高温堆积发酵是白酒生产过程中的一个重要环节，又称“二次制曲”，堆积发酵可汇聚空气中的微生物[1-2]，促进酒醅中的淀粉和蛋白质等物质进行分解转化，还为美拉德反应提供反应条件及前体物质[3]。高温堆积发酵可以较好地改良原酒酒体的风味与品质，改善原酒的风格及丰富原酒的香味物质成分，为形成酒体风格提供香味成分或积累香味前体物质[4]发挥重要的作用。
张治刚等[5]利用GC法对贾湖白酒的香气成分进行分析检测，得出醇类物质是香气成分中占比最大一类物质,大量文献表明，白酒中主要醇类物质除乙醇外，还有丙醇、正丁醇、异丁醇等高级醇，且含有芳香族类的β-苯乙醇[6-9]。β-苯乙醇是白酒、黄酒、酱油等传统发酵食品中重要的风味物质，具有柔和、淡雅细腻的玫瑰气味[10]。β-苯乙醇是白酒形成独特风味的重要因素之一，同时也与拥有玫瑰香气的壬酸乙酯的合成有关[6]。由此可见，β-苯乙醇对白酒呈香具有较为重要的影响[5,11]。酵母菌是合成β-苯乙醇主要菌属，已有酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母等种属合成β-苯乙醇的研究[12-15]。因此本文尝试从贾湖酒厂高温堆积酒醅中分离筛选出高产β-苯乙醇酵母菌株，并对其进行分子生物学鉴定、产香培养条件优化以及产香特性的研究[16-17]。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
贾湖高温堆积酒醅样品；β-苯乙醇标品、L-苯丙氨酸(L-phenylalanine，L-Phe)、UNIQ-10柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒、2×San Taq PCR Mix，上海生工生物工程有限公司；色谱级甲醇，Giovini Chemical Technology有限公司；磷酸二氢钾，天津市科密欧化学试剂有限公司；无水葡萄糖、无水硫酸镁，天津市大茂化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
YP20001电子天平，上海奥豪斯仪器有限公司；D-37085 PCR仪，Veriti(德国)；UV-1800PC分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；DYY-6C电泳仪，北京市六一仪器厂；Tanon-3500全自动数码凝胶图像分析系统，上海天能科技有限公司；GR85DA型蒸汽灭菌锅，济南来宝医疗器械有限公司；SHP-25型恒温培养箱，上海森信实验仪器有限公司；ZNC-1500智能型洁净工作台，苏洁医疗器械(苏州)有限公司。
1.3 培养基
YPD培养基、PDA培养基、转化培养基均参考文献[18]。其中转化培养基成分调整为(g/L):酵母提取物10.0、L-Phe 5.0、蛋白胨10.0、磷酸二氢钾2.0、无水硫酸镁0.5、葡萄糖25.0。
1.4 试验方法
1.4.1 酵母菌株的分离和产β-苯乙醇酵母菌株筛选
无菌条件下，取适量高温堆积酒醅加入到含100 mL 无菌水锥形瓶中，30 ℃、200 r/min培养30 min。取不同稀释梯度涂布于PDA培养基平板，培养2 d，观察菌株形态。将分离菌株30 ℃、200 r/min培养15 h，以1%接种量接入转化培养基，培养至葡萄糖完全耗尽结束发酵。发酵液于12 000 r/min离心10 min，取上清液，高效液相色谱法检测β-苯乙醇含量。
1.4.2 菌株的鉴定
形态观察：选取培养24 h菌株纯培养物，对其进行细胞观察和菌落形态观察。
分子生物学鉴定：使用试剂盒提取酵母菌基因组，以基因组DNA为模板进行ITS序列扩增，所用引物为通用引物ITS1(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)，ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反应体系、基因测序及序列比对分析和系统发育树构建方法均参考文献[18]。
1.4.3 菌株对苯乙醇、乙醇和NaCl耐受性的检测
采用平板划线法考察菌株耐受性。β-苯乙醇添加质量浓度为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g/L；乙醇添加体积分数为2%、4%、6%、8%、10%；NaCl添加质量分数为5%、10%、15%、20%、25%。
1.4.4 菌株的最适生长初始pH值和温度
将菌液按1%的接种量转接至pH值为1～10的100 mL YPD液体培养基，培养48 h，每隔12 h测量吸光值OD600。温度设置为20、25、30、35、40 ℃培养48 h，同样每隔12 h测量吸光值OD600。
1.4.5 β-苯乙醇合成优化试验
依次考察碳源种类(麦芽糖、葡萄糖、蔗糖)及质量浓度(20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 g/L)、氮源种类(酵母提取物、蛋白胨)及质量浓度(3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 g/L)、L-Phe(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L)对菌株发酵合成β-苯乙醇的影响。
1.4.6 菌株的产香试验
将菌株接种于YPD液体培养基活化15 h，按1%的接种量接种50 mL优化培养基培养24 h。发酵液离心，取上清液[18]，采用同时蒸馏萃取法萃取香气成分，GC-MS法检测发酵液挥发性成分。
1.4.7 高效液相色谱法测定β-苯乙醇含量
采用0.22 μm水系滤膜过滤发酵上清液，HPLC测定β-苯乙醇含量。操作参数：色谱柱ZORBAX Eclipse Plus C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为V(甲醇)∶V(水)=1∶1；流速0.3～0.5 mL/min梯度上升；检测波长260 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL[5,18]。
1.4.8 同时蒸馏萃取法和GC-MS分析条件
发酵液离心，取5 mL上清液利用同时蒸馏萃取装置浓缩至1.0 mL，有机滤膜过滤后转入1.5 mL色谱瓶，待GC-MS上样。GC-MS条件参数：毛细管色谱柱DB-FFAP(60 m×250 μm×0.25 μm)；手动进样，分流比为10∶1，进样口温度250 ℃；程序升温50 ℃，保留2 min，以8 ℃/min 的速率升至120 ℃，保留2 min；再以10 ℃/min升至200 ℃，稳定5 min；最后以5 ℃/min升至250 ℃，稳定20 min；检测器温度250 ℃；载气为He，流速1 mL/min；电子轰击电离(electron impact ionization，EI)源，电子能量70 eV；扫描范围10～500 u；离子源温度250 ℃；接口温度250 ℃[19]。
2 结果与分析
2.1 β-苯乙醇合成酵母筛选
通过梯度稀释结合平板涂布法[18]从酒醅中分离出8株菌株，经菌落形态和显微观察，8株酵母都具有典型的酵母菌特征，初步判定这些菌株为酵母菌，分别编号为Z01，Z02，Z03，Z04，Z05，Z06，Z07和Z08。将转接转化培养基培养24 h，考察其转化能力，结果如图1所示。其中，酵母菌株Z08合成β-苯乙醇能力最强，含量达到(2.01±0.043)g/L，因此后续选用酵母Z08进一步试验。
图1 不同酵母菌株发酵液中β-苯乙醇含量
Fig.1 β-phenylethanol concentration in fermentation broth of different yeast strains
2.2 酵母Z08的鉴定
2.2.1 形态学鉴定
菌株Z08其平板菌落和细胞形态特征见图2。由图2可以看出，菌落呈现乳黄色，表面光滑，黏稠，边缘整齐(图2-a)；菌体为长椭圆形，无菌丝体，具有酵母菌株特征(图2-b)。
a-菌株Z08菌落形态特征；b-菌株Z08细胞形态特征
图2 菌株Z08在YPD培养基上菌落形态特征及光学 显微镜(10×100倍)下细胞形态特征
Fig.2 Strain Z08 colony morphology characteristics on YPD medium and cell morphology characteristics under optical microscope (10×100 times)
2.2.2 分子生物学鉴定
通过PCR成功扩增出酵母Z08的ITS1～ITS4片段，测序后获得基因序列，将其于Genebank数据库进行BLAST比对，结果表明该菌与库德里阿兹威(氏)毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)的同源性最高，其相似度达到90%。使用MEGA X构建菌株间系统发育树(图3)，结果表明酵母Z08与库德里阿兹威(氏)毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)的亲缘关系最近。根据分子生物学鉴定菌株Z08属于库德里阿兹威(氏)毕赤酵母。
图3 基于ITS基因序列的Z08菌株系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree of Z08 strain based on ITS gene sequence
2.3 菌株耐受性测定
按照方法1.4.3分别考察菌株Z08对β-苯乙醇、乙醇、NaCl的耐受特性，结果如表1所示，当β-苯乙醇质量浓度为4.0 g/L时，该菌生长受到抑制；当质量浓度达到6.0 g/L时，菌株完全不能生长。该菌对乙醇最大耐受体积分数为10%，属于乙醇高耐受性菌株；而其对NaCl的最大耐受质量分数高达5%，也具有一定的耐高渗能力。
表1 酵母菌株Z08耐受性试验结果
Table 1 Yeast strain Z08 tolerance test results
耐受性结果 β-苯乙醇质量浓度/(g·L-1)246810生长状况++---乙醇体积分数/%246810生长状况+++++NaCl质量分数/%510152025生长状况+----
注：“+”表示菌株生长；“-”表示菌株不生长
2.4 最适生长pH值和温度
按照方法1.4.4分别考察菌株的最适生长pH和最适生长温度。如图4-a所示，酵母Z08在pH 1～10均能生长，pH适应范围广，具有一定酸碱耐受能力。该菌最适生长pH为6～8，比一般酵母最适生长pH 4.0～5.5高。从图4-b可以看出，酵母Z08最适生长温度为30 ℃，与大多数酵母生长最适生长温度相一致。
a-酵母菌株Z08的最适生长pH；b-酵母菌株Z08的最适生长温度
图4 酵母菌株Z08的最适生长pH和温度
Fig.4 Optimal growth pH and temperature of yeast strain Z08
2.5 酵母Z08优化合成β-苯乙醇
2.5.1 碳源种类对生物转化β-苯乙醇的影响
按照方法1.4.5考察碳源对β-苯乙醇合成的影响。根据酵母菌同化碳源试验文献，选用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖为碳源，质量浓度均为50.0 g/L，L-Phe添加量为6.0 g/L，其余成分均与转化培养基相同，发酵结果如表2所示，Z08基本无法利用蔗糖和麦芽糖生产β-苯乙醇，但可以利用葡萄糖高效合成β-苯乙醇。
表2 不同碳源对转化合成β-苯乙醇的影响
Table 2 The influence of different carbon sources on the conversion and synthesis of β-phenylethanol
碳源β-苯乙醇/(g·L-1)蔗糖0.20±0.019葡萄糖2.69±0.026麦芽糖0.22±0.021
在上述结果基础上，在转化培养基中添加20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 g/L的葡萄糖，考察不同葡萄糖浓度对β-苯乙醇合成水平的影响，结果如图5所示。葡萄糖质量浓度为20.0～60.0 g/L时，随着葡萄糖浓度的增加，β-苯乙醇产量也在增加。当葡萄糖质量浓度为60 g/L时β-苯乙醇产量达到最高值(2.78±0.049)g/L，而当葡萄糖质量浓度增加到80.0、100.0 g/L时，β-苯乙醇产量大幅下降。
图5 不同浓度葡萄糖对转化合成β-苯乙醇的影响
Fig.5 The effect of different concentrations of glucose on the conversion and synthesis of β-phenylethanol
2.5.2 氮源对生物转化β-苯乙醇的影响
按照方法1.4.5考察碳源对β-苯乙醇合成的影响。根据酵母菌文献报道，选择酵母提取物和蛋白胨，质量浓度为10 g/L，在培养基中添加6.0 g/L L-Phe，发酵结果如表3所示，酵母提取物作为氮源时，β-苯乙醇产量比蛋白胨高1.53倍。
表3 不同氮源对转化合成β-苯乙醇的影响
Table 3 Effects of different nitrogen sources on the conversion and synthesis of β-phenylethanol
氮源添加量/(g·L-1)β-苯乙醇/(g·L-1)无 00.68±0.017酵母提取物102.53±0.033蛋白胨 101.00±0.026
在上述结果基础上，于转化培养基中添加3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 g/L酵母提取物，考察不同酵母提取物浓度对β-苯乙醇合成水平的影响，结果如图6所示。酵母提取物在0～7.0 g/L时，β-苯乙醇产量增加较明显，当酵母提取物质量浓度超过7.0 g/L后，β-苯乙醇产量虽然在增加，但幅度不大。
图6 酵母提取物浓度对β-苯乙醇转化合成的影响
Fig.6 Effect of yeast extract concentration on the conversion and synthesis of β-phenylethanol
2.5.3 L-Phe对生物转化β-苯乙醇的影响
酵母合成β-苯乙醇主要是通过艾氏途径，消耗底物L-Phe，将其转化为β-苯乙醇。按照方法1.4.5考察不同L-Phe浓度对β-苯乙醇合成的影响，结果如图7所示。在L-Phe质量浓度为0～4.0 g/L时，随着底物的增加，β-苯乙醇合成水平不断增加，当底物质量浓度超过4.0 g/L后，β-苯乙醇合成水平开始下降。
图7 不同浓度L-Phe对转化合成β-苯乙醇的影响
Fig.7 The effect of different concentrations of L-Phe on the conversion and synthesis of β-phenylethanol
2.5.4 培养基主要成分的正交试验
通过单因素优化试验初步确定酵母菌Z08合成β-苯乙醇主要影响因子为酵母抽提物、葡萄糖、L-Phe和pH，磷酸二氢钾和无水硫酸镁由于单因素试验不能综合反应各因素、水平间的交互作用，因此在单因素试验结果的基础上，即2.0 g/L的磷酸二氢钾和0.5 g/L的无水硫酸镁的条件下，采用正交试验对培养基进行优化，实验设计见表4。
正交试验结果表明，最佳转化培养基成分为葡萄糖50.0 g/L，酵母提取物12.0 g/L，L-Phe 5.0 g/L，pH 6.0，可见酵母提取物对酵母细胞Z08合成β-苯乙醇有显著影响。
2.5.5 不同发酵时间对β-苯乙醇产量的影响
由于β-苯乙醇具有一定的挥发性，因此合适的发酵时间对β-苯乙醇合成也有一定影响。在上文确定最优培养基条件下，测定不同发酵时间β-苯乙醇含量，结果如图8所示。发酵38 h时达到最高产量(3.74±0.084)g/L，随后产量逐渐下降，并且菌体密度不断降低，因此确定38 h为最佳发酵时间。
表4 正交试验设计与结果分析
Table 4 Result analysis and design of orthogonal experiment
试验号葡萄糖/(g·L-1)酵母提取物/(g·L-1)L-Phe/(g·L-1)pHβ-苯乙醇/(g·L-1)1508362.51±0.06625010472.56±0.07335012583.18±0.0684608482.77±0.05956010562.86±0.06166012372.57±0.0527708572.31±0.07687010382.46±0.06597012463.01±0.081K12.752.532.512.79K22.732.632.782.48K32.592.922.7832.80R0.060.130.090.10最优501256
2.6 酵母Z08发酵产香特性
将菌株酵母Z08接种于优化培养基培养72 h。发酵液取10 mL，离心除去菌体，取上清液与二氯甲烷等体积混合后进行蒸馏收集馏分。采用GC-MS对馏分进行挥发性香味成分进行分析，各成分含量检测结果如表5所示，在发酵产物挥发性成分中，醇类化合物相对含量最高，达到了55.38%，其中苯乙醇相对含量达到了55.32%。其次是芳香族化合物，相对含量为16.17%，以2,4-二甲基苯并[H]喹啉为主，其相对含量为4.42%。酯类化合物相对含量为14.35%，以乙酸苯乙酯为主，其相对含量为8.91%。酮类化合物相对含量为10.71%，其中以2-乙基吖啶为主，相对含量为5.47%。酸类物质相对含量为0.78%，醛类物质相对含量为0.16%，还有一些其他的烷烃类和杂环类和未测定出的化合物，总相对含量为2.45%。
图8 不同发酵时间对β-苯乙醇产量的影响
Fig.8 The effect of different conversion times on the yield of β-phenylethanol
表5 酵母Z08发酵液中挥发性成分检测结果
Table 5 Test results of volatile components in yeast Z08 fermentation broth
序号保留时间/min化合物分子式分子质量相对含量/%116.251苯乙醇C8H10O122.16455.32218.9924-苯基丁醛C10H12O148.2020.16319.021 42-苯乙基-环己烷-1,3-二酮C14H16O2216.27610.64419.368 4乙酸苯乙酯C10H12O2164.2018.91519.421 4甲酸-2-苯乙酯C9H10O2150.1742.57620.039乙酰乙酸2-苯乙酯C12H14O3206.2382.24721.415 35-苯基-1-戊烯C11H14146.2290.09822.297 62-甲基苯甲醇C8H10O122.1640.06923.591 72,4-二甲基苯并[H]喹啉C15H13N207.274.751023.744 61,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11,13,13,15,15-十六甲基八硅氧烷C16H50O7Si8579.2481.751127.556 12-[(2-硝基苯基)甲亚基氨基]胍C8H9 N5O2207.1890.101228.679 6N-(4,7-二氧-4,7-二氢-2,1,3-苯并恶二唑-5-基)乙酰胺C8H5 N3O4207.1450.111329.985 42-氯喹林-4-羧酸C10H6ClNO2207.6130.781430.338 36-硝基-2,3-二羟基喹喔啉C8H5 N3O4207.1430.021530.420 62-乙基吖啶C15H13N207.275.471630.708 95-甲基-2-苯基吲哚C15H13N207.271.371731.061 84-[(E)-2-硝基丙基-1-烯基]-1,3-苯并二唑C10H9 NO4207.1830.041833.338 13,4-亚甲二氧基-1-苯基-2-硝基丙烯C10H9 NO4207.1830.101934.226 32-(乙酰氧基甲基)-3-(甲氧基羰基)联苯C17H14O4282.2960.602034.355 72-丁基-4,5,6,7-四氢-1 h-异吲哚-1,3(2H)二酮不明确不明确0.072135.473 3bis(三甲基硅烷基)硅酸乙酯C10H28O4Si3296.5830.632235.914 43,5-二叔丁基邻苯二酚C14H22O2222.3230.302335.955 61,2-双(三甲基硅烷基)苯C12H22Si2222.4741.532436.014 44-氯-2-(三氟甲基)苯并[H]喹啉C14H7ClF3 N281.660.442536.149 7β,β-二苯丙烯酮缩氨基脲C22H19N3O341.4120.282643.366 82,2′-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)C23H32O2340.4991.65
3 讨论
目前国内外发酵生产β-苯乙醇菌种以酵母菌为主，如产朊假丝酵母(Candida utilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和克鲁维酵母(Kluyveromyces sinensis)等[20]。本文针对贾湖堆积酒醅中的酵母进行分离、筛选，从中获得1株产β-苯乙醇的酵母菌株。通过对其进行形态和分子生物学鉴定，发现该酵母Z08为库德里阿兹威(氏)毕赤酵母。库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriarzerii)存在于各种天然发酵、果实和土壤中，能够较好地适应各种环境压力，如低氧、低pH值、高温、高乙醇浓度等等。在传统食品和饮料的发酵过程中容易分离得到，如白酒、可可豆发酵、葡萄酒、发酵乳等。通过考察Z08对β-苯乙醇、乙醇、NaCl的耐受性，发现其具有较好的乙醇和耐高渗特性。同时验证了该菌在不同温度和pH条件下生长情况，确定该菌株具有较宽泛pH生长范围。通过单因素和正交试验最终确定了该菌株最适发酵条件为葡萄糖50 g/L、酵母提取物12.0 g/L、L-Phe 5.0 g/L、磷酸二氢钾2.0 g/L和无水硫酸镁0.5 g/L。在温度30 ℃，pH 6.0，200 r/min条件下发酵38 h后，β-苯乙醇产量最终达到(3.74±0.084)g/L，比优化前大幅提升。产香试验结果表明，苯乙醇、芳香族化合物、乙酸苯乙酯等香味物质含量较高。在产香成分中，苯乙醇、乙酸苯乙酯、2-苯乙基-环己烷-1,3-二酮等多种风味物质对白酒品质有重要贡献，说明该菌株产香特性有利于其在白酒酿造中的进一步应用，对提升白酒品质有重要意义。此外，库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriarzerii)还具有作为益生菌和生物控制剂的潜力，同时该菌也在生物乙醇、甘油和琥珀酸生产等方面发挥重要作用[21]。
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