牛肉是公认的高生物价值蛋白质和微量营养素来源，是世界第三大消费肉品[1]。受西式饮食方式影响及新生代需求增加等原因，我国饮食结构发生改变，方便快捷食品得到了快速发展，牛肉汉堡以其方便、高营养价值和良好的感官品质等特点受到了当今年轻人及上班族的青睐。
食品风味分析一般先提取挥发性成分，再采用GC-MS和气相色谱-嗅闻(GC-olfactometry，GC-O)进行分析。常用的提取方法包括固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)、吹扫捕集(purge and trap，PT)、溶剂辅助蒸发(solvent-assisted flavor evaporation，SAFE)等。有报道[2-3]，采用SPME结合GC-O分析烤箱中烤制的牛肉，检测频率较高的化合物为3-甲硫基丙醛、2-甲基噻吩、2-甲基-3-呋喃硫醇、二甲基三硫醚、1-壬烯-3-酮、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、1-辛烯-3-酮等；采用PT结合GC-O分别分析内温为70、57 ℃的烤牛肉，检测出的对牛肉风味有重要作用的化合物有1-辛烯-3-酮、(E)-2-辛烯醛、3-甲硫基丙醛、己醛、3-甲基丁醛、壬醛、二甲基三硫醚、2,3-丁二酮、戊醛等[4-5]；采用乙醚作为溶剂，SAFE结合芳香提取物稀释分析法(aroma extract dilution analysis，AEDA)GC-O分析，在2种不同加工方式的烤牛肉中检测出稀释因子(flavor dilution，FD)高的为2-乙酰基-2-噻唑啉、2,5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮等[6]。
SAFE是一种首先用溶剂萃取样品，再在高真空及液氮冷凝条件下，将萃取物中的风味组分蒸发分离出的方法，其具有萃取分离条件温和、回收率高的优点，已在许多食品的风味分析上得到成功应用[7-9]。本实验采用SAFE处理样品结合GC-MS和GC-O分析汉堡牛肉饼中的香气成分，以期为牛肉食品加工及牛肉香精研制提供基础数据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
生汉堡牛肉饼，市场购买；二氯甲烷(色谱纯)、C5～C29正构烷烃(色谱纯)，北京迪马科技公司；无水硫酸钠(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；2,4,6-三甲基吡啶(分析纯)，北京化学试剂公司；噻吩(≥95%)、二甲基二硫醚(≥95%)、2-甲基-3-呋喃硫醇(≥95%)、二甲基三硫醚(≥95%)、2,4,5-三甲基噻唑(≥95%)、3-甲硫基丙醛(≥95%)、2-乙酰基-2-噻唑啉(≥95%)、双(2-甲基-3-呋喃基)二硫(≥95%)、2-甲基吡嗪(≥95%)、2,3,5-三甲基吡嗪(≥95%)、乙基麦芽酚(≥95%)、3-甲基丁醛(≥95%)、戊醛(≥95%)、己醛(≥95%)、(E)-2-戊烯醛(≥95%)、庚醛(≥95%)、辛醛(≥95%)，(E)-2-庚烯醛(≥95%)，(E)-2-辛烯醛(≥95%)，壬醛(≥95%)，(E,E)-2,4-庚二烯醛(≥95%)、癸醛(≥95%)、苯甲醛(≥95%)、(E)-2-壬烯醛(≥95%)、苯乙醛(≥95%)、(E,E)-2,4-壬二烯醛(≥95%)、(E)-2-十一烯醛(≥95%)、(E,E)-2,4-癸二烯醛(≥95%)、2,3-丁二酮(≥95%)、乙偶姻(≥95%)、1-辛烯-3-酮(≥95%)、2-壬酮(≥95%)、苯甲醇(≥95%)、丁酸(≥95%)、3-甲基丁酸(≥95%)、己酸(≥95%)、辛酸(≥95%)、4-乙基辛酸(≥95%)、γ-辛内酯(≥95%)、γ-壬内酯(≥95%)、δ-癸内酯(≥95%)、对甲酚(≥95%)、4-乙基苯酚(≥95%)、3-甲基吲哚(≥95%)，北京百灵威科技有限公司。
1.2 仪器与设备
SAFE装置，莘县玻璃仪器有限公司；Vigreux柱(50 cm×1 cm,I.D.)，北京欣维尔玻璃仪器有限公司；N-EVAP-12干浴氮吹仪，美国Organomation Associates公司；7890A—5975C型气相色谱-质谱联用仪、7890A气相色谱仪，美国Agilent公司；气味测量仪，美国DATU Inc公司。
1.3 实验方法
1.3.1 SAFE提取
取汉堡牛肉饼(130 g/块)用锡纸包裹，置于200 ℃的烤箱中烤15 min，肉饼内温为74 ℃。烤后趁热将牛肉饼掰碎成约(1 cm×1 cm×1 cm)的小块，浸入300 mL的二氯甲烷中，并加20 μL内标2,4,6-三甲基吡啶(1 μg/μL，溶剂二氯甲烷)，搅拌萃取1 h，收集萃取液；再继续用二氯甲烷萃取肉渣2 次(300 mL×2)，将3次所得萃取液合并。
合并的萃取液用SAFE装置处理，恒温水槽温度50 ℃，SAFE的蒸馏头夹层循环水温度为30 ℃，液氮冷凝，系统内压力保持10-5 Pa左右，收集二氯甲烷馏出液，无水硫酸钠干燥，过滤，韦氏柱浓缩至10 mL，氮吹法浓缩至0.3 mL，待GC-MS和GC-O分析。
1.3.2 GC-MS分析
采用2根色谱柱进行分析。DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色谱柱，起始柱温35 ℃，保持1 min，以4 ℃/min升至120 ℃，保持2 min，再以6 ℃/min升至200 ℃，保持3 min，再以8 ℃/min升至220 ℃，保持2 min，220 ℃后运行4 min。HP-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色谱柱，起始柱温35 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升至107 ℃，保持2 min；再以15 ℃/min升至280 ℃，保持2 min，280 ℃后运行2 min。载气为He，流速1 mL/min。进样口温度250 ℃；分流比10∶1，进样1 μL，辅助加热线温度230 ℃。
电子轰击离子源，能量70 eV；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；全扫描模式，质量为50～450 amu；溶剂延迟3 min。
C5～C29 正构烷烃在相同气-质条件下进样，保留指数(retention index，RI)的计算如公式(1)所示：
(1)
式中：tn和tn+1，分别为碳数为n，n+1的正构烷烃的保留时间；ti在碳数为n和n+1的正构烷间出峰的i化合物保留时间。
1.3.3 GC-O分析
由Agilent 7890A GC 装置及气味测量装置组成，毛细管柱为 DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，起始柱温40 ℃，5 ℃/min升至230 ℃；载气为N2(纯度为 99.999%)，流速1 mL/min，进样口250 ℃，不分流模式，进样1 μL。采用2种方法——频率法和稀释法进行嗅闻分析。
频率法：评价小组由8名经过培训的人员组成，评价人员记录嗅闻的气味特征及RI，每人评价2次，共评价16次。至少被4人次嗅闻到时，才记录为实验结果。嗅闻频率(nasal impact frequency，NIF)的计算如公式(2)所示：
(2)
式中：Nt，嗅闻到气味的次数；n，GC-O分析总次数。
稀释法：用二氯甲烷按64倍稀释样品，进行GC-O分析，记录嗅闻到的化合物的气味特征，并将该化合物的稀释因子记为log2FD≥6。
1.4 数据处理
GC-MS分析采用检索NIST11 谱库、RI、标品鉴定化合物，化合物含量的计算如公式(3)所示：
(3)
式中：mi，化合物在牛肉饼的含量，ng/g；Ai，化合物的峰面积；A0，内标的峰面积；m0，内标的质量，ng；m，样品牛肉饼质量，g。
GC-O分析基于GC-MS分析结果、嗅闻的RI、气味特征、标品鉴定化合物；香气活度值(odor-activity value，OAV)的计算如公式(4)所示：
(4)
式中：ωi，化合物在牛肉饼中的含量，ng/g；OTi，该化合物在水里的觉察阈值[10]，ng/g。
2 结果与分析
2.1 GC-MS分析结果
GC-MS分析结果见表1。共鉴定出97种化合物，其中DB-WAX柱上鉴定出83种化合物，HP-5柱上鉴定出69种化合物。不同色谱柱对样品具有不同的分离效果，本实验采用两极性不同色谱柱进行分析，从而确保分析鉴定结果的准确性。另外，2根色谱柱的分析结果具有互补性，从而可鉴定出更多的化合物，如2-庚酮、丁酸、1-丁醇等极性大的化合物仅在DB-WAX柱鉴定出，而肉豆蔻酸、棕榈酸、十五酸等弱极性化合物仅在HP-5柱鉴定出。在鉴定出的96种化合物中，按照化合物分类，含量(含量为极性柱和弱极性的加和，下同)最高的为醛类(2 576.31 ng/g)，其次为酸类(2 306.48 ng/g)、酮类(1 415.89 ng/g)；按照单个化合物，含量最高的为己酸(1 455.21 ng/g),其次为乙偶姻(1 133.10 ng/g)、己醛(453.87 ng/g)、壬醛(400.92 ng/g)。
含硫化合物主要产生于美拉德反应，是熟肉中重要挥发性化合物[11]。本实验中检测出7种含硫化合物，3-甲硫基丙醛含量最高(14.64 ng/g)，其次为2,4,5-三甲基噻唑(9.97 ng/g)和苯并噻唑(8.92 ng/g)。WATANABE等[12]采用SPME/GC-MS分析煮牛肉的挥发性成分，也检测到3-甲硫基丙醛。
表1中检测到的含氮杂环为2-乙酰基-1-吡咯啉，该化合物FRANK等[5]在烤牛肉也曾检测到。吡嗪类化合物易于在高温及低水活度下产生，是烤肉中的典型香气物质。如RAES等[13]在烤牛肉中发现了14种吡嗪化合物，FENG等[14]采用SPME/GC-MS分析不同湿度烘烤牛排的风味化合物，发现当湿度在25%以下时才检测到吡嗪类化合物。本实验中GC-MS分析未检测到吡嗪类化合物，很可能与本实验中牛肉饼在锡纸包裹下进行烘烤，烤制过程中肉的水分含量较高，不易产生吡嗪类化合物或产生的吡嗪类化合物的含量低于GC-MS的检测限有关。
本实验检测到的含氧杂环为2-戊基呋喃和乙基麦芽酚。2-戊基呋喃是亚油酸氧化降解的产物。FRANCISCO等[15]采用SPME/GC-MS分析烤牛肉的挥发性成分中，检测到2-戊基呋喃。乙基麦芽酚是合成香料，可能是饲料中添加导致。
脂肪族的醛、酮、酸、酯、烃，往往是熟肉中主要挥发性化合物，主要产生于脂肪氧化反应。本实验中检出醛类化合物数量较多(24种脂肪醛和2种芳香醛)，其中含量最高的为己醛(453.87 ng/g)，其次为壬醛(400.92 ng/g)、庚醛(275.90 ng/g)、辛醛(205.15 ng/g)、(E)-2-壬烯醛(182.94 ng/g)。己醛、(E)-2-壬烯醛可由亚油酸降解产生，壬醛、庚醛、辛醛可由油酸氧化降解产生。FENG等[14]在烤牛排中也检测到了己醛、壬醛、辛醛、庚醛、(E)-2-壬烯醛，并且己醛的含量最高。
本实验检测出10种酮，包括2,3-丁二酮、2-己酮、3-己酮、2-庚酮、乙偶姻、1-羟基-2-丙酮、1-辛烯-3-酮、2,3-辛二酮、2-壬酮、2-癸酮，含量最高的为乙偶姻(1 133.10 ng/g)，其次为2,3-辛二酮(173.04 ng/g)。HIERRO等[16]采用GC-MS对腌制烟熏牛肉的挥发性化合物进行分析，也曾检测到了乙偶姻、2,3-丁二酮、1-羟基-2-丙酮、2-己酮、2-庚酮、2-壬酮这6种化合物。其中，2-己酮等甲基酮是脂肪酸发生β-氧化和脱羧作用的结果[17]。
检测出10种醇，以2,3-丁二醇含量最高(167.54 ng/g)，其次为1-戊醇(157.14 ng/g)和1-辛烯-3-醇(151.17 ng/g)。ELMORE等[18]在2种不同饲料饲养的烤牛肉中均检测出1-戊醇、1-辛烯-3-醇、1-己醇、1-庚醇、1-辛醇等。1-戊醇和1-辛烯-3-醇来源于脂肪氧化反应，可由亚麻酸降解产生。上述的2,3-丁二酮、乙偶姻、1-羟基-2-丙酮及2,3-丁二醇均来源于美拉德反应，其中2,3-丁二醇可由2,3-丁二酮还原产生。
本实验中检测出7种酯，包括γ-丁内酯、γ-己内酯、γ-辛内酯、γ-壬内酯、棕榈酸甲酯、δ-癸内酯、苯甲酸苄酯。含量最高的为γ-丁内酯(117.10 ng/g)，其次为棕榈酸甲酯(11.45 ng/g)和γ-己内酯(9.82 ng/g)。γ-内酯和δ-内酯类化合物可由γ-和δ-羟基脂肪酸环化脱水产生[19]。
检测到的酸类包括9种短链脂肪酸(C2～C10)和6种长链脂肪酸(C11～C18)。由于短链脂肪酸如丁酸，极性大，主要由DB-WAX色谱柱检出。短链脂肪酸中主要以己酸(1 455.21 ng/g)含量最高，其次是辛酸(170.98 ng/g)和庚酸(114.3 ng/g)。长链脂肪酸(如硬脂酸)，极性弱，主要由HP-5色谱柱检出，并以(E)-9-硬脂油酸含量最高(74.47 ng/g)，其次为棕榈酸(70.23 ng/g)和硬脂酸(38.34 ng/g)。
表1中还检测到13种其他类化合物，其中α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、β-石竹烯、对甲酚可能来源于喂养牛的饲料，甲苯、乙苯、对二甲苯、邻二甲苯、间二甲苯及萘可能来源于环境中的挥发性有机污染物。
表1 烤牛肉饼SAFE/GC-MS分析结果
Table 1 GC-MS analysis results of the volatiles extracted by solvent assistant flavor evaporation (SAFE) in the roasted beef patties
化合物RI含量/(ng·g-1)HP-5DB-WAXHP-5DB-WAX加和/(ng·g-1)鉴定方式含硫化合物(7种)噻吩-1 034-5.10±0.08 5.10MS,RI,S3-甲硫基丙醛9061 4509.27±1.625.37±0.0714.64MS,RI,S2-乙酰基-2-噻唑啉1 1111 7301.38±0.412.90±0.464.28MS,RI,S苯并噻唑1 220-8.92±0.76-8.92MS,RI二甲基二硫醚-1 067-1.31±0.111.31MS,RI,S2,4,5-三甲基噻唑-1 424-9.97±0.119.97MS,RI,S噻吩-1 034-5.10±0.085.10MS,RI,S小计19.5729.7549.32含氮杂环(1种)2-乙酰基-1-吡咯啉-1 322-1.22±0.111.22MS,RI,S小计-1.221.22含氧杂环(2种)2-戊基呋喃9921 22716.22±0.47 9.45±0.0925.67MS,RI乙基麦芽酚-2 008-8.25±0.128.25MS,RI,S小计16.2217.7033.92醛类(24种)3-甲基丁醛6709202.23±0.1494.49±10.0196.72MS,RI,S戊醛69898210.31±0.78 169.61±19.76 179.92MS,RI,S(E)-2-戊烯醛750-3.15±0.13-3.15MS,RI,S己醛8011 075238.22±12.64 215.65±17.09 453.87MS,RI,S(E)-2-己烯醛8521 2105.16±0.556.12±0.4711.28MS,RI庚醛9021 179139.13±8.75 136.77±3.79 275.9MS,RI,S(E)-2-庚烯醛9561 31619.24±2.67 19.04±0.62 38.28MS,RI,S苯甲醛9571 50926.66±0.76 30.28±1.50 56.94MS,RI,S(E,E)-2,4-庚二烯醛9971 48371.71±15.24 18.00±0.95 89.71MS,RI,S辛醛1 0031 284136.76±23.65 68.39±2.70 205.15MS,RI,S苯乙醛1 0421 61510.54±1.14 17.13±0.29 27.67MS,RI,S(E)-2-辛烯醛1 0461 4423.48±0.0945.05±11.1 48.53MS,RI,S壬醛1 1051 388201.19±9.23 199.73±21.28 400.92MS,RI,S(E,E)-2,6-壬二烯醛1 153-7.09±0.22-7.09MS,RI(E)-2-壬烯醛1 1601 52880.85±2.75 102.09±0.4 182.94MS,RI,S癸醛1 2061 49411.43±1.00 10.93±0.11 22.36MS,RI,S(E,E)-2,4-壬二烯醛1 2131 6914.79±0.218.84±0.7313.63MS,RI,S(E)-2-癸烯醛1 2631 63864.78±0.93 83.33±0.34 148.11MS,RI,S(E,Z)-2,4-癸二烯醛1 2951 7588.94±0.1513.15±0.63 22.09MS,RI十一醛1 3121 7466.84±0.3152.14±1.06 58.98MS,RI(E,E)-2,4-癸二烯醛1 3211 80035.96±1.85 55.91±1.34 91.87MS,RI(E)-2-十一烯醛1 3711 74557.89±4.66 61.22±5.53 119.11MS,RI,S十四碳醛1 616-9.23±0.06-9.23MS,RI十六碳醛1 822-12.86±0.20 -12.86MS,RI小计1 168.441 407.872 576.31酮类(10种)2,3-丁二酮-972-20.25±3.23 20.25MS,RI,S2-己酮782-6.25±1.38 -6.25MS,RI3-己酮-1 052-20.52±1.12 20.52MS,RI2-庚酮892-12.81±2.53 -12.81MS,RI乙偶姻-1 275-1 133.10±63.69 1 133.10MS,RI,S1-羟基-2-丙酮-1 288-34.01±1.65 34.01MS,RI1-辛烯-3-酮-1 290-0.74±0.110.74MS,RI,S2,3-辛二酮9861 32054.29±6.91 118.75±5.19 173.04MS,RI2-壬酮1 1941 3847.22±0.211.88±0.019.1MS,RI,S2-癸酮-1 489-6.07±0.336.07MS,RI小计80.571 335.321 415.89醇类(10种)1-丁醇-1 142-16.57±1.04 16.57MS,RI1-戊烯-3-醇-1 157-30.97±1.75 30.97MS,RI
续表1
化合物RI含量/(ng·g-1)HP-5DB-WAXHP-5DB-WAX加和/(ng·g-1)鉴定方式1-戊醇7601 25071.91±6.00 85.23±4.53 157.14MS,RI2,3-丁二醇7871 57282.72±5.56 84.82±0.55 167.54MS,RI1-己醇8701 35228.1±4.7027.91±1.05 56.01MS,RI1-庚醇9721 45531.22±4.82 40.95±1.09 72.17MS,RI1-辛烯-3-醇9811 44963.7±6.8487.47±2.76 151.17MS,RI苯甲醇1 0341 8678.69±0.015.49±0.5314.18MS,RI,S(E)-2-辛烯-1-醇-1 613-18.57±0.61 18.57MS,RI1-辛醇1 0731 55644.43±4.18 33.46±0.50 77.89MS,RI小计330.77431.44762.21酯类(7种)γ-丁内酯9121 61060.52±8.09 56.58±2.85 117.1MS,RIγ-己内酯-1 685-9.82±0.209.82MS,RIγ-辛内酯-1 902-9.62±0.499.62MS,RI,Sγ-壬内酯-2 018-5.26±0.075.26MS,RI,S棕榈酸甲酯1 9292 2168.50±2.652.95±0.1011.45MS,RIδ-癸内酯-2 224-5.42±0.095.42MS,RI,S苯甲酸苄酯1 7742 6524.47±0.343.61±0.508.08MS,RI小计73.4993.26166.75酸类(15种)丁酸-1 620-61.03±9.75 61.03MS,RI,S3-甲基丁酸8471 6653.56±0.368.97±0.5012.53MS,RI,S戊酸-1 731-35.33±2.11 35.33MS,RI己酸1 0101 839561.22±37.94 893.99±4.64 1 455.21MS,RI,S庚酸1 0921 94640.08±0.61 74.22±4.08 114.3MS,RI辛酸1 1852 05487.47±8.96 83.51±0.81 170.98MS,RI,S4-乙基辛酸-2 083-9.78±0.179.78MS,RI,S壬酸1 2912 16122.25±3.33 74.88±24.3597.13MS,RI癸酸1 3782 26753.09±1.56 48.44±0.78 101.53MS,RI月桂酸1 5672 44419.38±4.34 13.29±1.15 32.67MS,RI肉豆蔻酸1 764-26.13±1.27 -26.13MS,RI十五酸1 863-6.82±2.12-6.82MS,RI棕榈酸1 966-70.23±2.06 -70.23MS,RI(E)-9-硬脂油酸2 146-74.47±2.32 -74.47MS,RI硬脂酸2 167-38.34±0.42 -38.34MS,RI小计1 003.041 303.442 306.48烷烃(8种)癸烷1 0001 00241.48±10.594.80±0.0346.28MS,RI十二烷1 2001 20425.11±0.46 29.45±1.10 54.56MS,RI十三烷1 3021 30313.99±2.36 64.50±1.77 78.49MS,RI十四烷1 4001 40540.22±4.33 17.90±0.03 58.12MS,RI十五烷1 5001 50638.82±0.29 13.49±0.32 52.31MS,RI十六烷1 6001 60621.71±1.11 14.18±0.19 35.89MS,RI十七烷1 7001 70210.59±0.01 10.21±1.70 20.8MS,RI十八烷1 801-7.76±0.55 -7.76MS,RI小计199.68154.53354.21其他(13种)甲苯7721 03112.38±2.87 19.91±1.36 32.29MS,RI乙苯8571 11917.74±0.68 23.40±1.28 41.14MS,RI对二甲苯8661 12637.19±0.98 24.37±1.27 61.56MS,RI邻二甲苯8901 13212.24±1.50 43.22±2.18 55.46MS,RI间二甲苯-1 175-24.94±0.53 24.94MS,RIα-蒎烯930-10.22±0.96 -10.22MS,RIβ-蒎烯-1 101-15.78±1.89 15.78MS,RI柠檬烯1 0261 19314.75±1.24 5.26±0.44 20.01MS,RIβ-石竹烯1 4251 58820.80±1.36 17.68±2.01 38.48MS,RI萘-1 723-1.09±0.14 1.09MS,RI对甲酚-2 072-17.57±1.14 17.57MS,RI,S4-乙基苯酚-2 172-2.19±0.32 2.19MS,RI,S3-甲基吲哚-2 494-9.13±1.81 9.13MS,RI,S小计125.32204.54329.86总计3 017.104 979.077 996.17
注：采用质谱(MS)、保留指数(RI)及标品(S)鉴定；“-”表示未检测到
2.2 GC-O分析结果
由表2可知，采用GC-O分析检测到50个RI区域，涉及的气味主要包括肉香、葱蒜香、青香、油脂香、烤香、酸奶香等。鉴定出49种香气活性物质，包括含硫化合物8种、含氮杂环3种、含氧杂环1种、醛类20种、酮类5种、醇类1种、酯类3种、酸类5种，其中有7种GC-MS未检测到，仅由GC-O鉴定。
表2 烤牛肉饼SAFE/GC-O分析结果
Table 2 Analysis results of aroma compounds by solvent assistant flavor evaporation combined with GC-O in the roasted beef patties
嗅闻RI区化合物气味描述词NIF/%log2FD鉴定方式含硫化合物(8种)1 033～1 039噻吩葱蒜38/MS,RI,O,S1 085～1 097二甲基二硫醚葱、白菜63/MS,RI,O,S1 304～1 3112-甲基-3-呋喃硫醇熟牛肉味44/RI,O,S1 363～1 365二甲基三硫醚葱蒜味、硫味44/RI,O,S1 422～1 4262,4,5-三甲基噻唑焦糖香、坚果香94≥6MS,RI,O,S1 431～1 4363-甲硫基丙醛煮土豆味100≥6MS,RI,O,S1 727～1 7332-乙酰基-2-噻唑啉谷物、米饭88≥6MS,RI,O,S2 149～2 158双(2-甲基-3-呋喃基)二硫肉、辛香69≥6RI,O,S含氮杂环(3种)1 226～1 2322-甲基吡嗪烤香75≥6RI,O,S1 321～1 3252-乙酰基-1-吡咯啉米味、烤牛肉88/MS,RI,O1 413～1 4172,3,5-三甲基吡嗪烤香、霉69/RI,O,S含氧杂环(1种)1 990～1 996乙基麦芽酚焦糖100/MS,RI,O,S醛类(20种)920～9333-甲基丁醛巧克力、坚果100/MS,RI,O,S1 006～1012戊醛青香63/MS,RI,O,S1 072～1 077己醛青香94≥6MS,RI,O,S1 134～1 144(E)-2-戊烯醛青63/MS,RI,O,S1 174～1 177庚醛青、甜瓜75/MS,RI,O,S1277～1 281辛醛青香、脂肪、柑橘69≥6MS,RI,O,S1 356～1 360(E)-2-庚烯醛金属、青气75≥6MS,RI,O,S1 377～1 381(E)-2-辛烯醛青香88/MS,RI,O,S1 387～1 391壬醛青、金属44/MS,RI,O,S1 485～1 489(E,E)-2,4-庚二烯醛坚果、脂肪94≥6MS,RI,O,S1 512～1 519癸醛青香、油脂81≥6MS,RI,O,S1 520～1 529苯甲醛杏仁、芳香50/MS,RI,O,S1 563～1 567(E)-2-壬烯醛脂肪、黄瓜100≥6MS,RI,O,S1 614～1 617苯乙醛花香69/MS,RI,O,S1 624～1 629(E)-2-癸烯醛青香、香菜69/MS,RI,O,S1 677～1 682(E,E)-2,4-壬二烯醛青香、脂肪、蜡88/MS,RI,O,S1 740～1 745(E)-2-十一烯醛青香、脂肪、肥皂44/MS,RI,O,S1 786～1 795(E,E)-2,4-癸二烯醛油脂、烤香94≥6MS,RI,O,S1 848～1 85312-甲基十三碳醛牛肉、脂肪、肉汤63/RI,O,S1 968～1 9754,5-环氧-2(E)-癸烯醛金属、青气63≥6RI,O酮类(5种)966～9822,3-丁二酮酸奶100≥6MS,RI,O,S1 047～1 0553-己酮水果、酸奶44/MS,RI,O1 267～1 271乙偶姻酸奶44≥6MS,RI,O,S1 287～1 2911-辛烯-3-酮蘑菇88≥6MS,RI,O,S1 338～1 3452-壬酮奶香88/MS,RI,O,S醇类(1种)1 916～1 921苯甲醇花香44/MS,RI,O,S酯类(3种)1 886～1 893γ-辛内酯椰子75/MS,RI,O,S2 002～2 005γ-壬内酯椰子50/MS,RI,O,S2 218～2 224δ-癸内酯桃子69/MS,RI,O,S酸类(5种)1 600～1 605丁酸酸臭、臭袜子100/MS,RI,O,S1 708～1 7123-甲基丁酸酸、奶酪56/MS,RI,O,S1 814～1 819己酸酸臭94/MS,RI,O,S
续表2
嗅闻RI区化合物气味描述词NIF/%log2FD鉴定方式2 025～2 033辛酸汗味、酸臭31/MS,RI,O,S2 083～2 0894-乙基辛酸膻味81/MS,RI,O,S其他(4种)1 780～1 786未知茴香、甜44/RI,O2 040～2 047对甲酚酚味、药味94≥6MS,RI,O,S2 165～2 1704-乙基苯酚膻味63≥6MS,RI,O,S,2 490～2 4963-甲基吲哚皮革、橡胶50/MS,RI,O,S,
注：基于质谱(MS)、保留指数(RI)、嗅闻的气味(O)、及标品(S)鉴定；“/”表示稀释64倍未检测到
为了准确筛选出对总体香气贡献大的化合物，采用频率法和稀释法2种方法检测。频率法GC-O分析中，检测频率可折算成NIF值来表示，NIF值越大，对总体香气贡献越大。稀释法GC-O分析中，稀释因子越大，对总体香气贡献越大。由表2，NIF值高(≥69%)的包括2,4,5-三甲基噻唑、3-甲硫基丙醛、2-乙酰基-2-噻唑啉、乙基麦芽酚、3-甲基丁醛、己醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、2,3-丁二酮、1-辛烯-3-酮、丁酸、己酸、对甲酚等30个香气活性成分。根据我们以往分析肉风味的经验，稀释法中，直接将样品稀释64倍，仅筛选稀释倍数≥64倍，即log2FD≥6的化合物，这些化合物一般对总体风味贡献大。由表2可知，稀释因子高(log2FD≥6)的化合物中，除了15个频率法检测到的NIF值高(≥69%)的化合物(即2,4,5-三甲基噻唑、3-甲硫基丙醛、2-乙酰基-2-噻唑啉、双(2-甲基-3-呋喃基)二硫、2-甲基吡嗪、己醛、辛醛、(E)-2-庚烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、癸醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、2,3-丁二酮、1-辛烯-3-酮、对甲酚)外，还包括4,5-环氧-2(E)-癸烯醛、乙偶姻、4-乙基苯酚3个化合物。因此，结合频率法和稀释法，认为GC-O分析中有33个化合物(NIF值≥69%或log2FD≥6)，可能对总体香气有重要贡献。
2.3 OAV计算与分析
对上述33个对总体香气可能有重要贡献的化合物计算OAV，其中3-甲硫基丙醛、2-乙酰基-2-噻唑啉、双(2-甲基-3-呋喃基)二硫、2-乙酰基-1-吡咯啉、3-甲基丁醛、己醛、庚醛、辛醛、(E)-2-庚烯醛、(E)-2-辛烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、癸醛、(E)-2-壬烯醛、苯乙醛、(E)-2-癸烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、2,3-丁二酮、乙偶姻、1-辛烯-3-酮、δ-癸内酯、己酸、4-乙基辛酸、对甲酚共24个气味活性成分的OAV≥1，确定它们为烤牛肉饼的关键香气成分，见表3。
表3 采用SAFE/GC-O分析烤牛肉饼中 OAV≥1的化合物
Table 3 The aroma-active compounds of OAV≥1 in the roasted beef patties identified by solvent assistant flavor evaporation (SAFE) combined with GC-O analysis
化合物质量分数/(ng·g-1)阈值/(ng·g-1)OAV含硫化合物(3种)双(2-甲基-3-呋喃基)二硫∗0.570.000 767503-甲硫基丙醛5.370.041342-乙酰基-2-噻唑啉2.900.1224含氮化合物(1种)2-乙酰基-1-吡咯啉1.220.1210醛类(13种)(E,E)-2,4-癸二烯醛55.910.077726(E)-2-壬烯醛102.090.195373-甲基丁醛94.491.279庚醛136.772.849(E,E)-2,4-壬二烯醛8.840.1947(E)-2-辛烯醛45.05315辛醛68.396.910(E)-2-癸烯醛83.33175癸醛10.9334苯乙醛17.136.33己醛215.65982(E)-2-庚烯醛19.04131(E,E)-2,4-庚二烯醛18.0015.41酮类(3种)乙偶姻1 133.1040281-辛烯-3-酮0.740.036212,3-丁二酮20.252.97酯类(1种)δ-癸内酯5.422.52酸类(2种)4-乙基辛酸9.781.85己酸893.998901其他(1种)对甲酚17.57102
注：“*”标注的化合物浓度以提取离子峰面积计算
与分析“烤牛肉”风味物质组成的文献比较，本实验确定的关键香气成分3-甲硫基丙醛在烤箱烤牛肉[2]和内温为70 ℃的烤牛肉[4]的GC-O分析中都曾检测到，且检测频率也较高。(E)-2-壬烯醛、己醛、庚醛、辛醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E)-2-庚烯醛、癸醛、(E)-2-辛烯醛、(E)-2-癸烯醛、苯乙醛曾在烤箱烤牛肉[3]的GC-O分析中检测到，其中壬醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、苯乙醛、(E)-2-辛烯醛的检测频率高。CERNY等[6]采用AEDA/GC-O分析烤牛肉，也曾检测到庚醛、辛醛、2-乙酰基-2-噻唑啉、1-辛烯-3-酮，且2-乙酰基-2-噻唑啉的稀释因子很高。FRANK等[5]采用PT结合时间强度法/GC-O分析烤牛肉的香气活性物质，也曾鉴定出己醛、辛醛、壬醛、2-乙酰基-1-吡咯啉、2-乙酰基-2-噻唑啉、1-辛烯-3-酮。但是上述文献中报道的某些化合物如2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、2-糠硫醇、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪等，本文未鉴定出；而本文鉴定出的乙偶姻、4-乙基辛酸、4-乙基苯酚等化合物，在上述文献中未鉴定出。造成这些实验结果的差异，与所用的牛肉品种、部位、加工方式及萃取分析方法等有关。总体看来，本文鉴定出的化合物数量比现有的关于烤牛肉风味分析的文献报道多一些。
与其他“非烤”牛肉风味分析的文献报道相比，本实验确定的关键香气成分2-乙酰基-1-吡咯啉、δ-癸内酯、3-甲硫基丙醛、壬醛、癸醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛和己酸，曾在采用SAFE结合AEDA/GC-O分析的水煮牛肉中检测到[20]，且3-甲硫基丙醛、壬醛、癸醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、己酸的稀释因子也很高。侯莉等[21]采用AEDA/GC-O分析炖煮牛肉的香气活性物质中也曾检测到双(2-甲基-3-呋喃基)二硫和乙偶姻，且双(2-甲基-3-呋喃基)二硫稀释因子较大。INAGAKI等[22]采用SAFE结合AEDA/GC-O分析了80 ℃水浴加热的日本和牛肋眼肉，检测到了己醛、(E)-2-壬烯醛、乙偶姻等。MACHIELS等[23]采用动态顶空结合频率法/GC-O分析，从2种爱尔兰商业牛肉中检测出3-甲基丁醛、壬醛，癸醛等，其中3-甲基丁醛的检测频率很高。SPECHT等[24]采用PT结合AEDA/GC-O分析浅煎牛肉的香气活性成分中曾检测到2,3-丁二酮和苯乙醛。一般认为，酚类和支链脂肪酸对牛、羊肉的膻味有贡献。曾有报道在水煮牛肉[20]中检测到对甲酚。CHRISTLBAUER等[25]采用SAFE结合AEDA/GC-O分析牛肉蔬菜汤的香气成分中曾检测到4-乙基辛酸。
3 结论
本文以二氯甲烷为溶剂SAFE法提取牛肉饼的挥发性成分，采用HP-5和DB-WAX两色谱柱进行GC-MS分析，共检出97种化合物，其中含量较高的为醛类和酸类；采用频率法、稀释法GC-O分析鉴定出49种香气活性化合物，进一步对检测到的33种频率高(NIF值≥69%)或稀释因子高(log2FD≥6)的香气活性化合物计算OAV，确定3-甲硫基丙醛、2-乙酰基-2-噻唑啉、双(2-甲基-3-呋喃基)二硫、庚醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、乙偶姻、1-辛烯-3-酮等24种化合物为烤牛肉汉堡饼的关键香气物质。
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