阿克苏苹果以其独特的“冰糖心”而闻名，因其主要产区在新疆阿克苏地区而得名，属于蔷薇科(Rosaceae)苹果属(Malus)水果，是一种红富士苹果。阿克苏苹果品质、口感俱佳，主要是由于该地区昼夜温差大、无霜期长等气候因素导致，这种独特的自然条件使得苹果果核糖分堆积呈透明状[1]。其果肉中富含维生素、矿物质、类黄酮和多种微量元素等营养元素[2-3]。苹果是典型的呼吸跃变型果实，具有后熟现象，在成熟过程中会产生大量的乙烯[4]，同时，在采后运输及贮藏过程中，还会出现软化、失水皱缩、营养成分下降以及被病原微生物侵染等现象[5]，这些都会加速苹果的腐败变质，最终影响果实的品质，造成大量经济损失。
臭氧具有高效、易分解、无残留、绿色、抑菌和保鲜效果好等优点[6]。它能够降低乙烯的释放量，抑制呼吸作用，清除环境中的有害气体，抑制或杀灭多种微生物[7]。高聪聪等[8]发现臭氧可以有效延缓果实可滴定酸和硬度的下降，延缓葡萄的衰老进程，LIN等[9]发现了臭氧处理可以抑制香椿乙烯释放速率从而延长香椿的采后贮藏时间。罗文靖等[10]发现臭氧处理可以延缓库尔勒香梨褐变和硬度的下降，维持果实色彩饱和度，抑制呼吸作用，维持库尔勒香梨内在和外观品质。综合研究得出，臭氧在果蔬采后贮藏保鲜方面具有一定的积极效果。
因此本试验以阿克苏苹果为实验材料，采用不同臭氧浓度(0、2.14、10.7、19.26 mg/m3)处理阿克苏苹果，探究其对阿克苏苹果贮藏品质和酶活性的影响，以期找到适宜的臭氧处理浓度，为完善阿克苏苹果的采后贮藏保鲜技术提供一定的理论支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试所需阿克苏冰糖心苹果于2020年3月8日从天津市西青区红旗农贸批发市场采购，当日运往天津市农业科学院国家农产品保鲜工程技术研究中心(天津)，从中筛选出果肉新鲜饱满、充分成熟和未损伤的苹果作为试验试材。
1.2 主要试剂
聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、95%乙醇，天津市江天化工技术股份有限公司；冰乙酸、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、30% H2O2、无水醋酸钠，天津市风船化学试剂科技有限公司；聚乙二醇6 000、愈创木酚、NaOH、石英砂、酚酞指示剂，天津市光复精细化工研究所。以上试剂均为分析纯。
1.3 仪器与设备
H2500R高速冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司；TA.XT.Plus型质构仪，英国SMS公司；HH-2数显恒温水浴锅，常州天瑞仪器有限公司；FA1004 型电子天平，上海天平仪器厂；UV-1780紫外可见分光光度计，岛津仪器(苏州)有限公司；DL-1万用电炉，北京中兴伟业仪器有限公司；GC2010 气相色谱仪，日本岛津。
1.4 实验方法
1.4.1 试验分组处理
本试验共分为4组，每组80个，共计320个苹果。在臭氧浓度分别为0、2.14、10.7、19.26 mg/m3的条件下每隔7 d处理1次，每次1 h，贮藏38 d。贮藏温度为(0±0.5) ℃、相对湿度85%～90 %，在处理前进行生理指标初值的测定，之后每7 d随机取样测定生理指标，每个指标进行3次重复测定，然后取平均值。同时将每次处理后的苹果切成小块进行液氮快速冷冻，然后放入-80 ℃冰箱中进行冷冻保存，以供备用。
1.5 测定指标及方法
1.5.1 失重率的测定
采用重量法，单位以%计[11]。
1.5.2 硬度的测定
每次随机取样6个，用TA.XT.Plus型质构仪测定苹果中段硬度，选择P/2探头(Φ2 mm)进行穿刺测量，测定参数为：测前速率5.0 mm/s，测试速率2.0 mm/s，测后速率5.0 mm/s，穿刺深度10 mm。单位以“kg/cm2”表示，测值取平均，分析程序选用LSP-force[12]。
1.5.3 可滴定酸的测定
采用酸碱滴定法，结果以%表示，以0.067苹果酸折算系数计算[13]。
1.5.4 还原糖的测定
采用斐林试剂滴定法进行测定[14]。
1.5.5 乙烯释放速率的测定
每次随机选取6个苹果，测定3次作为平行。在贮藏温度条件下，将样品称重后在罐内密封静置3 h，使用注射器抽取20 mL罐内气体，用气相色谱仪程序升温法测定[15]。采用面积外标法计算乙烯释放速率。
1.5.6 过氧化物酶的测定
采用比色法，在波长470 nm处，以1 min吸光度变化值增加1时为1个过氧化物酶活性单位，结果以ΔOD470/(min·g)表示[13]。
1.5.7 多酚氧化酶的测定
采用比色法，在波长420 nm处，以1 min吸光度变化值增加1时为1个多酚氧化酶活性单位，结果以ΔOD420/(min·g)表示[13]。
1.6 数据分析
数据使用Excel 2016，SPSS 20.0进行统计和差异显著性分析，使用 Origin 2019对图形进行处理。
2 结果与分析
2.1 不同浓度臭氧处理对贮藏期阿克苏苹果乙烯释放速率的影响
乙烯是果蔬自身产生的一种内源性成熟激素，它能够影响核酸代谢、激素水平和呼吸速率等重要生理过程，催化果实成熟，加速果实衰老[16]。如图1所示，随着贮藏时间的延长，各处理组苹果的乙烯释放速率呈现先上升后下降的趋势，0、2.14、10.7、19.26 mg/m3处理组均在第24天时达到乙烯高峰，分别为0.195、0.176、0.155、0.138 μL/(kg·h)，其中19.26 mg/m3处理组乙烯高峰最低。在整个贮藏过程中19.26 mg/m3处理组乙烯释放率始终处于最低位置，与对照组差异明显(P<0.05)，表明臭氧处理可以降低乙烯释放速率，延缓果蔬衰老，且臭氧浓度越高效果越明显。研究发现，臭氧处理能够导致乙烯前体1-氨基-环丙烷羧酸降低，抑制乙烯合成途径中关键酶1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶和1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶活性[17]。
图1 臭氧处理对阿克苏苹果乙烯释放速率的影响
Fig.1 Effects of ozone treatment on ethylene release rate of Aksu apple
2.2 不同浓度臭氧处理对贮藏期阿克苏苹果失重率的影响
失重率是能够反映果蔬品质和商业价值的主要指标之一。贮藏过程中失重率改变的原因可能是由于果蔬的蒸腾作用和呼吸作用导致[18]。从图2可以看出，随着贮藏时间的延长，各处理组失重率呈现上升趋势，且处理组的失重率均低于对照组。在整个贮藏期，前10 d失重率上升较快，10 d后上升趋于缓慢，19.26 mg/m3处理组始终保持在较低水平，与对照组存在显著差异(P<0.05)。贮藏结束时，对照组的失重率与2.14 mg/m3臭氧处理组数值相近，但却是19.26 mg/m3处理组的1.3倍，这表明臭氧可以延缓苹果失重率的上升，并且浓度越高效果越好，这可能与果实的呼吸强度和果皮表面组织的气孔运动有关。气孔的运动方式可以调控植物体内的水分平衡，从而调控果实失重率。余泽龙[19]研究发现，臭氧处理可以影响气孔的开放与闭合，并且具有明显的浓度依赖性，臭氧抑制关闭气孔的浓度阈值要低于促进气孔关闭的阈值。
图2 臭氧处理对阿克苏苹果失重率的影响
Fig.2 Effects of ozone treatment on the weight loss rate of Aksu apple
2.3 不同浓度臭氧处理对贮藏期阿克苏苹果硬度的影响
在果实成熟过程中，随着细胞壁组分发生降解和细胞壁结构改变，果实硬度逐渐降低，出现软化现象，影响果实的外观品质和贮藏性。如图3所示，在整个贮藏期内，阿克苏苹果的硬度呈现不断下降的趋势。贮藏前期，硬度下降趋势明显，各处理组形成显著性差异(P<0.05)，这有可能与贮藏前期阿克苏苹果失重率变化较大有关。10 d后，随着贮藏时间的延长，下降幅度均逐渐降低，但与处理组相比，对照组下降幅度高于处理组。第38天时，19.26 mg/m3处理组硬度为15.442 kg/cm2，对照组硬度为11.923 kg/cm2，19.26 mg/m3处理组硬度显著高于对照组(P<0.05)。说明，臭氧处理能够抑制硬度的下降，其中19.26 mg/m3处理组效果最好，这可能与臭氧处理能够维持细胞膜、细胞壁结构完整，抑制细胞壁降解有关。HAN等[20]通过扫描电镜观察发现，臭氧处理组果实表皮结构平整，表面没有明显的裂痕和蜂窝状组织，维持了细胞形态的完整。肖玥惠子[21]研究发现，臭氧处理红地球葡萄可以抑制膜脂过氧化反应和多聚半乳糖醛酸酶活性，延缓果实硬度下降。
图3 臭氧处理对阿克苏苹果硬度的影响
Fig.3 Effects of ozone treatment on hardness of Aksu apple
2.4 不同浓度臭氧处理对贮藏期阿克苏苹果可滴定酸的影响
可滴定酸是果蔬风味的主要来源，同时也是果实呼吸代谢的底物[22]。从图4可以看出，阿克苏苹果的可滴定酸含量随着贮藏期的延长，整体呈现先上升后下降的趋势。贮藏前10 d，可滴定酸呈现上升趋势，第10天，0、2.14、10.7、19.26 mg/m3处理组可滴定酸含量分别为0.299%、0.337%、0.369%、0.382%，10 d后各处理组可滴定酸含量均呈下降趋势。在整个贮藏期间，处理组滴定酸含量始终高于对照组，这可能是因为臭氧处理抑制了果蔬的呼吸作用，从而延缓可滴定酸的下降速率。处理组中，19.26 mg/m3臭氧处理后的苹果可滴定酸含量最高。因此，19.26 mg/m3处理苹果有利于保持可滴定酸含量，提高阿克苏苹果的贮藏品质，这可能与臭氧浓度抑制果蔬能量代谢和可滴定酸参与合成酚类、酯类、氨基酸和芳香物质等有关。此外，CHEN等[23]研究发现，高浓度臭氧处理组与其他处理相比，柠檬酸合酶和苹果酸合酶蛋白表达量增加，有利于苹果酸和其他酸的形成。
图4 臭氧处理对阿克苏苹果可滴定酸的影响
Fig.4 Effects of ozone treatment on titratable acid of Aksu apple
2.5 不同浓度臭氧处理对贮藏期阿克苏苹果还原糖的影响
从图5可以看出，对照组一直处于下降趋势，而处理组的还原糖含量呈现先上升后下降的趋势。处理组在前10 d呈现上升趋势，第10天开始下降，刚开始下降迅速，之后渐渐趋于平缓，这可能是因为贮藏前期，阿克苏苹果内部的有机物质转化成了还原糖，从而导致含量有所增加，而还原糖含量下降的原因可能是与果实本身的呼吸作用和衰老有关[10]。贮藏过程中，19.26 mg/m3处理组下降幅度最小，最终含量显著高于其他处理组(P<0.05)，这表明臭氧处理苹果有助于抑制其还原糖的降解，19.26 mg/m3处理组的浓度为最适宜的臭氧浓度。这可能是因为臭氧可以抑制呼吸和乙烯释放，从而减少了还原糖的消耗。纪海鹏等[24]在使用臭氧处理美人指葡萄的研究中也发现，臭氧可以抑制还原糖含量的下降，提高果实的营养价值。
图5 臭氧处理对阿克苏苹果还原糖的影响
Fig.5 Effects of ozone treatment on reducing sugar of Aksu apple
2.6 不同浓度臭氧处理对贮藏期阿克苏苹果过氧化物酶活性的影响
过氧化物酶(peroxidase，POD)能够清除活性氧，与果蔬的许多生理过程都有着密切的关系，是存在于果蔬中的一种重要的防御酶之一，它能够参与活性氧代谢，清除超氧化物歧化酶与超氧阴离子反应产生的H2O2，破坏H2O2与超氧阴离子反应生成的羟自由基，延缓细胞衰老，降低膜脂过氧化程度[25]。如图6所示，在整个贮藏期中，POD活性呈现不断上升的趋势，处理组的酶活性始终高于对照组。这是因为果蔬在贮藏过程中除了会受到自身衰老的影响外，还有可能会被病原性微生物侵染，从而导致果蔬POD活性增加来抵御不良环境，延缓衰老。臭氧的强氧化性也会促使POD活性增加。前17 d POD活性增长迅速，之后增长幅度下降，这表明臭氧对POD活性增加的促进作用主要集中在贮藏前期。19.26 mg/m3处理组的POD活性在整个贮藏过程中一直保持在较高水平，第17天开始与对照组差异显著(P<0.05)。由此可知，19.26 mg/m3为最适臭氧贮藏浓度。
图6 臭氧处理对阿克苏苹果POD活性的影响
Fig.6 Effects of ozone treatment on peroxidase activity of Aksu apple
2.7 不同浓度臭氧处理对贮藏期阿克苏苹果多酚氧化酶活性的影响
多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是果蔬中常见的一种以酮为辅基的酶，它能够将多种酚类物质及其衍生物催化形成有色的聚合物，导致果蔬发生褐变[26]。如图7所示，PPO活性在贮藏期间持续下降，下降到一定值后，下降速度有所减缓。在整个贮藏过程中，前10 d PPO活性下降缓慢，各组之间没有显著性差异(P>0.05)，10 d后PPO活性下降幅度增大，24 d后下降渐渐趋于平缓。贮藏第38天时，0、2.14、10.70、19.26 mg/m3处理组PPO活性分别为0.175、0.142、0.129、0.120 ΔOD420/(min·g)，19.26 mg/m3处理组和对照组有显著性差异(P<0.05)。表明臭氧处理能够有效抑制PPO活性，延缓果肉氧化褐变进程。这与纪海鹏等[24]的研究结果相似。
图7 臭氧处理对阿克苏苹果PPO活性的影响
Fig.7 Effects of ozone treatment on the activity of polyphenol oxidase of Aksu apple
3 结论与讨论
果实贮藏过程中产生的乙烯可以介导果实的呼吸高峰，促进果实对可滴定酸、还原糖等呼吸底物的消耗，影响果实的成熟。结果表明，与对照组相比，臭氧处理可以抑制乙烯的释放速率，延缓阿克苏苹果的成熟衰老。这可能与臭氧可以直接清除乙烯，抑制与乙烯合成相关基因的表达有关[17]。
失重率和硬度与果实商品价值和品质密切相关。在采后贮藏期间，果实失重率上升，硬度下降，而臭氧处理可以延缓阿克苏苹果的这种变化趋势，其中，19.26 mg/m3处理组效果最好。这可能与臭氧可以调控果实的表面组织气孔的运动方式，降低呼吸作用和蒸腾作用，抑制果实表皮组织的降解等有关。伍小红等[27]使用臭氧水清洗红富士苹果10 min，晾干后在室温下放置35 d，发现臭氧可以抑制采后贮藏过程中硬度的下降。
随着果实贮藏时间的延长，果实需要消耗自身营养物质来满足呼吸代谢、糖代谢等生理代谢的需求。其中，果实可滴定酸和还原糖影响其风味和口感。本研究表明，臭氧处理可以抑制阿克苏苹果中还原糖和可滴定酸的降解，维持较好的品质。这与张慧杰等[22]的研究结果相似。
多种酶都与果实褐变有关，果皮褐变以酶促褐变为主，其中多酚氧化酶和过氧化物酶发挥着重要作用。过氧化物酶可以利用活性氧释放出酚类物质，导致果蔬褐变，臭氧处理能够促进过氧化物酶活性的升高，提高苹果的防御能力。多酚氧化酶是引起果蔬酶促褐变的主要内源性激素，随着果实的衰老，多酚氧化酶呈逐渐降低的趋势，而臭氧处理可以促进多酚氧化酶活性的下降，延缓褐变，维持果实品质。
综上所述，臭氧在苹果贮藏保鲜上具有一定的积极效果，可以提高其商业价值，本研究对其广泛应用于阿克苏苹果具有一定的借鉴意义。
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