牛肉干营养丰富[1]，但在贮藏过程中，由于脂质和蛋白氧化容易引起变色和产生异味[2]。目前，市场上的牛肉干通过在包装中添加干燥剂来延缓贮藏过程中的品质劣变。传统干燥剂的主要成分是氧化钙、硅胶等[3]，虽然具有良好的水分吸附作用，但不能有效抑制牛肉干的脂质和蛋白氧化，且安全性较低。
柠檬籽油(lemon seed oil，LSO)其生物活性成分及抗氧化性能已有报道[4]。CHENG等[5]指出，在肉制品中添加植物精油可产生抗菌和抗氧化作用。然而，将植物精油直接添加到肉制品中后，其颜色和气味让消费者难以接受。所以，经过“包装”后的精油应用于牛肉干的保鲜是一种有效的加工技术。微胶囊技术是指用微小的固体、液体或气体颗粒包覆天然或合成聚合物材料，形成微容器[6]。单层包埋微胶囊的制备方法简单，技术应用广泛，但特殊芯材的保护和传递效果仍有待提高。相比之下，双层微胶囊(多层复合)可以更好地防止外部环境的破坏，控制芯材的释放，特别是对精油等易受光、热、湿等影响的挥发性化合物[7]。
酵母细胞(yeast cell，YC)作为一种脂质体，其细胞壁具有一定的硬度，是一种理想的天然囊壁材料[8-9]。辛烯基琥珀酸酐酯化(octenyl succinic anhydride，OSA)淀粉含有亲水和疏水基团，大大改善了天然淀粉乳化性能，是包封剂和乳化剂的理想材料[10]。双包埋技术制备牛肉干保鲜剂的原理如图1所示，当环境湿度较低时，双层封装会减缓内核材料的释放。当环境湿度较高时，外层淀粉作为一种水分吸附剂降低环境湿度，吸附水分后的淀粉同时又作为一种传导介质加速芯材的释放。
因此，本文以LSO为芯材，YC和酯化淀粉为壁材，采用双层包埋法制备复合微胶囊(complex microcapsules,SMC)。通过SMC的性能表征及其对牛肉干保鲜效果的研究，以期替代传统干燥剂，为牛肉干保鲜剂的制备提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜牛后腿精瘦肉，甘肃省兰州市安宁区桃海市场；柠檬籽，中国山西野山食品有限公司；安琪干酵母，安琪酵母股份有限公司；OSA淀粉，润航生物科技有限公司(中国山东)。
正己烷、乙醇、氯化钙、氧化镁、乙二胺四乙酸二钠、2-硫代巴比妥酸、盐酸、硼酸、三氯乙酸、甲基红等，均为分析纯，天津市光复科技发展有限公司。
a-SMC的制备；b-SMC的应用
图1 SMC的制备及应用
Fig.1 Preparation and application of SMC
1.2 仪器与设备
食品级粉碎机，中国浙江永康红日机电有限公司；磁力搅拌器，中国上海常州国华电器有限公司；RE52CS旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；THZ-83-2 N台式恒温振荡器，上海跃进医疗器械有限公司；TGL-16M高速台式离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 LSO的提取
LSO的提取参考崔秋兵等[11]的方法略作修改。选择颗粒饱满、颜色为白色的柠檬籽，用粉碎机研磨成粉末过40目筛。将柠檬籽粉末与正己烷(提取剂)以料液比1∶6混合，并置于45 ℃水浴锅中加热3 h，同时使用低速磁力搅拌器(300 r/min)搅拌混合物。提取后，以3 000 r/min的速度离心10 min提取上清液，将上清液倒入旋转蒸发器中除去提取剂(70 ℃)，烧瓶中的溶液不超过1/2的体积，当冷凝管下端无液体滴落时结束蒸发。剩余的橙黄色油状液体贮存在4 ℃的黑暗、密封环境中。
1.3.2 复合微胶囊的制备
将安琪干酵母用(35±2) ℃的水配制成200 g/L的溶液，与80%(体积分数)的乙醇以料液比1∶2的比例混合，在25 ℃下放置2 h，然后将混合物离心取沉淀(5 000 r/min，10 min)，将离心后的YC置于室温下以挥发残留的乙醇，然后冷冻干燥24 h，得到醇化YC冻干粉。将YC冻干粉用(35±2) ℃的温水制成200 g/L的溶液，并与均质的LSO(6 000 r/min，2 min)以2∶1的芯壁比混合。然后将混合物置于台式恒温振荡器(150 r/min)中以振荡时间4 h和振荡温度50 ℃下，使LSO完全进入YC内部。在振荡结束时获得的乳化油混合物是YC微胶囊(YC microcapsules，YMC)乳液。
将OSA淀粉制备成30 g/L的乳液(90 ℃搅拌20 min，500 r/min)，并与YMC乳液以1∶1(体积比)混合，然后使用电动搅拌(500 r/min)在50 ℃搅拌30 min，同时加入1%(质量分数)氯化钙试剂。搅拌的SMC乳液用喷雾干燥法干燥，入口温度为150 ℃，出口温度为110 ℃，进料速度为10 mL/min。
1.3.3 复合微胶囊的表征
1.3.3.1 包埋率
参考FU等[12]的方法略作修改。将10 g SMC样品溶于100 mL正己烷溶液中，用超声波仪(500 W，40 kHz)于60 ℃超声30 min，取上清液，沉淀物用50 mL 正己烷清洗2次，滤液与第1次上清液合并。将混合滤液置于旋转蒸发器中以除去提取剂，然后在60 ℃的干燥箱中干燥直到获得恒定重量，并记录重量以获得油的总量。SMC的载油量计算如公式(1)所示：
载油量
(1)
式中：m1指SMC样品质量，g；m2指干燥后油的质量，g。
1.3.3.2 扫描电镜
将SMC样品取少量置于粘有双面胶带的金属样台上，喷金处理后放在扫描电镜仪下微胶囊的微观结构。
1.3.3.3 傅里叶红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)分析
将YMC、SMC等干粉样品与干燥的KBr混合压片制样，形成1个薄片。然后，将液体油样(LSO)加入到KBr混合物中压片制样。所有的样品都通过衰减全反射FTIR(attenuated total reflectance-FTIR，ATR-FTIR)(Nicolet iS5，Thermo Fisher Scientific，美国)在400～4 000 cm-1进行扫描分析。
1.3.3.4 差示扫描量热分析(differential scanning calorimetry，DSC)
参考MEHRAN等[13]的方法，在20～170 ℃研究微胶囊的热稳定性。
1.3.4 牛肉干贮藏指标
1.3.4.1 复合微胶囊在牛肉干贮藏中的应用
将SMC(肉干质量的5%)置于无纺布袋中密封，与牛肉干一起装在牛皮纸袋中(图1-b)，置于当地北京华联超市中，进行180 d的牛肉干贮藏实验。分别在0、30、60、90、120、150和180 d时通过对牛肉干挥发性盐基氮(total volatile basic-nitrogen，TVB-N)、硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substances，TBARs)和感官评价等指标的测定，研究SMC对牛肉干品质的影响。同时以空白和传统干燥剂为对照组。
1.3.4.2 TVB-N的测定
参照国标GB 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》。
1.3.4.3 TBARs的测定
参照国标GB 5009.181—2016《食品中丙二醛的测定》。
1.3.4.4 感官评价
参考关文强等[14]的方法，并略作修改。选择不排斥牛肉干制品的食品专业学生和老师30名人员(男12人，女18人；年龄均在20～55周岁)，对肉样色泽，气味，质地和口感进行评分。每项指标满分为25分(表1)，综合得分为4项指标平均得分。
表1 牛肉干感官评分标准
Table 1 Sensory scoring criteria for beef jerky
指标感官评分16～25分6～15分1～5分色泽断面有光泽,颜色均匀;呈棕红色断面有光泽,颜色不均匀;呈深褐色断面无光泽,颜色不均匀,呈黑色气味有牛肉独特的香味,浓郁深厚有牛肉独特的香味,无明显异味有明显异味质地质地硬,结构紧实,无黏感质地软硬适中,结构松弛,无黏感质地软,有黏感口感有嚼劲,味道醇厚有嚼劲,味道较淡无嚼劲,无回味
1.4 数据处理
所有试验数据重复3次求平均值，采用Design-Expert.V8.0.6软件进行响应面优化处理，使用Origin 2017和SPSS 22.0等分别对试验数据进行绘图处理、显著性分析和方差计算。
2 结果与分析
2.1 SMC的包埋率
SMC的载油量表示总油量与双包微胶囊质量的比率，是衡量微胶囊封装效率的指标。根据公式(1)计算发现，SMC的载油量为193.003 mg/g，这与KAVOSI等[15]的结果一致，其研究发现苋菜YMC的载油量为186.87～230.70 mg/g。
2.2 SMC的微观结构
不同微胶囊的微观结构如图2所示。YC和OSA淀粉均表面光滑，结构完整。YMC细胞间结块，细胞结构完整，包埋紧实。这是因为YC壁对内部的精油起到固定作用，所以经过精油包埋后的YMC结构不同于单一YC。SMC双层包埋过程中，淀粉颗粒结晶区氢键被破坏，吸水膨胀呈乳浊液状，与YC溶液充分混合后，冷却形成网状结构将含有植物精油的YC包裹其中[16]。
a-YC；b-OSA淀粉；c-YMC；d-SMC
图2 不同包埋微胶囊的扫描电镜
Fig.2 Scanning electron microscopy of different embedded microcapsules
2.3 FTIR和DSC分析
不同微胶囊的FTIR结果见图3-a，LSO的特征吸收带出现在2 921、1 737、1 467和1 161 cm-1处，分别对应于官能团
和C—O—C[17]。YMC的光谱在3 320 cm-1附近有氧氢振动峰，这与酵母多糖中—OH拉伸振动峰位置相同。同时，YC蛋白的酰胺I和II拉伸振动带和β-1,3葡聚糖的拉伸振动带在1 617、1 525和1 013 cm-1处观察到[15]。SMC中的2次封装显示出与YMC类似的峰值，具有明显的酰胺和特征的C—O—C带。此外，还观察到YMC中没有的拉伸振动带3 309 cm-1处的突出峰值，这被认为是淀粉多糖的收缩振动(—OH)[18]。与YMC相比，双层包埋后出现了1个新的化学峰，可能是由于YMC和酯化淀粉之间的新氢键形成的原因。
LSO、YMC和SMC的DSC结果如图3-b所示。不同物质在发生玻璃态转化后焓变量越多，说明物质越稳定，越不容易发生性质变化。在图3中，随着温度的升高，三者玻璃态转化温度分别是112、136和144 ℃，首先发生热变的是LSO，其次是YMC，最后为SMC。LSO的焓变值ΔH=1.138 1 J/g，YMCΔH=27.542 J/g，SMCΔH=63.559 J/g，与单包埋相比，双包埋焓变值增大，说明经过包埋后精油的热稳定性提高，这可能是新的氢键增加了微胶囊的焓变值，这与FTIR结果一致。
a-FTIR图；b-DSC图
图3 不同包埋微胶囊的红外光谱和DSC结果
Fig.3 FTIR spectrum and DSC result of different embedded microcapsules
2.4 柠檬籽精油复合微胶囊对牛肉干保鲜作用的影响
牛肉干贮藏过程中TBARs的变化如图4-a所示。在包装中后期(>60 d)干燥剂组TBARs显著低于空白组(P>0.05)，这是由于干燥剂吸附环境水分，低水分含量抑制生物酶活性，进而抑制脂质氧化的发生[19]。在整个贮藏期间，SMC组TBARs始终最低，这可能是由于SMC具有吸附水分的能力，并且包埋的LSO缓慢释放，其通过与自由基中氢原子的结合进而抑制了脂质氧化的发生[20]。
TVB-N是肉制品在蛋白质和非蛋白含氮化合物氧化降解过程中产生的一种碱性挥发性物质，TVB-N升高，会影响牛肉干的食用品质[21]。牛肉干贮藏180 d后TVB-N的变化趋势与TBARs基本一致(图4-b)，与空白组相比，干燥剂组和SMC组TVB-N含量更低。从第90天开始，SMC组TVB-N值显著低于干燥剂组(P<0.05)，说明SMC优于干燥剂可以抑制TVB-N的产生，进而延缓牛肉干的食用品质的降低。
通过牛肉干感官评价分析(图4-c)可知，0 d的肉干有光泽呈棕红色，具有牛肉独特的香气；结构紧实且有嚼劲。随着时间的延长，贮藏30 d后，3组牛肉干的感官性均有降低，且空白组的变化最为明显，牛肉干色泽加深，表面出现黏稠感，质地松散，嚼劲变差，还产生了不愉快的气味，这与TBARs和TVB-N的结果一致，脂质和蛋白氧化影响牛肉干的颜色和风味导致感官评分值降低。相比之下，SMC组相较其他两组感官评分高，同时，在贮藏过程中，没有产生因精油的挥发而导致的不愉悦的气味，这表明双包埋法具有良好的缓释效果。但表面也发生轻微干裂，这与GUO等[22]研究的结果一致。
3 结论
本研究使用双层包埋法设计制备一种新型保鲜剂(柠檬籽精油复合微胶囊)。经过双层包埋后，微胶囊表面粗糙，结构完整，FTIR证明有新的氢键形成，说明双包埋效果显著，且热稳定性提高。与传统干燥剂相比，双包埋微胶囊能够抑制牛肉干的脂质和蛋白氧化作用，延长了牛肉干的货架期。因此，SMC为牛肉干保鲜剂的开发提供了技术支撑，为天然植物油在抗氧化作用中的应用提供了一种新的方法和包装方式。
a-TBARs；b-TVB-N；c-感官评价
图4 微胶囊对牛肉干保鲜效果影响
Fig.4 Effect of micro capsules on the fresh preservation effect of beef jerky
注：图中不同大写字母表示同一贮藏时间不同处理间差异显著(P<0.05)，不同小写字母表示同一处理组不同时间的差异显著(P<0.05)
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