浓香型白酒是中国白酒典型代表之一，市场份额占全国白酒总量的70%以上[1]。根据GB/T 10781.1—2006 《浓香型白酒》，浓香型白酒以粮谷为原料，经传统固态发酵、蒸馏、陈酿、勾兑而成，未添加食用酒精及非白酒发酵产生的呈香物质，以已酸乙酯为主体复合香。微生物在白酒酿造过程中发挥重要作用，处于核心地位，能够产生多种生物酶和香味成分及其前体物质，参与淀粉糖化、酒精发酵、产酯生香等生化过程，对白酒独特风味的形成具有重要作用[2]。
抗逆性是酿造微生物适应白酒发酵过程、发挥功能特性的基础。芽胞杆菌是白酒发酵过程中大曲、窖泥和酒醅中的优势类群，在大曲发酵的中后期开始大量繁殖，并成为优势种群。与其他微生物相比，芽胞杆菌除具有产生生物酶、氨基酸、风味物质等代谢物功能特性外，通常具有耐酸、耐盐、耐高温、耐胆盐等显著特征[3-4]，以适应复杂多变的发酵生产环境。黄水是固态发酵生产浓香型大曲酒的副产物，为棕黄色黏稠液体，含有多种酸类、醇类等呈香味物质以及经过长期驯化的有益微生物[5]。实验室前期从四川省宜宾地区传统发酵浓香型白酒的黄水样品中分离到1株黄水芽胞杆菌(Bacillus aquiflavi)3H-10[6]，具有较好的产蛋白酶活力，可产生苯甲醛、正丁醇、已酸乙酯等多种代谢风味物质，且通过全基因组测序分析显示，菌株在抗生素耐药性、产毒与致病性方面风险较低。本研究对黄水芽胞杆菌3H-10进一步开展乙醇、酸、碱、NaCl和温度等耐受性潜力挖掘，并结合菌种全基因组序列分析解析菌种潜在耐受机制，为该菌株应用于浓香型白酒发酵的实际生产奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验菌种及培养基
本研究所用黄水芽胞杆菌3H-10分离自四川省宜宾地区传统发酵浓香型白酒的黄水样品，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 24755。菌种所使用的培养基为大豆酪蛋白(tryptic soy broth，TSB)培养基和大豆酪蛋白琼脂(tryptose soya agar，TSA)固体培养基，北京陆桥技术有限公司。
1.1.2 试剂与设备
无水乙醇，天津市致远化学试剂有限公司；NaCl，西陇化工股份有限公司。
BHG-8082型恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；Eppendorf微量可调移液器、5424R型台式冷冻离心机，德国Eppendorf公司；HG-50型高压灭菌锅，日本HIRAYAMA公司；AC2-4S1型生物安全柜，新加坡Esco公司；FE20型pH计，梅特勒-托利多食品(上海)有限公司；2000型分光光度计，尤尼科(上海)仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 种子液制备
挑取新鲜培养的单菌落接种到4 mL TSB培养基中，37 ℃，200 r/min培养3 d后作为接种种子液。
1.2.2 乙醇耐受性测定
将种子液按1%接种量分别接种于乙醇体积分数为0、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%的TSB培养基中，37 ℃ 200 r/min培养3 d，观察菌株生长情况，并记录结果。每个乙醇含量条件设置3个重复。以不接种的TSB液体培养基作为空白对照。
1.2.3 酸、碱耐受性测定
将种子液按1%接种量分别接种于pH 2、4、6、8、10、12的TSB培养基中，37 ℃ 200 r/min培养3 d，观察菌株生长情况，并记录结果。每个pH条件设置3个重复。以不接种的TSB培养基作为空白对照。
1.2.4 NaCl耐受性测定
将种子液按1%接种量分别接种于NaCl质量浓度为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160 g/L的TSB液体培养基中，37 ℃ 200 r/min培养3 d，观察菌株生长情况，并记录结果。每个NaCl质量浓度条件设置3个重复。以不接种的TSB培养基作为空白对照。
1.2.5 温度耐受性测定
取20 μL种子液接种至TSA固体培养基，分别置于4、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃培养3 d，观察菌株生长情况，并记录结果。每个温度条件设置3个重复。
1.2.6 基因功能注释
从NCBI数据库下载黄水芽胞杆菌3H-10基因组序列(登录号CP082780)，使用RAST(Rapid Annotation using Subsystem Technology, https://rast.nmpdr.org/)annotation server在线分析工具进行基因功能注释。其中，RAST注释方案选择“RASTtk”，并勾选“Automatically fix errors”选项，其余参数均使用默认设置。
1.2.7 菌种乙醇代谢途径KEGG分析
将下载的黄水芽胞杆菌3H-10基因组序列在KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, https://www.genome.jp/kegg/kegg2.html)在线网站[7]进行代谢途径分析，查找菌株乙醇代谢途径及相关基因。
1.2.8 潜在乙醇耐受基因的靶向检测
通过文献检测已报道的与乙醇耐受相关基因，并从NCBI nucleotide数据库下载相应基因序列，使用本地比对工具blastv2.2.21在基因组序列中进行序列比对，定向检测黄水芽胞杆菌3H-10基因组是否存在已报道的与乙醇耐受相关的基因。
2 结果与分析
2.1 黄水芽胞杆菌3H-10对乙醇的耐受性
试验结果显示，黄水芽胞杆菌3H-10对乙醇的耐受范围为0～4%，最适生长乙醇体积分数为0，说明该菌株对乙醇有一定的耐受性。乙醇为半极性溶剂，其性能介于极性与非极性溶剂之间，对细胞的毒性主要表现为增加质膜的流性，破坏膜蛋白的功能[8]。乙醇耐受性能够维持菌体在乙醇胁迫下保持正常生长。黄水芽胞杆菌3H-10分离自浓香型白酒发酵过程的黄水样品，后者富含醇类、酸类等呈香味物质[5]，推测该菌株的乙醇耐受性是其与环境相适应的结果，有助于菌种在发酵过程中维持存活、生长繁殖并发挥功能特性。
2.2 黄水芽胞杆菌3H-10对酸、碱的耐受性
试验结果显示，黄水芽胞杆菌3H-10对酸碱的耐受范围为pH 6.0～10.0，最适pH 8.0。在pH 1.0～5.0环境中生长、但pH>5.5时不能生长的微生物称为嗜酸微生物；将最适生长pH>9.0的微生物称为嗜碱微生物；将能在高pH条件下生长，但最适值并不在碱性pH范围内的微生物称为耐碱菌[9]。黄水芽胞杆菌3H-10对碱性环境具有轻微耐受性。
2.3 黄水芽胞杆菌3H-10对NaCl的耐受性
试验结果显示，黄水芽胞杆菌3H-10对NaCl的耐受范围为0～20 g/L，最适生长NaCl质量浓度为0 g/L。根据Kushner的分类原则，一般将最适生长NaCl浓度为0.5～2.5 mol/L、2.5～5.2 mol/L的微生物分别称为中度嗜盐菌和极端嗜盐菌[10]。黄水芽胞杆菌3H-10对NaCl无显著耐受性。
2.4 黄水芽胞杆菌3H-10对温度的耐受性
试验结果显示，黄水芽胞杆菌3H-10对温度的耐受范围为20～45 ℃，最适生长温度为37 ℃。通常最大生长温度>50 ℃的微生物为嗜热菌，将在温度<10 ℃时才能生长的微生物为嗜冷菌[9]。黄水芽胞杆菌3H-10对温度无显著耐受性。
2.5 黄水芽胞杆菌3H-10基因注释分析
使用RAST annotation server对菌株黄水芽胞杆菌3H-10基因组进行注释。结果显示，该菌株基因组大小为3 806 094 bp，G+C含量为35.70 mol%，预测到4 097个蛋白质编码基因。蛋白质编码基因经注释可归为27个类别(图1)，其中与氨基酸及其衍生物，蛋白质代谢，碳水化合物代谢，辅助因子、维生素、辅基和色素相关的基因较多，分别为331、215、172和166个，推测黄水芽胞杆菌3H-10对氨基酸、蛋白质、碳水化合物等基础物质的代谢能力较旺盛。其中，注释到26个与应激反应相关的基因，分别与氧化应激、渗透调节、解毒和周质压力等相关。
图1 利用RAST工具对黄水芽胞杆菌3H-10基因注释的结果
Fig.1 Gene annotation result of B.aquiflavi 3H-10 with RAST
进一步分析发现，黄水芽胞杆菌3H-10基因组中含有15个热休克蛋白(heat shock protein，HSP)基因，可编码产生HSP90、HSP20、HSP33、GroES、GroEL、ClpB、Hfq、CopZ、DnaJ和DnaK等HSP(表1)。
表1 菌株黄水芽胞杆菌3H-10基因组中的热休克蛋白基因
Table 1 Genes encoding for heat shock proteins in the genome of B.aquiflavi 3H-10
序号基因编号相似性E值比对上的序列基因功能描述13H-10GL00067549.83.30E-81ERI91768.1ATP酶/组氨酸激酶/DNA旋转酶B亚基/HSP90结构域蛋白23H-10GL00154051.21.20E-24WP_027319557.1Hsp20/α晶体蛋白家族蛋白33H-10GL00199463.82.80E-52WP_004434917.1Hsp20/α晶体蛋白家族蛋白43H-10GL00199545.46.00E-34WP_015594430.1Hsp20/α晶体蛋白家族蛋白53H-10GL00214758.12.70E-44WP_004437269.1Hsp20/α晶体蛋白家族蛋白63H-10GL00375178.17.20E-131WP_026583016.1Hsp33家族分子伴侣73H-10GL00387862.44.00E-29WP_066416999.1Hsp20/α晶体蛋白家族蛋白83H-10GL00006992.52.10E-39WP_044895477.1伴侣蛋白93H-10GL00007091.22.10E-277WP_123913350.1伴侣蛋白103H-10GL00086477.70.00E+00WP_026582741.1ATP依赖的伴侣蛋白ClpB113H-10GL00138893.32.00E-32WP_075980844.1RNA伴侣Hfq123H-10GL00202166.21.20E-17WP_125905679.1铜伴侣CopZ133H-10GL00249584.54.10E-192WP_066049832.1分子伴侣DnaJ143H-10GL00249690.10.00E+00WP_066049835.1分子伴侣DnaK153H-10GL00298569.91.60E-97WP_066442880.1分子伴侣DnaK
HSP是生物受到环境中物理、化学和生物等刺激时发生应激反应而合成的一类高度保守的糖蛋白，普遍存在于原核和真核生物中。生物体或组织受到应激刺激后，需要度过一个绝对恢复期，细胞在此期间合成HSP，其后才能耐受应激刺激，当超出一定期限时，HSP便会失去保护作用[11]。匡素芳等[12]发现，当丙酮丁醇梭菌过量表达相应编码应激反应蛋白基因groESL、grpE和htpG时，重组菌的丁醇耐受性大大提高。MIAO等[13]研究发现，东方伊萨酵母的分子伴侣HSP 90、HSP70等相关基因在乙醇环境胁迫下转录水平显著上调。李伟丽等[14]通过将超嗜热菌强烈火球菌的小分子HSP基因sHsp导入枯草芽胞杆菌中表达，使菌株对乙醇的耐受性显著增强。黄水芽胞杆菌3H-10基因组中检测到数量和种类较多的HSP编码基因，这有利于菌株在乙醇等不良环境中维持细胞存活、生长繁殖并发挥功能。
2.6 黄水芽胞杆菌3H-10乙醇代谢途径分析
KEGG分析显示，菌株黄水芽胞杆菌3H-10基因组中含有1个乙醇脱氢酶基因adh和3个乙醛脱氢酶基因aldh，分别编码乙醇脱氢酶[(alcohol dehydrogenase，ADH), EC1.1.1.1]和乙醛脱氢酶[(aldehyde dehydrogenase，ALDH), EC.1.2.1.3]，组成较完整的乙醇脱氢酶系(图2)。ADH和ALDH参与催化乙醇的分解代谢，乙醇通过ADH氧化成为乙醛，乙醛通过ALDH氧化成为乙酸，乙酸进入柠檬酸循环，最终氧化成CO2和水。其中，ADH是乙醇代谢的重要限速酶之一，一般为以氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)、氧化型辅酶II(NADP+)或吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)为辅酶的锌金属酶，具有广泛的特异性，是许多有机体中短链醇代谢的关键酶，可逆催化氧化短链醇、芳香醇等为相应的羧基化合物。ALDH是生物体内用于降解乙醛的重要酶类，以NADP+为辅酶的含锌类酶，催化包括乙醇在内的某些物质以及二级醇、醛和酮的脱氧反应。ADH和ALDH广泛存在于微生物、植物和动物体中，其代谢活性直接影响生物体内乙醇的代谢，从而对生物体的生理状态产生直接影响。鞠建松等[15]将假坚强芽胞杆菌中adh和aldh进行克隆并异源表达，能够较大程度提高宿主对乙醇的耐受性。此外，黄水芽胞杆菌3H-10基因组中还含有1个乙醛脱氢酶(EC1.2.1.10)，可催化乙醛生成乙酰辅酶A，后者进入柠檬酸循环，协助促使乙醇代谢，最终氧化成CO2和水。
图2 黄水芽胞杆菌3H-10中的乙醇代谢途径
Fig.2 The alcohol metabolism pathway in B.aquiflavi 3H-10
2.7 黄水芽胞杆菌3H-10乙醇耐受相关基因的定向检索
目前关于芽胞杆菌乙醇耐受性的研究仍相对较少，微生物类群以枯草芽胞杆菌[14-15]为主。具有乙醇耐受特性的微生物当前主要集中在酿酒酵母[16-19]、大肠埃希氏菌[20-21]和恶臭假单胞菌[22]等，其耐受乙醇的机制主要包括：(1)提高糖类和氨基酸等转运能力；(2)利用排出泵将有机溶剂排出细胞；(3)合成和积累海藻糖与脯氨酸等，减少膜的渗透性改变；(4)合成氨基酸等。将相关基因在黄水芽胞杆菌3H-10基因组中进行序列比对，结果显示该菌株不含有这些基因(表2)。说明上述机制不是黄水芽胞杆菌3H-10耐受乙醇的主要原因。
表2 已报道的乙醇耐受相关基因在黄水芽胞杆菌3H-10基因组中的检测结果
Table 2 The detection result of reported genes related with alcohol tolerance in the genome of B.aquiflavi 3H-10
序号基因基因功能乙醇耐受机制微生物类别参考文献黄水芽胞杆菌3H-10基因组中检测结果1tps1, tps2, tsl1编码海藻糖-6磷酸合成酶、海藻糖磷酸酶和海藻糖-6磷酸合成酶当微生物细胞受到有机溶剂胁迫时,细胞可合成并积累海藻糖,减少膜的渗透性改变、防止蛋白质变性,增强细胞的溶剂耐受性酿酒酵母[17]未检测到2pro1, pro2编码γ谷氨酰蛋白激酶和γ谷酰基磷酸还原酶当微生物细胞受到有机溶剂胁迫时,细胞可合成并积累脯氨酸,减少膜的渗透性改变、防止蛋白质变性,增强细胞的溶剂耐受性酿酒酵母[18]未检测到3trp2, trp5, tat2编码色氨酸合成酶、色氨酸合成酶和色氨酸透性酶合成色氨酸,显著提高细胞的生长速率酿酒酵母[19]未检测到4manX,manY,manZ编码磷酸转运系统的糖类转运子该转运子可将糖类转运到细胞内,同时可以高效地把溶剂转运到菌体细胞外,以此减弱溶剂对菌体细胞生长的影响大肠埃希氏菌[20]未检测到5acrAB-tolC, acrEF-tolC编码溶剂排出泵将溶剂排出细胞,减小对微生物细胞膜的毒害作用大肠埃希氏菌[21]未检测到6soxS, marA, robA编码Ara子家族的DNA结合蛋白编码产物具有螺旋-转角-螺旋的特征,作为转录激活子大量表达时可强化溶剂排出泵 AcrAB-Tol的功能大肠埃希氏菌[21]未检测到7ttgABC,ttgDEF,ttgGHI, tonB分别编码溶剂排出泵Tt-gABC、TtgDEF、TtgGHI和TonB将溶剂排出细胞,减小对微生物细胞膜的毒害作用恶臭假单胞菌[22]未检测到
芽胞杆菌作为白酒发酵过程中的重要微生物类群往往对乙醇等极端环境具有一定耐受性，对其机制的研究能够为菌株应用于实际生产奠定基础，值得深入探讨。本研究首次对我国四川省宜宾地区首株酿酒微生物新种菌株黄水芽胞杆菌3H-10乙醇耐受机制进行解析，为后续相关研究提供了参考。
3 结论
黄水芽胞杆菌3H-10是从浓香型白酒发酵样品黄水中分离的1株芽胞杆菌，具有显著的产蛋白酶和产风味物质能力，在抗生素耐药性、产毒与致病性方面安全性风险较低，在白酒发酵过程中具有较好的潜在应用价值。本文从乙醇、酸、碱、NaCl和温度等方面对黄水芽胞杆菌3H-10的抗逆性潜力进行挖掘，并探究其抗逆性潜在机制。结果显示，菌株可在4%乙醇环境生长，对乙醇具有一定耐受性。基因分析发现，菌株含有数量较多的HSP编码基因，可通过应激反应减弱乙醇对细胞的毒害作用；菌株基因组中含有完整的乙醇代谢途径相关基因，可将乙醇依次氧化生成乙醛、乙酸，后者进入柠檬酸循环，最终生成CO2和水。因此，丰富的HSP和完整的乙醇代谢途径是黄水芽胞杆菌3H-10耐受乙醇的主要原因。研究为黄水芽胞杆菌3H-10应用于浓香型白酒发酵的实际生产奠定了理论基础。
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