肉类在运输，贮藏过程中因为微生物、蛋白质分解等发生腐败变质[1]，经验不足的消费者在购买产品时可能会难以分辨。人们需要对食品的新鲜程度和安全性有所了解，监测食品的新鲜度尤为重要。肉类腐败会产生挥发性氨类物质，使得包装顶空的pH值上升，利用此条件开发出响应肉类的新鲜度的材料，通常称为智能指示包装[2]。指示剂有化学合成色素和天然色素，但由于安全性问题，天然色素逐渐代替化学合成色素[3]。常用天然色素有花青素、姜黄素、甜菜红素、茜素[4-7]等。
茜素是从茜草植物中提取的醇溶性色素，是一类蒽醌类物质，常用作染料和染色剂。利用酸性显黄色，碱性显示紫色的特点，将其与固体载体混合已用于监测牛肉[8]，鳟鱼[7,9]的腐败程度，表明茜素可用于指示食品的新鲜度。
高分子药物载体系统被广泛用于生物医学领域，其具有可生物降解、相容性好、毒性低等特点[10]。在水溶液中嵌段共聚物通过分子间的氢键作用、疏水作用等弱非共价键作用，自组装形成具有核壳结构的胶束。亲水性部分形成壳结构，疏水性部分形成核结构，通过物理包埋、化学键作用等负载药物。聚乙二醇-聚己内酯[monomethoxyl poly(ethylene glycol)-poly(caprolactone)，MPEG-PCL]是常用于制备胶束的高分子材料，将农业杀菌剂异菌脲负载到MPEG-PCL中，能防止农药的光降解，并喷洒于收获前60 d的葡萄上，在采摘时发现与未处理组相比，葡萄的大小、还原糖含量等均得到提高[11]。
目前研究多为将各类色素混入膜中制成比色膜。若直接将色素加入成膜基质中，色素易受到外界因素影响而提前显色。而聚合物胶束通常将作为药物传输载体，使药物到达病灶部位后再被利用，能提高药物的利用率，对药物起到保护和防止提前释放的作用。基于此想法，本研究将聚合物胶束包埋疏水性色素，再与固体基质微晶纤维素制成比色片，保护色素的同时拓宽比色材料的范围，最后将比色片用于猪肉新鲜度的监测中。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜猪肉(里脊肉)，呼和浩特市东瓦窑批发市场；单羟基聚乙二醇[monomethoxyl poly(ethylene glycol)，MPEG](Mn=5 000)、茜素(97%)，Sigma-Aldrich试剂公司；ε-己内酯(ε-caprolactone，ε-CL)(纯度≥99.9%)，上海麦克林有限公司；辛酸亚锡Sn(Oct2)、二氯甲烷等(分析纯)，国药试剂有限公司；氧化镁、硼酸、溴甲酚绿、甲基红、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)等(分析纯)，罗恩试剂。
1.2 仪器与设备
IRAffinity-1红外光谱仪、UV-2450紫外可见分光光度计，日本岛津公司；Advance 2B核磁共振仪，德国Bruker公司；DSC-Q20差式扫描量热分析仪，美国TA公司；JEM-2100F透射电子显微镜，日本电子株式会社公司；PHS-3C pH计，上海雷磁仪器；LGJ-25C冷冻干燥机，北京四环有限公司；LHS-HC-I恒温恒湿箱，上海一恒有限公司；CR-20色差仪，日本柯尼卡；HC-2518R生物安全柜，青岛海尔特种电器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 MPEG-PCL的合成
根据SHUAI等[12]的方法，适当修改。三口烧瓶中加入引发剂MPEG(10 g)，100 ℃抽真空4 h除去残留水分。加入单体ε-CL(10 mL)和催化剂Sn(Oct2)(单体质量的千分之三)，置换4次氩气后120 ℃ 反应24 h。反应结束后降至室温，用二氯甲烷溶解，无水乙醚纯化，真空干燥至恒重，得到白色固体粉末，产率为92%。
1.3.2 pH响应性纳米球的制备
参考YANG等[13]的方法，适当修改。采用溶剂挥发法制备胶束，取100 mg聚合物与茜素(0、10、20 mg)溶解于20 mL丙酮中。缓慢滴加在100 mL超纯水中，搅拌过夜使丙酮挥发，形成1 mg/mL的胶束溶液。0.45 μm滤器过滤后冷冻干燥得到载药冻干粉，用PP、APP1、APP2表示。
1.3.3 材料的表征
1.3.3.1 核磁共振氢谱仪分析
将适量样品溶于氘代氯仿中，以四甲基硅烷作为内标物，在23 ℃，500 MHz频率下进行测试。
1.3.3.2 差示扫描量热分析
称取样品5～10 mg放于铝制样品盘中，在50 mL/min的N2保护下，以10 ℃/min升温速率，从25 ℃升温到100 ℃。
1.3.3.3 傅里叶变换红外光谱分析
称取干燥好的溴化钾100 mg与样品2 mg在研钵中充分研磨，通过压片机压片后进行测试，以纯溴化钾为背景。条件设置为分辨率4 cm-1，波数400～4 000 cm-1，扫描次数64次。
1.3.3.4 包封率及载药量
在丙酮中溶解不同剂量的茜素标准品，得到标准曲线。将冻干粉溶解于丙酮中，用紫外分光光度计记录417 nm处的吸光度代入标准曲线中。根据公式(1)和公式(2)计算得到包封率和载药量：
包封率
(1)
载药量
(2)
1.3.3.5 透射电镜观察
将胶束溶液滴在碳支持的铜网上，风干后用20 g/L 的磷钨酸溶液进行负染色，风干后在200 kV加速电压下观察胶束形貌。用Nano Measurer 1.2软件分析粒径。
1.3.3.6 颜色分析
将0.25 mL质量浓度为0.2 g/L的茜素乙醇溶液加入到pH 1～12的溶液中，用0.01 mol/L HCl或NaOH调节pH，用紫外分光光度计测定波长在350～750 nm内的吸收光谱。
1.3.4 猪肉的新鲜度的监测
1.3.4.1 比色片的制备及对挥发氨的响应
将10 mg胶束冻干粉APP1与30 mg微晶纤维素压成将直径为1.4 cm的圆片。比色片对挥发氨的响应测试参考CHEN等[5]的方法，适当修改。在100 mL锥形瓶中加入80 mL不同浓度氨水(0.08、0.16、0.64、0.8 mol/L)，将比色片置于液面上方4 cm处。以纯微晶纤维素片为对照组。在25 ℃下，每4 min，用色差仪测定L、a、b值，共计28 min，总色差ΔE计算如公式(3)所示：
(3)
式中：L、a、b为响应后的值，L0、a0、b0为初始值。
1.3.4.2 猪肉的应用
将新鲜里脊肉放于4 ℃冰箱中预冷2 h排酸。在生物安全柜中将猪肉切成每块约200 g，放于14 cm×14 cm的托盘中，用聚酰胺/聚乙烯袋包装，将比色指示片固定于袋内但不与肉接触，并用热封机封口，之后置于4 ℃的恒温恒湿箱中贮藏。用色差仪记录比色片的L，a，b值，公式(3)计算总色差ΔE。
1.3.4.3 理化指标测试
参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[14]中半微量定氮法测定挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen，TVB-N)；参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[15]测定菌落总数(total viable count，TVC)；参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》[16]测定pH；硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)的测定参考DONG等[17]的方法，适当修改，在25 mL的7.5%三氯乙酸(含0.1% 乙二胺四乙酸二钠)中加入5 g绞碎的肉样，搅拌30 min后过滤，将5 mL上清液与5 mL的0.02 mol/L的硫代巴比妥酸溶液混合，90 ℃水浴40 min后冷却1 h，1 600 r/min转速下离心5 min，将上清液与5 mL三氯甲烷混合，振摇静置分层，测定上清液在532 nm与600 nm处的吸光度，根据公式(4)计算TBARS的值：
(4)
1.4 统计分析
实验重复3组平行，使用SPSS 26分析数据，用平均值±标准差表示，ANOVA分析显著性(P<0.05)。
2 结果与分析
2.1 核磁氢谱分析
图1中，MPEG中δ3.38是甲氧基(—OCH3)上的氢原子，δ3.62对应亚甲基(—CH2)上的4个氢原子[13]。MPEG-PCL中δ4.06，δ2.31，δ1.64，δ1.36处分别是PCL嵌段中—OCH2—，—COCH2—，—CH2*CH2CH2*—，—CH2CH2*CH2—的上氢原子的振动峰[18]，根据己内酯和乙二醇单元上氢的积分面积比可计算得到嵌段聚合物的相对分子质量约为1.0×105，接近设定投料比。
图1 MPEG和MPEG-PCL共聚物的氢核磁共振图谱
Fig.1 1H NMR spectrum of MPEG and MPEG-PCL diblock polymers
2.2 差式扫描量热分析
由表1可知，MPEG的熔融温度(Tm)为64.5 ℃，熔融焓(ΔHm)为163.1 J/g。MPEG-PCL的熔融温度为57.2 ℃，熔融焓(ΔHm)为112.8 J/g。由图2可知，共聚物是一个大的熔融单峰，这是因为PCL嵌段与MPEG嵌段的熔融温度相近[19]，当己内酯单元/乙二醇单元比在0.5时，PEG与PCL链段长度接近，两组分之间的限制很小，也会出现单峰[20]，说明成功合成了MPEG-PCL共聚物。
图2 MPEG和MPEG-PCL共聚物的差式扫描量热曲线
Fig.2 DSC curves of MPEG and MPEG-PCL
表1 MPEG和MPEG-PCL的热学性能
Table 1 The thermal properties of MPEG and MPEG-PCL diblock polymers
样品Tm/℃ΔHm/(J·g-1)MPEG64.5163.1MPEG-PCL57.2112.8
2.3 透射电镜分析
聚合物在水中通过分子间氢键、疏水作用等自组装形成胶束，当用磷钨酸负染时，亲水外壳被染色，而疏水内核不被染色，故呈现出黑色的背景与亮白色的内核[18]。图3所示为胶束均呈现白色球状结构，未载茜素的胶束呈现较小颗粒，粒径为33.1 nm，负载茜素后胶束的粒径增大，APP1粒径为35.9 nm，APP2粒径为36.2 nm，粒径增大表明茜素已成功负载[11]。
a-PP；b-APP1；c-APP2
图3 胶束PP、APP1和APP2的透射电镜图
Fig.3 TEM images of the PP,APP1 and APP2 micelles
2.4 包封率及载药量
由表2可知，纯胶束PP无包封率及载药量，负载茜素后，胶束APP1的包封率为5.2%，载药量为0.49%，APP2的包封率为2.7%，载药量为0.26%。包封率与载药量没有随投料比的提高而提高。聚合物质量与药物质量的比例对包封率和载药效果有一定的影响，药物添加量多会使聚合物和药物之间出现凝聚体，从而不能形成稳定的胶束[21]，使包封率降低。胶束包封难溶性药物有多种作用方式，当药物分子与疏水段的相容性差时，包封率与载药量会降低，当聚合物的相对分子质量小时，包封率与载药量也会下降[22]。这与邱笛[23]将肝素包埋于不同分子质量的PLLA-PEG-PLLA微球中现象一致。
表2 胶束的包封率及载药量
Table 2 Durg-loading efficiency and drug-loading content of micelles
样品包封率/%载药量/%PP --APP15.20.49APP22.70.26
注：-表示未包埋
2.5 红外光谱分析
由图4可知，纯MPEG中2 889 cm-1处出现的宽峰和1 105 cm-1处的峰归因于亚甲基(—CH2—)的伸缩振动峰与C—O键伸缩振动峰[24]。MPEG-PCL中2 945 cm-1和2 895 cm-1处的峰归因于亚甲基(—CH2—)的伸缩振动峰，1 724 cm-1处有很强的PCL中羰基(C
O)的伸缩振动的特征峰，1 188、1 105 cm-1是C—O的伸缩振动峰[25]。茜素中3 340 cm-1处的宽峰归因于O—H键的伸缩振动峰；1 662 cm-1和1 633 cm-1处的峰归因于10号和9号位置上的羰基(CO)伸缩振动峰；苯环上碳碳双键(CC)的伸缩振动峰出现在1 587 cm-1和1 452 cm-1处；羟基(—OH)弯曲振动峰出现在1 330 cm-1处；C—O键伸缩振动峰出现在1 288 cm-1处；蒽骨架C—C间的伸缩振动峰出现在1 195 cm-1处[26]。对于APP来说只能看到聚合物的特征峰，而看不到茜素的特征峰，这可能是由于包封率低，茜素含量少所致。为验证茜素是否包埋于胶束中，按照实际包封率的量将茜素与聚合物物理共混于一起，研磨均匀测试，同样只能看到聚合物的特征峰，而没有茜素的特征峰，也表明茜素包埋于聚合物中。
图4 MPEG、MPEG-PCL、茜素、APP及混合的红外光谱图
Fig.4 FTIR spectrum of MPEG、MPEG-PCL、Alizarin、APP and physical blend
2.6 茜素的颜色响应及比色片对挥发氨的响应
茜素是一种蒽醌类物质，酚羟基的供电子性能会随着pH值增加而阴离子化增强，其颜色会逐渐加深。如图5-a所示，在酸性溶液(pH 2～6)中，颜色由黄色变为橘色，pH 7～8为橘红色，pH 9为浅粉色，pH 10～11为紫红色，pH 12为紫色。茜素在不同pH溶液中颜色变化明显，具有pH响应能力。如图5-b所示，随着pH的增加，其最大吸收峰向更长的波长移动。pH为2时，最大吸收峰在430 nm处，pH增加时，羟基上的负电荷发生离域，导致吸收峰强度降低[27]。pH为6时，羟基去质子化导致共振效应产生，使得波长427 nm红移至538 nm，碱性溶液(pH 8～12)中，吸收峰位置基本没变化，但强度会有所增加，这是由于羟基第二次去质子导致的[28]。CHEN等[29]也报道了茜素的吸收波长会随着pH的增加而发生红移，羟基上的质子在分子内氢键作用下发生转移，使颜色发生变化。
a-颜色变化；b-紫外吸收光谱
图5 茜素在pH 2～12溶液中的颜色变化、紫外吸收光谱图
Fig.5 Visible color UV-vis spectrum of alizarin solution at pH 2-12
肉类在腐败中有挥发性含氮化合物的释放，通常用氨气来模拟。响应机制为NH3与H2O结合，水解后生成OH-与
使比色片处于碱性的环境中，碱性条件下茜素发生颜色变化。一般来说，当ΔE>5时，颜色变化肉眼可见[8]。CK组为纯微晶纤维素片在0.8 mol/L浓度下测试的，由图6-a可知，在响应28 min后ΔE为1.43，说明微晶纤维素自身不具备响应功能，响应前后均为白色。加入胶束冻干粉制作比色片后，0.08 mol/L浓度响应4 min时ΔE为4.26，之后一直上升，28 min时ΔE为11.47，这是由于茜素在受到碱性刺激下颜色发生变化使得ΔE上升，由图6-b可看出响应前为棕色，响应后为紫红色。0.16 mol/L浓度响应4 min时ΔE为6.48，20 min后变化趋势平缓，28 min时ΔE为12.15。0.64、0.80 mol/L浓度响应4 min时ΔE为8.12与9.4。与0.80 mol/L浓度的氨水相比，0.64 mol/L浓度为此样品颜色变化的最大浓度，所以两者变化趋势相同，28 min时ΔE为16.80和17.15。EZATI等[7]也报道了茜素纤维素指示膜对氨气有高灵敏度。以上结果表明制备的比色片对氨气也具有响应性能，具有用于肉类食品新鲜度监测的潜力。
a-比色片的总色差；b-实物图
图6 不同氨浓度下响应的比色片的总色差、实物图
Fig.6 Total colour difference (ΔE) of colorimetric tablets after exposure to different concentrations NH3,reaction graph
2.7 猪肉新鲜度的监测
通常评价猪肉新鲜程度的指标有pH、TVC与TVB-N等。pH评价标准：5.6≤新鲜肉≤6.2，6.3≤次鲜肉≤6.6，腐败肉>6.7；TVC评价标准：新鲜肉<4 lgCFU/g，次鲜肉4 lgCFU/g～6 lgCFU/g，腐败肉>6 lgCFU/g；TVB-N评价标准：新鲜肉<15 mg/100g，次鲜肉15～20 mg/100g，腐败肉>20 mg/100g[30]。表3是猪肉贮藏期间各项指标变化。初始pH为6.14，新鲜状态;贮藏2 d时pH上升到6.59，为次新鲜状态;4 d时达到6.71，超过腐败值6.7，pH的上升是因为猪肉在细菌和酶的作用下，蛋白质与氨基酸被分解，产生胺类等碱性含氮化合物，碱性物质逐步增多，肉的pH上升也越快。TVC反映食品被微生物污染的程度，虽初始TVC<4处于新鲜程度，但被微生物污染程度较高，会缩短贮藏时间，贮藏2 d时TVC为5.27 lgCFU/g，处于次新鲜状态，贮藏4 d时TVC为6.23 lgCFU/g已经腐败。TVB-N为肉类食品是否新鲜的一个重要理化指标。TVB-N的上升也是因为碱性含氮化合物的产生及积累，初始TVB-N为11.9 mg/100g属于新鲜级，贮藏2 d时为16.6 mg/100g为次新鲜级，贮藏4 d时为23.1 mg/100g，已经腐败。肉类在贮藏中会发生自由基链式反应，从而生成醛酮类等物质，产生令人不愉快的气味，一般用TBARS值表示脂肪氧化的程度。通常认为TBARS>1 mg/kg时，会出现酸味，为变质肉[31]，初始TBARS为0.28 mg/kg，猪肉新鲜，贮藏时间延长，TBARS显著上升，第4天时，为1.18 mg/kg，超过1 mg/kg的阈值，猪肉腐败变质。
表3 猪肉贮藏期间pH、TVC、TVB-N和TBARS的变化
Table 3 The changes of pH,TVC,TVB-N and TBARS in pork during storage
贮藏时间/dpHTVC(lgCFU/g)TVB-N/[mg·(100g)-1]TBARS/(mg·kg-1)06.14±0.03c3.94±0.04c11.9±0.3c0.28±0.02c26.59±0.03b5.27±0.07b16.6±0.6b0.65±0.08b46.71±0.05a6.23±0.05a23.1±1.6a1.18±0.09a
注：表中组间不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
比色片在贮藏期间L，a，b值及ΔE的变化如表4所示，L值为亮度，随贮藏时间延长亮度显著下降。a值为红绿值，随贮藏时间延长a值显著上升，即红色加深。b值为黄蓝值，随贮藏时间延长b值显著下降，即蓝色加深。而红色与蓝色组合为紫色，由图7中也能看出比色片颜色有很明显的变化，从棕色变为紫色。从ΔE变化可知，在贮藏第2天时，ΔE为3.0，此时猪肉指标pH、TVC与TVB-N均在次鲜肉范围内，TBARS也未超过腐败肉的值。在贮藏第4天时，ΔE为7.1超过5，比色片颜色变化肉眼可见，此时猪肉指标pH、TVC、TVB-N与TBARS均超过腐败值，猪肉腐败变质。比色片的颜色变化表示猪肉从新鲜肉变为腐败肉，表明可用ΔE的变化表示猪肉的新鲜程度，即棕色为新鲜肉，紫色为腐败肉。之前也有研究表明当鳟鱼和牛肉腐败时，含茜素的智能指示膜均可以从黄色或棕色变为紫色[7-9]。
表4 比色片在贮藏期间的L、a、b和ΔE变化
Table 4 The changes of L,a,b and ΔE values of colorimetric tablets during storage
贮藏时间/dLabΔE049.9±0.3a6.8±0.3c9.0±0.4a0c247.7±0.6b8.0±0.4b7.4±0.6b3.0±0.6b445.4±1.1c11.0±1.1a5.9±1.2c7.1±1.0a
图7 猪肉贮藏0 d及4 d的肉与比色片的变化图
Fig.7 Changes of meat and colorimetric tablets of pork stored for 0 and 4 days
进一步对比色片ΔE与新鲜度指标之间的关系进行相关性分析。由表5可知，比色片的ΔE与pH、TVC、TVB-N和TBARS均呈显著正相关(P<0.01)，相关系数分别为0.905、0.966、0.987和0.979，均呈较高的相关性。以上结果表明，比色片的ΔE能作为肉类新鲜度评定的指标。
表5 猪肉贮藏期间ΔE、pH、TVC、TVB-N和TBARS的相关性分析
Table 5 Correlation analysis of ΔE,pH,TVC,TVB-N and TBARS of pork during storage
指标ΔEpHTVCTVB-NTBARSΔE1pH0.905∗∗1TVC0.966∗∗0.971∗∗1TVB-N0.987∗∗0.917∗∗0.974∗∗1TBARS0.979∗∗0.912∗∗0.975∗∗0.998∗∗1
注：**表示在0.01水平上显著相关
3 结论
使用溶剂挥发法将茜素包埋于MPEG-PCL胶束中，冻干后与微晶纤维素压片制备成比色指示片。氢核磁共振、红外光谱表明MPEG-PCL的合成，透射电镜表明胶束的形成，同时比色片对不同浓度氨气均表现出响应能力。应用于猪肉上时，当猪肉腐败，比色指示片从棕色变为紫色，ΔE与理化指标pH、TVC、TVB-N和TBARS呈显著相关。结果表明比色指示片在监测肉类新鲜度方面具有应用前景，同时为智能指标包装提供新的思路。
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