酵母菌是人类文明史中被应用得最早的微生物，其中拮抗酵母菌在果蔬贮藏期病害防治领域被广泛研究[1]。将拮抗微生物作用于病原菌虽然效果很好，但因其活体生长要求营养条件苛刻，很难直接作用于食品上并实现工业化生产。因此，从微生物和代谢物质中提取具有抑菌功能的物质成为新的研究方向。
已有研究表明，拮抗菌D.hansenii产生的低分子质量蛋白能够抑制所有被测病原菌菌丝体的生长，从而延长果实的保藏时间和果品质量[2-3]。交链孢霉菌(Alternaria alternata sp.)是低温环境下导致水果、蔬菜等农产品腐烂变质的主要致病微生物，是果蔬保鲜的重要防治对象[4]，作者所在实验室分离得到1株膜醭毕赤酵母，对交链格孢菌有明显的抑制作用[5]，对其抑菌成分的开发可为该菌工业化应用提供有力的保证。
本文对膜醭毕赤酵母发酵液进行初步抑菌性探索，在此基础上，以玉米淀粉为基质，添加食品级卡拉胶共混，以甘油为增塑剂制备复合抑菌膜。探索粗提纯蛋白的加入对复合膜力学性能、阻隔性能和外观形态等的影响，并研究该复合膜对交链格孢菌生长的抑制作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
玉米淀粉、卡拉胶(食品级)，河南万邦化工科技有限公司；甘油、硫酸铵(分析纯)，天津市风船化学试剂科技有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶(分析纯)，索莱宝科技有限公司。
1.2 供试菌和培养基
膜醭毕赤酵母菌(Pichia membranaefaciens)、交链孢菌(Alternaria alternata)和灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)由天津科技大学农产品物流保鲜与加工研究室提供。
1.3 仪器与设备
TU-1810紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；TE32 TA.XT.plus质构仪，英国Stable Micro System公司；ZHJH-C1109B无菌操作台，上海智城分析仪器制造有限公司；TGL-16M高速冷冻离心机，上海向帆仪器有限公司；CH1S测厚仪，上海六菱仪器厂。
1.4 膜醭毕赤酵母发酵液抑菌性研究
(1)膜醭毕赤酵母发酵液制备
将膜醭毕赤酵母接种于PDA液体培养基中，摇床培养3～5 d后，离心收集上清液，即为无细胞发酵液。
(2)发酵液对灰葡萄孢菌的离体抑制作用
参照余巧银等[6]的方法，在27 ℃下，培养5 d，观察发酵液对灰葡萄孢菌的离体抑制作用。观察、计算抑菌率，如公式(1)所示：
抑菌率
(1)
(3)蛋白酶对发酵液抑菌活性的影响
将无细胞发酵液用1 mol/L的NaOH调节至pH为7后，分别加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K，使其终浓度为0.2 mol/L，在37 ℃水浴中充分反应4 h后，沸水浴加热0.5 h，以同样处理未接入蛋白酶的无细胞发酵液为对照组1；将无细胞发酵液用1 mol/L HCl调节至pH为2后加入胃蛋白酶，同样以未接入蛋白酶的发酵液为对照组2。参照1.4(2)中的方法分别测定在添加不同蛋白酶处理发酵液的培养基中灰葡萄孢菌的生长直径，以无菌水为对照组计算抑菌率。
1.5 生物蛋白抑菌复合膜的制备
(1)抑菌蛋白盐析提取
在冷水浴下，将硫酸铵研磨后缓慢加入膜醭毕赤酵母发酵液中至硫酸铵的最终饱和度达到60%。冷藏过夜，离心收集蛋白质沉淀物，透析除盐后冷冻干燥得到蛋白质提取物粉末。
(2)抑菌复合膜的制备
配制质量分数为6%的玉米淀粉溶液加热糊化30 min[7]，同时配制质量分数为0.4%卡拉胶溶液，微波加热[8]。将上述两种溶液等体积混合后，向其中加入体积分数为1%的甘油制备成基础膜液。
将冻干蛋白提取物粉末配制成10 mg/mL的溶液，随后进行2倍梯度稀释至16倍，将原液与各稀释后的溶液分别按体积分数为1%加入基础膜液中。
采用流延法[9-10]，取20 mL倒入直径9 cm的一次性培养皿中，在45 ℃下恒温干燥4 h后揭膜。将复合膜样品存放于相对湿度(50±2)%环境中平衡48 h备用。
1.6 复合膜性质测定
1.6.1 厚度
参照张伸[11]的方法，测定复合膜的厚度。利用手持测厚仪(精确到0.001 mm)测定薄膜边缘和中间10个点的厚度，取平均值。
1.6.2 力学性能
参照颜田田等[12]和肖力源等[13]的测定方法和计算公式，使用TA.XT.plus型质构仪测定复合膜的拉伸强度(tensile strength,TS)及断裂伸长率(elongation at break,EAB)。
1.6.3 透湿性能
根据GB 1037—88《塑料薄膜和片材透水蒸气性试验方法杯式法》，参照陈红艳等[14]的方法，水蒸气透过系数(water vapor permeability,WVP)计算如公式(2)所示：
(2)
式中:Δm为称量瓶增加的质量，g；d为复合膜的平均厚度，mm；A为称量瓶瓶口面积，m2；t为称量瓶放入恒湿器中的时间，24 h；Δp为23 ℃下的水蒸气压，KPa。
1.6.4 透明度
参照王海霞[15]的方法和计算公式，测定膜的吸光度值。计算复合膜透明度。
1.7 抑菌蛋白复合膜对交链格孢菌抑菌作用实验
(1)平板对峙法：参照乔博鑫等[16]的方法，实验组注入30 μL抑菌复合膜液，对照组注入30 μL无菌水。于28 ℃下培养5 d后观察、记录。
(2)含药平板法[17]：将复合膜液与融化后的PDA培养基混合，待培养基凝固后，接入直径为1 cm的交链格孢菌菌片，以无菌水组作为对照，于28 ℃下培养5 d后观察、记录。
1.8 数据统计分析
采用SPSS 19.0进行数据统计分析，数据用平均值±标准误差表示，使用Origin 2017软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 蛋白酶对发酵液抑菌活性的影响
由图1可知，胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶均能显著降低发酵液的抑菌活性(P<0.05)，经过胃蛋白酶处理的发酵液的抑菌率仅为36.30%，而对照组为65.97%，但木瓜蛋白酶对发酵液的抑菌性影响不大。实验证明，发酵液中存在蛋白类抑菌物质。
A-胰蛋白酶；B-木瓜蛋白酶；C-蛋白酶K；D-胃蛋白酶； CK1-对照组1；CK2-对照组2；CK-无菌水 a-不同蛋白酶处理后发酵液对灰葡萄孢菌生长的影响； b-不同蛋白酶处理后发酵液的抑菌率
图1 蛋白酶对发酵液抑菌性的影响
Fig.1 Effect of protease on the antibacterial activity of fermentation broth
注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
2.2 复合膜的性质
2.2.1 外观形态
通过观察外观形态可以直接了解薄膜的颜色、透明程度及表面状态。由图2可看出，抑菌复合膜与基础复合膜相比，颜色微黄，二者均较透明且表面平整光滑，无明显的颗粒感和粗糙感。
a-基础复合膜；b-抑菌蛋白膜
图2 玉米淀粉-卡拉胶基础复合膜与抑菌蛋白膜外观形态图
Fig.2 Appearance of corn starch-carrageenan basic composite film and bacteriostatic protein film
2.2.2 厚度和透湿性能
WVP是衡量包装材料阻隔外界水气接触内部食品的重要指标。由表1可知，抑菌复合膜与基础复合膜在厚度和WVP方面差异不显著(P>0.05)，说明蛋白提取物的加入对复合膜的厚度和WVP无较大影响，抑菌复合膜薄厚均匀且有良好的水分保持作用。这可能是由于蛋白提取物与玉米淀粉、卡拉胶等基础成膜材料具有良好的相容性[18]，抑菌复合膜质地连续均匀。
表1 抑菌复合膜与基础复合膜厚度和WVP对比
Table 1 Comparison of thickness and WVP between antibacterial composite membrane and basic composite membrane film
实验组厚度/mmWVP/[(g·mm)·(m2·KPa·24 h)-1]基础复合膜0.086 3±0.007 0a0.630 0±0.435 9a00.076 7±0.005 8a0.600 0±0.692 8a20.082 0±0.010 0a0.573 3±0.080 8a4 0.090 3±0.017 3a0.623 3±0.153 7a8 0.077 0±0.002 0a0.593 3±0.100 2a16 0.080 0±0.010 0a0.616 7±0.072 3a
注：0、2、4、8、16分别代表不同稀释倍数蛋白溶液制备的抑菌复合膜；不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
2.2.3 透明度和力学性能
透明度是衡量包装材料性能的指标之一，良好的透明度便于观察被包食品的外观形态。由图3可知，基础复合膜透明度可达到(66.80±1.63)%，加入蛋白提取物原液的复合膜透明度仅有(52.09±1.32)%，下降了18.71%。此外，透明度随着蛋白提取物浓度降低而上升，当稀释倍数达到16时，抑菌复合膜的透明度升至(64.54±1.63)%，与基础复合膜之间无明显差异。这可能是由于蛋白提取物本身呈现黄色，加入后使膜也呈现黄色(如2.2.1所示)阻碍了光的传播路径。
图3 不同浓度蛋白提取物对复合膜透明度的影响
Fig.3 Effects of different concentrations of protein extracts on the transparency of composite membrane
力学性能反应了薄膜的柔韧性和抗拉强度，由图4可知,蛋白提取物的加入使复合膜的TS下降，EAB上升。基础复合膜的TS为(11.86±0.50) N/mm2，抑菌复合膜的TS为(5.80±1.54) N/mm2，下降了51%。普通复合膜的EAB为(35.19±7.27)%，抑菌复合膜的EAB为(62.07±6.41)%，增长了43%。这可能是因为蛋白提取物与淀粉发生相互作用，使淀粉本身氢键作用降低[19]，导致复合膜抗拉强度降低，由脆性向柔性转变。
图4 抑菌蛋白复合膜和普通复合膜力学性能对比图
Fig.4 Comparison of mechanical properties between antibacterial protein composite membrane and ordinary composite membrane
2.2.4 抑菌膜对交链格孢菌的离体抑制作用
平板对峙法：如图5所示，经过对峙实验发现，在培养5 d后，在分界线上出现明显的抑菌带，菌落半径在靠近左侧小孔明显一侧小于垂直方向上，靠近小孔测的菌落半径只有(1.8±0.1) cm，在垂直方向上菌落半径为(3.8±0.1) cm，说明抑菌膜液对交链孢菌有明显的抑制作用。
含药平板法：如图6所示，在培养5 d后，含药平板菌落直径明显小于对照组，实验组菌落直径仅为(1.2±0.1) cm，而对照组菌落直径为(6.5±0.1) cm，约是实验组菌落直径的5.4倍，说明抑菌复合膜液对交链孢菌有明显的抑制作用。
a-空白对照;b-实验组反面;c-实验组正面
图5 抑菌蛋白膜液与交链孢菌平板对峙结果
Fig.5 Results of confrontation between antibacterial protein film solution and Alternaria alternata plate
a-实验组;b-对照组
图6 含抑菌复合膜液药平板对交链孢菌抑制作用
Fig.6 Inhibitory effect of liquid drug plate containing antibacterial composite membrane on Alternaria alternata
3 结论
近年来，以拮抗酵母菌为基础的果蔬采后病原微生物防治产品的研究开发取得了令人瞩目的进展[19]，本实验室已有的研究表明，膜醭毕赤酵母菌发酵液中可能存在蛋白类抑菌物质，寻找能够维持抑菌成分生物活性的载体成为进一步的研究方向[20]。本文在此基础上，进一步探索了以玉米淀粉-卡拉胶复合膜为基础的膜醭毕赤酵母菌外泌蛋白抑菌复合膜。
经实验测定发现，外泌蛋白提取物与成膜基质间有较好的相容性，添加蛋白提取物的抑菌复合膜与基础复合膜相比，仍具有薄厚均一、平整致密和延缓水分散失的优点；力学性能和外观形态对比发现，蛋白提取物的加入会使复合膜的颜色加深，透明度下降，由脆性向韧性转变；经过抑菌作用分析，该抑菌复合膜对交链格孢菌菌丝生长有直接的抑制作用，能显著抑制菌落的扩大。
膜醭毕赤酵母菌外泌蛋白抑菌复合膜是一种天然、安全包装材料，为生物防治果蔬腐败变质产品的开发提供了新思路。
[1] 罗琳, 周泠璇, 刘娅.毕赤酵母G5拮抗葡萄灰霉病机理初探[J].生物技术通报, 2017, 33(9):210-215.
LUO L, ZHOU L X, LIU Y.Preliminary study on the mechanism of Pichia pastoris G5 antagonizing Botrytis cinerea [J].Biotechnology bulletin, 2017, 33 (9):210-215.
[2] ÇORBAC C, UÇAR F B.Purification, characterization and in vivo biocontrol efficiency of killer toxins from Debaryomyces hansenii strains[J].International Journal of Biological Macromolecules,2018, 119:1 077-1 082.
[3] AL-QAYSI S A S, AL-HALAH H, THABIT Z A, et al.Production, characterization, and antimicrobial activity of Mycocin produced by Debaryomyces hansenii DSMZ70238[J].International Journal of Microbiology,2017, 2017:2605382.
[4] 赵永胜, 石文鑫, 郝变青, 等.山西葡萄中链格孢菌分离鉴定与污染水平分析[J].食品安全质量检测学报, 2021, 12(14):5 526-5 530.
ZHAO Y S, SHI W X, HAO B Q, et al.Isolation, identification and pollution level analysis of Alternaria in grapes in Shanxi[J].Journal of food safety and quality inspection,2021,12 (14):5 526-5 530.
[5] GUO H L, CUI E L Y, ZHU E L, et al.Effect of antagonistic yeast Pichia membranaefaciens on black spot decay of postharvest broccoli[J].European Journal of Plant Pathology, 2015, 143(2):373-383.
[6] 余巧银, 郭红莲, 邢紫娟, 等.拮抗酵母对西兰花黑斑病及品质的影响[J].现代食品科技, 2018, 34(2):110-116;74.
YU Q Y, GUO H L, XING Z J, et al.Effects of Antagonistic Yeast on broccoli black spot and quality [J].Modern Food Science and Technology.2018,34 (2):110-116；74.
[7] ABDOLLAHZADEH E, NEMATOLLAHI A, HOSSEINI H.Composition of antimicrobial edible films and methods for assessing their antimicrobial activity:A review[J].Trends in Food Science & Technology, 2021, 110:291-303.
[8] 张阳, 张庆, 赵祎, 等.κ-卡拉胶/魔芋葡甘聚糖/羧甲基淀粉复合膜及空心胶囊制备[J].食品与发酵工业, 2022,48(8):150-158.
ZHANG Y, ZHANG Q, ZHAO Y, et al.Preparation of κ carrageenan/konjac glucomannan/carboxymethyl starch composite membrane and hollow capsule [J].Food and fermentation industries, 2022,48(8):150-158.
[9] 许卉佳, 刘仁杰.可食性马铃薯淀粉抑菌膜的研究[J].食品科技, 2017, 42(3):195-198.
XU H J, LIU R J.Optimized technology for preparing antibacterial film with edible potato starch[J].Food Science and Technology.2017, 42 (3):195-198.
[10] 李荣荣. 淀粉基植物复合膜材的制备工艺及性能研究[D].聊城：聊城大学, 2017.
LI R R.Preparation and characteristics research of starch-based plant complex membrane[D].Liaocheng:Liaocheng University, 2017.
[11] 张伸. 基于海藻酸钠可食用抗菌复合膜的制备与性能研究[D].哈尔滨：哈尔滨工业大学, 2018.
ZHANG S.Fabrication of edible antibacterial composite films based on sodium alginate and their properties[D].Harbin:Harbin Institute of Technology, 2018.
[12] 颜田田, 戚勃, 杨贤庆, 等.增塑剂对卡拉胶可食用膜性能的影响[J].食品与发酵工业, 2019, 45(23):97-102.
YAN T T,QI B, YANG X Q, et al.Effects of plasticizers on properties of carrageenan edible films[J].Food and Fermentation Industries, 2019,45 (23):97-102.
[13] 肖力源，余国贤，雷晏琳，等.玉米淀粉/壳聚糖/魔芋葡甘露聚糖复合膜的制备及物性研究[J].中国粮油学报,2018, 33(4):86-92;100.
XIAO L Y, YU G X, LEI Y L, et al.Preparation and physical properties of corn /chitosan/konjac glucomannan composite film[J].Journal of the Chinese Cereals and Oils Association,2018,33(4):86-92;100.
[14] 陈红艳, 宋苏, 李青青, 等.竹纤维素增强复合膜的制备及性能[J].中国农业大学学报, 2019, 24(12):121-127.
CHEN H Y, SONG S, LI Q Q, et al.Preparation and properties of bamboo cellulose reinforced composite membrane [J].Journal of China Agricultural University,2019,24 (12):121-127.
[15] 王海霞. 大豆分离蛋白可食性包装膜的共混改性研究[D].哈尔滨:东北林业大学, 2018.
WANG H X.The research on the blending modification of the soy protein isolate edible film[D].Harbin:Northeast Forestry University, 2018.
[16] 乔博鑫, 郭红莲, 邹欣欣, 等.拮抗酵母BS-316抑菌成分分离与应用的初步研究[J].保鲜与加工, 2019, 19(1):46-50.
QIAO B X, GUO H L, ZOU X X, et al.Preliminary study on isolation and application of antimicrobial components from antagonistic yeast bs-316[J].Storage and process,2019,19(1):46-50
[17] 张鸿雁, 林国莉, 李如莲，等.番茄果腐病拮抗菌的筛选及对番茄的防腐保鲜作用[J].生物技术通报, 2022,38(3):69-78.
ZHANG H Y, LIN G L, LI R L, et al.Screening of antagonist against tomato fruit rot and their preservation qualities on tomato[J].Biotechnology Bulletin, 2022,38(3):69-78.
[18] 程龙, 郝艳玲, 宋小双.壳聚糖对玉米淀粉可食膜性能的影响[J].中国塑料, 2021, 35(4):35-41.
CHENG L, HAO Y L, SONG X S.Effect of Chitosan on the properties of edible corn starch film [J].China plastics,2021,35 (4):35-41.
[19] SONG X S, ZUO G J, CHEN F S.Effect of essential oil and surfactant on the physical and antimicrobial properties of corn and wheat starch films[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2018, 107:1 302-1 309.
[20] 季小诗，郭红莲，王笑笑，等． 拮抗菌发酵液对冬枣贮藏品质的影响 [J].食品与发酵工业, 2021, 47(14)：82-87.
JI X S, GUO H L, WANG XX, et al.Effects of an antagonistic yeast fermentation broth on the storage quality of winter jujube[J].Food and Fermentation Industries, 2021, 47(14)：82-87.