γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，是中枢神经系统中重要的抑制性神经传导物质，主要存在于脑和骨髓中[1]。GABA是由谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase, GAD)不可逆催化L-谷氨酸(L-glutamic acid, L-Glu)生成的[2]。GABA具有多种生理功能，能够改善睡眠和治疗抑郁[3]、增强免疫力[4]、降低血压[5]、提高视觉皮层功能[6]、抵制肥胖[7]、减轻焦虑和更年期综合症[8]以及治疗癫痫病[9]等。
目前制备GABA的方法有化学合成法、植物富集法、微生物发酵法及全细胞转化法等。利用化学合成法生产GABA安全性较差，有化学残留，不易达到医药及食品行业的标准[10]；植物富集法虽然安全性好，但制得的GABA浓度太低，无法用作医药、食品添加剂[11]；微生物发酵法具有成本低的优点，但得到的GABA是一个多相的复杂体系，浓度低，下游分离成本高，是生产高纯度、高浓度GABA的一个瓶颈问题；全细胞转化法则克服了微生物发酵法分离提纯困难的缺点，具有产品浓度高、成本低等优点。
乳酸菌已广泛用于食品行业，被公认为是安全的(General Recognized As Safe, GRAS)食品级微生物[8]。中国国家卫生健康委员会已批准短乳杆菌(Lactobacillus brevis)与希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)发酵制备的GABA为新食品原料。CATALDO等[12]采用Lactobacillus brevis CRL 2013制备GABA，产量达到265 mmol/L(27.3 g/L)；LYU等[13]采用Lactobacillus brevis 9530工程菌发酵制备GABA，最高产量达到104.38 g/L。孙丽慧等[14]以Lactobacillus brevis DLF-19076为发酵菌株，采用全细胞催化工艺使得GABA产量达到85.71 g/L，摩尔转化率为87.84%。本研究采用短乳杆菌GLB-127发酵制备GAD，利用短乳杆菌全细胞催化L-Glu制备GABA。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌种
短乳杆菌(Lactobacillus brevis)GLB-127，革兰氏阳性菌，为本实验室筛选保存。
1.1.2 培养基
种子培养基(g/L):葡萄糖20.0(单独灭菌)，蛋白胨10.0，牛肉浸粉8.0，酵母浸粉4.0，K2HPO4 2.0，柠檬酸氢二铵2.0，乙酸钠5.0，MgSO4 0.2，MnSO4 0.04，吐温-80 1.0。pH 5.6，121 ℃灭菌15 min。
初始发酵培养基(g/L):葡萄糖20.0(单独灭菌)，蛋白胨10.0，牛肉浸粉8.0，酵母浸粉4.0，L-谷氨酸钠10.0，K2HPO4 2.0，柠檬酸氢二铵2.0，乙酸钠5.0，MgSO4 0.2，MnSO4 0.04，吐温-80 1.0。pH 5.6，121 ℃灭菌15 min。
优化后发酵培养基(g/L)[15-16]:葡萄糖20.0(单独灭菌)，蛋白胨10.0，玉米浆干粉15.0，牛肉浸粉8.0，酵母浸粉4.0，L-谷氨酸钠25.0，K2HPO4 2.0，柠檬酸氢二铵2.0，乙酸钠5.0，MgSO4 1.0，MnSO4 0.04，吐温-80 1.0。pH 5.6，121 ℃灭菌15 min。
1.2 实验方法
1.2.1 短乳杆菌的分子鉴定
1.2.1.1 基因组DNA的提取[17]
将原始菌接种于液体培养基扩大培养后利用TIANGEN DNA KIT提取原始菌基因组DNA。
1.2.1.2 PCR扩增
吸入适量基因组DNA，Taq酶，dNTPs及16S引物进行PCR扩增实验。引物序列为：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-TACGGCTACCTTGTACGACTT-3′。引物由通用生物合成。
1.2.1.3 PCR产物电泳检测及测序
待PCR扩增反应完毕后，进行1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。使用Axygen凝胶回收试剂盒回收所需PCR产物片段，采用3730XL测序仪进行测序实验。
1.2.2 扫描电镜制样方法
采用德国蔡司公司的热场发射扫描电子显微镜观察菌体形态特征。将短乳杆菌湿菌体用2.5%戊二醛在4 ℃固定4 h。然后用磷酸盐缓冲液洗涤菌体2遍。最后采用乙醇梯度脱水，喷金观测[18]。
1.2.3 系统发育树构建
将测序所得16S rDNA序列在NCBI数据库中进行BLAST，根据序列同源性，选取不同模式菌株，采用MEGA-X构建系统发育树，确定菌株种属关系[19]。
1.2.4 培养方法
1.2.4.1 静置培养
将种子液以5%的接种量转接发酵摇瓶，将发酵摇瓶在30 ℃培养箱中静置培养48 h。
1.2.4.2 摇床培养
将种子液以5%的接种量转接发酵摇瓶，将发酵摇瓶在30 ℃摇床中以不同转速培养一定时间。
1.2.4.3 发酵罐培养
采用上海保兴BIOTECH-10BGZ发酵罐进行放大实验，碳源为葡萄糖，氮源为氨水，补料碳源与氮源根据pH变化由蠕动泵自动补入。
1.2.5 全细胞转化方法
初始转化体系组成为70.0 g/L的L-Glu，4.9 g/L MgSO4，1.0 g/L磷酸吡哆醛，全细胞催化酶质量浓度为25.0 g/L。
1.2.6 检测方法
1.2.6.1 菌体浓度[16]
取一定量的发酵液用纯化水稀释一定的倍数，用UV-1200分光光度计在600 nm下测定吸光值，计算得OD600。取一定体积发酵液离心去上清液称量，计算得菌体湿重。
1.2.6.2 GABA与L-Glu
采用岛津LC-20ADXR高效液相色谱仪测定，色谱柱为Inertsil ODS-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；检测波长为210 nm；流动相为0.1%高氯酸与乙腈以体积比9∶1混合，pH 3.0；柱温30 ℃；进样量20 μL；分析时间为12 min。GABA与L-Glu混合标准品液相色谱检测图见图1。
图1 GABA与L-Glu混合标准品HPLC检测图
Fig.1 HPLC chromatogram of GABA and L-Glu standard substance
1.2.6.3 酶活力测定
配制pH为4.4的0.2 mol/L醋酸钠溶液。用其配制50.0 g/L的L-谷氨酸钠、5.0 g/L MgSO4、1.0 g/L磷酸吡哆醛混合反应液。加入湿菌体于55 ℃条件下水浴反应30 min，离心取上清液用HPLC检测GABA，计算酶活力。
2 结果与分析
2.1 16S rDNA序列分析法鉴定短乳杆菌
图2为短乳杆菌GLB-127菌株16S rDNA扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，可以看到菌株在1 500 bp处有一荧光条带，并且没有拖尾现象，满足测序的要求。将菌株16S rDNA测序后，得到测序结果，序列长度为1 461 bp。将所得序列在NCBI进行BLAST相似性比对，与Lactobacillus brevis 2651相似度最高，达99.86%，确定其为短乳杆菌。
1-GLB-127 PCR扩增产物;M-Marker
图2 短乳杆菌GLB-127 16S rDNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
Fig.2 Agarose gel electrophoresis pattern of 16S rDNA amplified from L.brevis GLB-127
2.2 短乳杆菌GLB-127扫描电镜观察
通过扫描电子显微镜可以看到(图3)，短乳杆菌呈短杆状，表面光滑粗壮，无杂菌污染，菌体长度1～2 μm，宽度约0.6 μm。
图3 短乳杆菌GLB-127扫描电镜形态图
Fig.3 Scanning electron microscope image of L.brevis GLB-127
2.3 短乳杆菌系统分类
菌株Lactobacillus brevis GLB-127经16S rDNA基因序列分析鉴定为短乳杆菌，短乳杆菌属于厚壁菌门芽孢杆菌纲里的乳杆菌目乳杆菌科乳杆菌属[20]。采用MEGA-X软件构建该菌的系统发育树(图4)。从系统发育树可以看出L.brevis GLB-127与L.brevis 2560及L.brevis 2651亲缘关系最近，为属内同种。
图4 短乳杆菌GLB-127 16 s rDNA序列系统发育树
Fig.4 Phylogenetic tree of L.brevis GLB-127 based on its 16S rDNA sequences
2.4 发酵培养条件优化
2.4.1 培养转速优化
转速优化实验分4组进行，对比4种不同转速培养条件下OD600及酶活力的差别(图5)。随着转速的不断提高，菌体生物量不断增加，这是因为转速的增加有利于菌体的供氧，促进了菌体的生长。在150 r/min培养条件下，短乳杆菌OD600达到了7.05，超过了静止发酵时的3.45，但是GAD活性却是在静置时最高，为191.1 U/g菌体湿重，是50 r/min培养条件下的2.8倍，这与短乳杆菌为厌氧菌相吻合。高转速有利于菌体的生长，却不利于GAD的表达，所以后续实验选择静置培养。
图5 转速对酶活力及生物量的影响
Fig.5 Effect of rotation speed on enzyme activity and biomass
2.4.2 培养温度优化
随后又考察了诱导培养温度对OD600及酶活力的影响(图6)。培养温度控制在37 ℃菌体生物量最高，OD600为4.21，比25 ℃培养条件下高出63.2%；培养温度控制在30 ℃时GAD酶活力最高，达到了200.1 U/g菌体湿重，比37 ℃条件下高出25.6%。这是因为酶蛋白生成速率与酶蛋白空间结构的形成存在关系，低温放缓了蛋白质的生成速率，利于形成酶蛋白正确的空间构象，但过低的温度不利于生物量的积累，综合考虑诱导培养温度控制在30 ℃最合适[21]。
图6 诱导培养温度对酶活力及生物量的影响
Fig.6 Effect of culture temperature on
enzyme activity and biomass
2.5 转化条件优化
2.5.1 转化温度的优化
发酵培养条件确定后，对转化温度进行了优化(图7)。在45 ℃条件下进行转化效果最好，GABA为66.4 g/L，比37 ℃高出33.9%，这是因为温度升高，有利于酶促反应速度的提升；与45 ℃相比，在50 ℃转化条件下，GABA降低了21.2%，这是因为过高的温度影响了全细胞催化酶的半衰期，使GAD快速失活，不利于GABA产量的积累[22]。
图7 温度对转化效果的影响
Fig.7 Effect of temperature on the conversion rate
2.5.2 全细胞催化酶加量优化
随后对转化体系中全细胞催化酶添加量进行了优化(图8)，随着全细胞催化酶用量增加，反应速率大大加快，转化体系中不溶的L-Glu消失，经补加L-Glu，当全细胞用量为75 g/L时，GABA达到160.5 g/L，比全细胞用量为50 g/L时高出38.9%。当全细胞催化酶加量超过75 g/L时，GABA不再增加，说明此时GAD活性位点已经全部被底物L-Glu占据，过量的酶无益于产量的继续增加[23]，考虑到工业化生产的实际需求，为节约成本，全细胞菌体选取75 g/L的添加量。
图8 全细胞催化酶加量对转化效果的影响
Fig.8 Effect of whole cell catalytic enzyme amount on conversion rate
2.6 发酵培养基优化
为进一步提高GABA产量，满足工业化生产要求，特进行培养基优化实验。实验分为2组进行，分别采用1.1.2中初始发酵培养基与优化后发酵培养基进行摇瓶发酵实验。由表1可知，培养基经过优化，GABA得到了提升，达到了240.6 g/L，产量比初始培养基提高了55.3%，转化率达98.1%。
表1 发酵培养基优化实验
Table 1 Optimization of fermentation medium
实验组ρ(L-Glu)/(g·L-1)菌体OD600ρ(GABA)/(g·L-1)转化率/%初始培养基3503.36154.963.2优化培养基3504.62240.698.1
2.7 发酵罐放大实验
2.7.1 发酵实验
根据摇瓶实验进行了10 L发酵罐放大实验，发酵罐底料量按照6 L称量，加入5 L纯化水溶解。种子液OD600为2.4，镜检短杆无杂菌。发酵培养过程中，用氨水控制发酵液pH为6.6，搅拌转速0 r/min。流加500 g/L葡萄糖使发酵液初始碳源为50 g/L，3 h后继续流加葡萄糖，共计1 000 mL，氨水共补入115 mL，发酵时间为48 h[24]。放罐时菌体OD600为7.9，酶活力为315.9 U/g菌体湿重。
2.7.2 转化实验
发酵结束后，将2.7.1中离心所得菌体按照湿重75 g/L的添加量加入转化液中，然后再加入500 g/L的L-Glu，其余成分的添加量见1.2.5。温度控制在45 ℃，pH用磷酸控制在4.6。转化液HPLC色谱图如图9所示，转化结束后，经HPLC检测转化液中GABA为345.1 g/L，转化率为98.5%。将转化液离心后收集全细胞菌体，可加入新的转化体系中继续转化L-Glu生产GABA，收集离心上清液用于后续的提取纯化。
图9 转化液HPLC检测色谱图
Fig.9 HPLC chromatogram of conversion liquid
3 结论
本研究以短乳杆菌发酵表达GAD制备GABA，经扫描电子显微镜与分子生物学鉴定所用微生物为短乳杆菌，系统分类为乳杆菌属的一种。通过发酵培养条件的优化，确定了短乳杆菌GLB-127在30 ℃条件下静置培养所产GAD活性最高，达到了200.1 U/g菌体湿重。进一步对转化条件及发酵培养基进行优化，确定了转化体系的最适反应温度为45 ℃，全细胞最佳用量为75 g/L；在MRS培养基基础上添加15 g/L玉米浆干粉及1.0 g/L MgSO4，使得摇瓶中GABA达到了240.6 g/L，比初始培养基提高了55.3%。最后在10 L发酵罐成功放大，GAD活性较摇瓶发酵有了明显提升，达到了315.9 U/g，GABA达345.1 g/L，转化率为98.5%。该研究大幅度提高了短乳杆菌发酵制备的新食品原料GABA产量，对其产业化具有重要的指导作用。
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