利用霉菌、酵母菌、细菌以及藻类等富油微生物积累脂肪酸油脂是发展生物能源的重要方向[1]。而且，微生物脂肪酸富含多不饱和脂肪酸，具有营养保健功能[2-3]。例如，二十碳五烯酸可预防心血管等多种疾病[4]；γ-亚麻酸作为化妆品成分可延缓衰老[5]。因此，利用富油微生物积累油脂的研究已是近年来的热点[6-7]。深黄伞形霉是一种著名的富油微生物，其油脂含量可高达86%[8]。深黄伞形霉在积累脂肪酸油脂方面受到广泛关注[9-10]。GAO等[11]通过硅酸镁颗粒调控深黄伞形霉形态结构，也影响油脂分布，游离分散菌丝体的油脂含量较高。MEEUWSE等[12]建立了深黄伞形霉在液态培养时的生长和油脂积累模型，深黄伞形霉在碳源和氮源充足时为指数生长期，氮源耗尽时有利于油脂积累。但是，李卓婷等[13]研究表明发酵初期加入氮源有利于深黄伞形霉生长和油脂积累。且添加Fe3+、酵母提取液或Mg2+不仅能进一步促进油脂积累[14]，还能降低深黄伞形霉在葡萄糖耗尽时油脂被降解的速度。金属离子会影响菌体内酶的活性[15]，从而影响油脂合成途径和积累。麸皮是一种富含淀粉、纤维素、半纤维素、蛋白质等组分的生物质资源[13]，其中淀粉、纤维素等糖类组分占比超过50%[14]。麸皮比秸秆等生物质更易被利用。麸皮已经被应用于微生物生产乳酸[15]、乙醇[16]等物质。麸皮水解液已经被成功用于培养深黄伞形霉，积累油脂达9.87 g/L，菌体中油脂含量(质量分数)为39.35%。总糖利用率为69.40%，残余糖中84.3%为多聚糖[16]。本研究探讨氮源和金属离子对深黄伞形霉利用麸皮水解液积累油脂的影响，为进一步利用麸皮和油脂奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
小麦麸皮水解液根据文献[16]制备。化学试剂购买自国药化学试剂有限公司。
仪器：Waters 1525高效液相色谱系统、Athena C18色谱柱，Waters公司；7890A气质联用仪，Agilent Technologies公司；ML104/02分析天平，梅特勒公司；HVE-50高压灭菌锅，日本Hirayama公司；TDL-5-A离心机，上海安亭科学仪器厂。
1.2 添加氮源对深黄伞形霉积累油脂的影响
为初步比较添加氮源对深黄伞形霉积累油脂的影响，首先向麸皮水解液加入PBS(pH 4.6)至10 mmol/L。250 mL摇瓶中装100 mL麸皮水解液，分别添加1 g/L氮元素相当质量的硫酸铵、尿素、柠檬酸铵、醋酸铵后，接种孢子至终浓度为2×106 CFU/mL，27 ℃，160 r/min培养5 d后测定生物量、油脂产量、残糖浓度。根据实验结果研究不同浓度的2种氮源对深黄伞形霉积累油脂的影响。向麸皮水解液加入PBS(pH 4.6)至10 mmol/L，250 mL摇瓶中装100 mL麸皮水解液，分别添加相当于0.5、1.0、1.5、3.0 g/L氮元素的硫酸铵，相当于0.5、1.0、1.5、3.0 g/L氮元素的乙酸铵后，接种孢子至终浓度为2×106 CFU/mL，27 ℃，160 r/min培养5 d后测定生物量、油脂产量、残糖浓度。
1.3 不同金属离子对深黄伞形霉积累油脂的影响
向麸皮水解液加入PBS(pH 4.6)至10 mmol/L。250 mL摇瓶中装100 mL麸皮水解液分别添加CaCl2至质量浓度依次为0.2、0.5、1.0、1.5 g/L；添加MgSO4至质量浓度依次为0.5、1.0、1.5、2.0 g/L；添加ZnSO4至质量浓度依次为0.3、0.5、0.7、1.0 mg/L，添加MnSO4至质量浓度依次为4.0、8.0、12.0、16.0 μg/L，接种孢子至终浓度为2×106 CFU/mL，27 ℃，160 r/min培养5 d后测定生物量、油脂产量、残糖浓度。
1.4 残糖浓度的测定
吸取适当稀释后的发酵液1 mL，与1 mL苯酚溶液(体积分数5%)充分混合，加入5 mL浓硫酸，立即摇匀，室温放置20 min后在470 nm测定吸光度值。根据以葡萄糖为标品的标准曲线计算总糖的含量。
1.5 生物量测定
滤纸在70 ℃烘箱烘干12 h并编号，称质量。将菌液用滤纸抽滤后在70 ℃烘干至质量恒定。带菌体的滤纸与滤纸之间的质量差为生物量。
1.6 油脂含量的测定
取烘干后深黄伞形霉菌体100 mg，加入10 mL配制好的氯仿：甲醇(体积比2∶1)有机溶剂，180 r/min振荡16 h。加入2.5 mL去离子水并摇匀1 min，再4 500 r/min离心10 min，取上层液体经0.45 μm滤膜过滤，经吹氮气去除氯仿，得到油脂后称质量。
1.7 脂肪酸组分的测定
取100 mg油脂与10 mL氯仿∶甲醇∶浓硫酸的混合物(体积比5∶4.25∶0.75)混合、摇匀，90 ℃水浴90 min后加入2.5 mL去离子水，振荡1 min，以4 500 r/min离心15 min。取上层液体与3 mL氯仿混合，振荡1 min，4 500 r/min离心15 min。将2次所得氯仿层混匀过滤用于GC-MS分析(Agilent 19091S-433)，毛细管色谱柱(HP-5MS，30 m×250 μm×0.25 μm)。升温程序为初始温度60 ℃，以15 ℃/min的速度升至180 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min的速度升至270 ℃，保持5 min。载气为1 mL/min氦气，压力56.75 kPa。进样量1 μL；分流比 10∶1。质谱部分电子轰击离子源的电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃。图谱采集方式为全扫描方式，质量扫描范围m/z为20～550。
2 结果与分析
2.1 不同氮源对深黄伞形霉利用麸皮水解液积累油脂的影响
如图1-a和图1-b所示，添加乙酸铵使深黄伞形霉的生物量和油脂含量分别由21.5 g/L和8.8 g/L 提高到25.8 g/L和10.0 g/L，促进了深黄伞形霉的生长和油脂产量。硫酸铵的添加对深黄伞形霉的生长和油脂产量的抑制不显著，但是柠檬酸铵和尿素的添加显著抑制深黄伞形霉在麸皮水解液的生长和油脂产量。这说明添加硫酸铵促进了深黄伞形霉的代谢，而添加柠檬酸铵和尿素则抑制了深黄伞形霉的代谢，这在图1-c的残糖质量浓度也得到证实。添加乙酸铵时的残糖量分别为14.1 g/L，明显低于对照组的24.7 g/L。添加柠檬酸铵和尿素时的残糖量分别为41.5 g/L和49.6 g/L，明显高于对照组。
a-生物量；b-油脂产量；c-残糖质量浓度
图1 氮源对深黄伞形霉利用麸皮水解液积累油脂的影响
Fig.1 Effects of nitrogen sources addition on lipid production of Umbelopsis isabellina
进一步探讨了乙酸铵和硫酸铵对深黄伞形霉生长和油脂积累的影响。当乙酸铵添加量为1.5 g/L(氮元素当量，下同)时，深黄伞形霉的生物量达到最大25.8 g/L(图2-a)。但是油脂产量在乙酸铵添加量为1 g/L为最佳，比对照组提高11%(图2-b)。油脂产量和生物量不同步，且添加不同量乙酸铵对残糖质量浓度影响不明显(图2-c)。
a-生物量；b-油脂产量；c-残糖质量浓度
图2 不同浓度乙酸铵对深黄伞形霉发酵的影响
Fig.2 Effects of different concentrations of ammonium acetate on U.isabellina fermentation
图3为添加不同浓度的硫酸铵对深黄伞形霉利用麸皮水解液生长和油脂积累的影响。深黄伞形霉的生物量在添加不同硫酸铵量时没有显著变化(图3-a)，油脂产量随硫酸铵添加量的增加呈现下降趋势(图3-b)。添加硫酸铵时残糖质量浓度比对照组显著降低。但是，残糖浓度在不同硫酸铵添加量时的差别也不显著(图3-c)。因此，在麸皮水解液中添加硫酸铵虽然能显著提高深黄伞形霉对碳源的代谢，但没有提高碳源到生物量和油脂的转化。
a-生物量；b-油脂产量；c-残糖质量浓度
图3 不同浓度硫酸铵对深黄伞形霉发酵的影响
Fig.3 Effects of different concentrations of ammonium sulfate on U.isabellina fermentation
乙酸铵提高深黄伞形霉生物量和油脂产量可能由于乙酸铵的乙酸根作为碳源补充，或者乙酸根通过反应(CH3COOH+CoASH+ATP→CH3CO-SCoA+H2O+AMP+PPi)活化成乙酰辅酶A，促进了三羧酸循环和氧化磷酸化。另外，乙酸辅酶A是合成脂肪酸的前体，因此添加乙酸铵促进脂肪酸积累[16]。
2.2 不同金属离子对深黄伞形霉利用麸皮水解液积累油脂的影响
由图4-a可知这4种金属离子对深黄伞形霉生物量的影响不明显。
a-Ca2+；b-Mg2+；c-Zn2+；d-Mn2+
图4 金属离子对深黄伞形霉生物量的影响
Fig.4 Effects of metal ions on the biomass of U.isabellina
图5-a、图5-b、图5-d显示不同浓度Ca2+、Mg2+、Mn2+时油脂产量呈现钟型趋势。油脂产量分别在添加0.5 g/L CaCl2、1 g/L MgSO4和4 μg/L MnSO4时有最大值，分别为13.8、16.4、33.7 g/L。但是，随着Zn2+浓度增加，虽然油脂产量呈现上升趋势，但仍低于对照组的油脂产量(图5-c)。
a-Ca2+；b-Mg2+；c-Zn2+；d-Mn2+
图5 金属离子对深黄伞形霉的油脂产量的影响
Fig.5 Effects of metal ions on lipid yield of U.isabellina
图6表明添加4种金属离子时的残糖浓度均低于对照组的残糖浓度，分别在1.0 g/L CaCl2、1.0 g/L MgSO4、0.5 mg/L ZnSO4和16 μg/L MnSO4时残糖浓度为对照组的62.8%、60.5%、78.9%、65.1%。这说明适当添加Ca2+、Mg2+和Mn2+促进深黄伞形霉的代谢。但是Zn2+的添加促进的糖代谢没有转化为油脂的积累。
a-Ca2+；b-Mg2+；c-Zn2+；d-Mn2+
图6 金属离子对深黄伞形霉利用碳源的影响
Fig.6 Effects of metal ions on carbon source utilization by U.isabellina
深黄伞形霉中油脂含量见图7。不同浓度Ca2+、Mg2+、Mn2+时油脂产量呈现钟型趋势，分别在0.5 g/L CaCl2、1.0 g/L MgSO4、8 μg/L MnSO4时有最高油脂含量，分别达到49%、62%、47%(图7-a、7-b、7-d)。但是，随着Zn2+浓度增加，虽然油脂含量呈现上升趋势，但仍低于对照组的油脂含量(图7-c)。
a-Ca2+；b-Mg2+；c-Zn2+；d-Mn2+
图7 金属离子对深黄伞形霉中油脂含量的影响
Fig.7 Effects of metal ions on lipid content of U.isabellina
2.3 深黄伞形霉油脂成分分析
深黄伞形霉的油脂采用GC-MS分析，然后对比质谱数据库进行化合物定性，再结合气相色谱实现定量分析。深黄伞形霉油脂主要含肉豆蔻酸(0.72%)、棕榈油酸、棕榈酸(22.10%)、γ-亚麻酸(4.50%)、亚油酸(8.67%)、油酸(44.48%)、硬脂酸(6.45%)、花生酸(0.64%)等。其中，单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸分别占47.45% 和13.61%。
3 讨论与结论
将麸皮水解后培养深黄伞形霉进行油脂积累有利于促进食品废弃物的高值化利用。深黄伞形霉能积累高含量的油脂。基于前期研究，本研究探讨添加氮源和金属离子提高深黄伞形霉利用麸皮水解液，积累油脂影响其代谢过程和油脂积累。结果表明当乙酸铵添加量为1.5 g/L(氮元素当量，下同)时，深黄伞形霉的生物量达到最大。乙酸铵添加量为1.0 g/L时，油脂产量达到最大较对照组提高11%，残糖利用率也提高了20.3%。添加Mg2+、Ca2+、Zn2+和Mn2+能显著影响深黄伞形霉发酵情况，其中，Mg2+、Ca2+和Mn2+促进深黄伞形霉代谢碳源，促进脂肪合成。添加0.5 g/L CaCl2、1.0 g/L MgSO4、8 μg/L MnSO4时油脂产量提高，脂肪酸分别达到13.8、10.26、12.91 g/L，分别提高了39.8%、65.8%、30.8%。金属离子对深黄伞形霉生长和积累油脂的影响主要因为金属离子对菌体内酶活性的调控，影响了其代谢过程和油脂积累[17]。表1总结了目前关于4种金属离子影响微生物的方式。例如，Mg2+是丙酮酸脱羧酶、丙酮酸激酶、己糖激酶、磷酸果糖激酶等的辅助因子，直接参与呼吸作用、糖酵解、氧化磷酸化等过程，具有重要调节作用。Ca2+促进ADP 磷酸化为ATP，增加细胞中能量的生成，提高生物量，激活α-酮戊二酸脱氢酶和丙酮酸脱氢酶，促进深黄伞形霉的油脂合成代谢[18]。低浓度Mn2+会增加酰基辅酶A合成酶和酰基激酶的活性，使流向脂肪合成途径的乙酰辅酶A增多，增加油脂积累[19]。
表1 金属离子对微生物代谢的影响
Table 1 Effects of metal ions on microbial metabolism
金属离子作用Mg2+增加生物量,促进油脂积累[20]Ca2+调节细胞膜通透性,控制细胞膜物质转运,增加线粒体膜电位,促进ATP生成,为菌体增殖提供能量[21]Mn2+在极低浓度下促进油脂积累[22]Zn2+促进糖酵解,调节细胞代谢[23]
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