保存，48 h内用完。
1.3.2 DHPM处理
将蛋白分散于磷酸盐缓冲体系液中(0.15 mol/L NaCl，20 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4, 0.02%NaN3，pH 7.0)中，冰浴条件下2 800 r/min 均质处理30 s，以牛血清蛋白为标准参照，采用双缩脲法测定蛋白含量，并将蛋白质量浓度调至5 mg/mL。将蛋白分散液在8 000 r/min下匀浆1 min，重复2次；匀浆后的蛋白分别在0、34、69、103、138和172 MPa压力下DHPM处理9次，以及在138 MPa压力下DHPM处理0、3、6、9、12次，以上处理均在4 ℃条件下进行。
1.3.3 溶解度的测定
参考梅甜恬等[25]的方法测定。将蛋白质量浓度调节至2.0 mg/mL。4 ℃下静置1 h，离心15 min(12 000×g，4 ℃)。取上清液，用双缩脲法测定蛋白溶液的浓度，空白用磷酸盐缓冲液替代。肌原纤维蛋白溶解度计算如公式(1)所示：
溶解度
(1)
1.3.4 表面疏水性的测定
表面疏水性参CHIN等[26]的方法测定，稍作修改。测定蛋白质量浓度并将其调节至1 mg/mL。取1 mL样液加入200 μL 1 mg/mL溴酚蓝于离心管中，经漩涡(10 min)，离心(8 000×g，10 min)后取上清液0.4 mL，加3.6 mL磷酸盐缓冲液，振荡均匀后在波长595 nm处测定吸光值，空白用未添加肌原纤维蛋白的磷酸盐缓冲液替代。蛋白表面疏水性计算如公式(2)所示：
表面疏水性
(2)
1.3.5 Zeta-粒径的测定
将样品蛋白质量浓度调至0.25 mg/mL，取1 mL稀释样品于马尔文比色皿中，在(25±0.1)℃下以90°的检测角进行动态光散射(dynamic light scattering，DLS)测量微粒的粒径分布。
1.3.6 激光共聚焦显微镜
将蛋白样品质量浓度调至2 mg/mL，取1 mL稀释样品于5 mL离心管中，加入20 μL 0.2%尼罗蓝染液(结合蛋白)和20 μL 0.2%荧光白染液(结合多糖)，涡旋振荡混匀，于黑暗处室温充分反应30 min；于载玻片上滴入30 μL染液，盖上载玻片，用吸水纸吸去周围多余的液体。分别在激发波长633和488 nm处观察蛋白和多糖的大小、分布。
1.3.7 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳的测定
参考WANG等[27]的方法，稍作修改。在电泳之前，将蛋白质样品(2 mg/mL)以体积比1∶3溶解于SDS-PAGE样品缓冲液(内含10%SDS，50%甘油，0.5%的溴酚蓝，0.25 mol/L Tris-HCl缓冲液，pH 6.8)中。将混合物在沸水中加热6 min。电泳在15 mA下用10%分离凝胶和5%丙烯酰胺堆积凝胶30 min，然后在25 mA下运行90～120 min，之后在染色液(0.1%考马斯亮蓝R-250，45%甲醇，10%冰醋酸)中染色2.5 h，最后在脱色液(10%甲醇，10%冰醋酸)中脱色至条带清晰为止。
1.3.8 拉曼光谱的测定
将DHPM处理后的样品冻干，用拉曼光谱测定蛋白的二级结构。激光波长785 nm，功率120 mW，曝光时间60 s，扫描3次，扫描范围400～3 500 cm-1，测试完成后以苯丙氨酸(1 004 cm-1)为标准进行归一化。用Perkin Elmer Spectrum对拉曼光谱的吸光度进行处理数据调整、平滑处理。使用Peakfit 4.12进行蛋白质酞胺Ⅰ带(1 600～1 700 cm-1)的分析，依次进行基线校正、Gaussian去卷积、二阶导数拟合，根据各子峰面积计算各个二级结构组成α-螺旋(1 645～1 658 cm-1)；β-折叠(1 665～1 680 cm-1)；β-转角(1 640～1 644 cm-1)；无规则卷曲(1 660～1 665 cm-1)占总二级结构的比例。
1.3.9 数据处理
采用Microsoft Excel 2011进行数据计算，SPSS 19.0进行方差分析和显著性检验(P<0.05)，采用Originpro 8.1进行图像处理。试验数据采用平均值±标准差形式。
2 结果与分析
2.1 DHPM处理对低盐肌原纤维蛋白溶解度的影响
溶解度是蛋白非常重要的理化特性之一，直接影响着蛋白的稳定、乳化、凝胶等功能性质。较高的蛋白溶解度能表现出更好的产品理化特性，满足人们期望的食品品质要求。如图1所示，肌原纤维蛋白经过DHPM处理后溶解度显著增加(P<0.05)，当处理压力在103 MPa以内时，蛋白溶解度增加迅速(P<0.05)，但当DHPM处理压力在103～172 MPa时，蛋白的溶解度(43.94%～45.65%)增加不再显著(P>0.05)。随着DHPM处理次数的增加(138 MPa)，蛋白溶解度呈显著增加趋势(P<0.05)。说明DHPM处理能改善低盐条件下肌原纤维蛋白的溶解度，这与文献[17，28-29]的研究一致。
a-DHPM处理压力；b-DHPM处理次数
图1 DHPM处理对肌原纤维蛋白溶解度的影响
Fig.1 Effect of DHPM treatment on solubility of myofibrillar protein 注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同小写字母 表示差异不显著(P>0.05)(下同)
2.2 DHPM处理对低盐肌原纤维蛋白Zeta-粒径的影响
如图2所示，除34 MPa外，肌原纤维蛋白的Zeta-粒径随着DHPM处理压力和次数的增加而逐渐减少(P<0.05)。DHPM处理过程中，激流撞击，使得大聚集体破碎，同时在剪切作用力下，蛋白变成小片段，因此粒径减少，促进蛋白溶解[2,30]。CHEN等[2]通过原子力显微镜观察到高压均质能使肌原纤维蛋白解聚，产生一些亚微米/纳米范围粒径的长丝，低聚物和肌球蛋白单体。而在34 MPa(9次)下，蛋白的粒径显著增加(P>0.05)，可能的原因是在较低的压力下蛋白结构松散，展开的蛋白间暴露出基团，相互作用形成大聚合物。FAN等[19]用原子力显微镜观察到食用燕窝蛋白颗粒高度在40 MPa下略有增加，可能是压力下水进入到分子内部。
a-DHPM处理压力；b-DHPM处理次数
图2 DHPM处理对肌原纤维蛋白Zeta-粒径的影响
Fig.2 The effect of DHPM treatment on the Zeta-particle size of myofibrillar protein
2.3 DHPM处理对低盐肌原纤维蛋白微观结构的影响
激光共聚焦显微镜能直观地观测到蛋白在体系中的形态和分布。肌原纤维蛋白与尼罗蓝荧光标记物结合，在激发波长633 nm处呈红色。从图3-a可知，未经DHPM处理的蛋白在低盐下聚集成大颗粒，颗粒间尺寸相差大，在体系中分布也不均匀。如图3-b所示，在69 MPa DHPM处理下，蛋白大聚集体逐渐消失，变成更小的颗粒。如图3-c所示，当DHPM处理压力达到138 MPa后，蛋白微粒更加细小、尺寸一致，分布趋于均匀。蛋白微粒变小时，蛋白的比表面积增大，增加了与水的相互作用[31]。
a-未经DHPM处理;b-69 MPa下DHPM处理9次; c-138 MPa下DHPM处理9次
图3 DHPM处理下低盐肌原纤维蛋白的共聚焦显微图
Fig.3 CLSM image of low-salt myofibrillar protein under DHPM treatment
2.4 DHPM处理对低盐肌原纤维蛋白分子质量的影响
SDS-PAGE可以对蛋白进行分子质量的鉴定，以了解DHPM对蛋白聚集体破碎作用以及蛋白分子质量大小的影响(图4)。
a-DHPM处理压力;b-DHPM处理次数
图4 DHPM处理压力和次数对低盐肌原纤维蛋白 凝胶电泳条带的影响
Fig.4 Effect of DHPM treatment pressure and times on the bands of low-salt myofibrillar protein gel electrophoresis 注：图4-a中的a表示未经DHPM处理，b、c、d、e、f分别表示 DHPM处理压力为0、34、69、103、138和172 MPa
从图4可以看出，未经DHPM处理的蛋白在分子质量120～150 kDa、75～85 kDa以及接近100 kDa附近有较为明显的条带。随着DHPM处理压力和处理次数的增大，分子质量为200 kDa以及120～150 kDa附近的蛋白条带在逐渐消失，而分子质量在60～120 kDa的蛋白条带数量在逐渐增加，说明蛋白由大分子质量向小分子质量转变。这是因为蛋白在强烈的剪切力作用下，蛋白链断裂，形成更多小分子质量的蛋白[18,29]。DHPM处理压力在138 MPa和172 MPa条件下以及DHPM处理次数在9次和12次条件下，蛋白间的条带无差别。
2.5 DHPM处理对低盐肌原纤维蛋白表面疏水性的影响
从图5可知，经DHPM处理过的肌原纤维蛋白表面疏水性显著提高(P<0.05)，这是因为DHPM处理能使蛋白的结构展开，暴露出疏水性基团。随着DHPM处理压力的增加，蛋白表面疏水性呈现降低的趋势(P<0.05)，DHPM处理能引起蛋白结构变化，导致分子重排[32]。随着DHPM处理次数的增加，蛋白表面疏水性呈现先增加后降低的趋势(P<0.05)，这与沙小梅等[33]的研究相似。DHPM处理引起蛋白聚集体展开，暴露出更多的疏水性基团，而随着DHPM处理次数进一步增加，解离出的蛋白通过分子表面疏水相互作用等发生相互作用，促进蛋白进一步折叠，导致表面疏水性基团含量降低[34-35]。
a-DHPM处理压力；b-DHPM处理次数
图5 DHPM处理对低盐肌原纤维蛋白 表面疏水性的影响
Fig.5 Effect of DHPM treatment on surface hydrophobicity of low-salt myofibril protein
2.6 DHPM处理对低盐肌原纤维蛋白二级结构的影响
拉曼光谱可反映二硫键、芳香族和脂肪族残基、氢键和二级结构类型的相对比例的微环境和相互作用的变化。酰胺Ⅰ带(1 600～1 700 cm-1)是蛋白二级结构的特殊表征，并蛋白骨架构象类型相关。从图6可知，低盐体系下，肌原纤维蛋白的主要结构是α-螺旋和β-折叠，能占到二级结构的68.22%～79.23%。经过DHPM处理后，肌原纤维蛋白α-螺旋结构的占比有明显下降，而无规则卷曲占比有所增加，说明肌原纤维蛋白由有序向无序态转变，DHPM使蛋白去折叠，结构展开，这与文献[30,36]的研究结果一致。
a-DHPM处理压力；b-DHPM处理次数
图6 DHPM处理对低盐肌原纤维蛋白二级结构的影响
Fig.6 Effect of DHPM treatment on secondary structure of low-salt myofibril protein
3 结论
随着DHPM处理压力和次数的增加，肌原纤维蛋白的溶解度显著增加(P<0.05)，但当压力达到103 MPa后溶解度的增加不再显著(P>0.05)；Zeta-粒径显著降低(P<0.05)，在172 MPa，9次处理下可降至411.17 nm。激光共聚焦显微镜显示DHPM处理后的蛋白大颗粒消失，尺寸变小、均匀；SDS-PAGE显示DHPM处理下分子质量在200 kDa以及120～150 kDa附近的蛋白条带在逐渐消失，而分子质量在60～120 kDa的蛋白条带数量在逐渐增加。经过DHPM处理的蛋白表面疏水性显著增加(P<0.05)，随着压力的增加而降低(P<0.05)，随着次数的增加先增加后降低(P<0.05)，这是蛋白结构展开又折叠的结果。经过DHPM处理，蛋白α-螺旋结构的占比下降，无规则卷曲占比有所增加。
DHPM能显著改善肌原纤维蛋白的溶解度，打破聚集的蛋白、降低蛋白粒径，解聚、尺寸变小的蛋白比表面积增大，增加了蛋白与水的相互作用，促进蛋白的溶解。在DHPM处理下蛋白的高级结构和二级结构发生改变，功能基团暴露，增强了与水相互作用，使低盐下肌原纤维蛋白的理化特性和功能特性得到改善，以满足加工要求。
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