紫山药(Dioscrorea alata L.)是山药的一种，具有养胃润肺、益肾健脾等功效，是一种药食两用植物[1]。紫山药含有多糖、花青素、薯蓣皂苷、尿囊素、多酚等活性成分，具有抗氧化、延缓衰老、降血糖、降血脂等功能，这些功能与其生物活性物质密切相关[2-4]。
抑制α-葡萄糖苷酶的活性是防治糖尿病的有效手段，通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性，可以防止餐后血糖水平升高[5]。KWON等[6]研究发现，从茄子里提取的酚类物质具有抑制糖代谢相关酶活性的作用。LES等[7]发现石榴汁中的酚类物质具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性。GUO等[8]研究发现，紫山药乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用。因此，分离纯化紫山药多酚，并研究其α-葡萄糖苷酶抑制活性，对明确紫山药多酚的降血糖作用具有重要意义。
大孔树脂具备较强的选择性和吸附性能，使用成本低，受杂质及酸碱的影响较小，性质稳定再生能力强，在天然活性成分的分离纯化方面得到了广泛应用[9]。不同的植物所含的酚类物质性质不同，不同树脂的极性、颗粒大小和比表面积均能影响其对酚类物质纯化的效果，所以，选择适宜的树脂至关重要[10]。近年来，大孔树脂在植物多酚分离纯化方面的研究已有大量文献报道，且取得了良好的效果[11-12]。ZHANG等[13]利用离子液体协同超声提取紫山药多酚，取得了良好的提取效率。大孔树脂分离纯化紫山药多酚尚未见报道。
本文探讨了大孔树脂对紫山药多酚的分离纯化效果，利用不同洗脱剂获得不同洗脱组分，比较不同洗脱组分的α-葡萄糖苷酶抑制活性，并分析多酚的组成，研究结果为阐明紫山药酚类物质的降血糖活性提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
紫山药产自广州增城县；D4006、AB-8、D101、ADS-7、NKA-9型大孔树脂，郑州和成新材料科技有限公司；α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside,pNPG)，分析纯，Amresco 公司；各种酚类物质标准品均为色谱纯，Sigma公司其余试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
DHL-B型电脑恒流泵，上海青浦沪西仪器厂；BSZ-100型自动部分收集器，上海琪特分析仪器有限公司；RE52-AA型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；JC-LDGZ-12S型冷冻干燥机，青岛聚创环保有限公司；LC-20A型高效液相色谱仪，日本岛津公司。
1.3 试验方法
1.3.1 紫山药粗多酚的制备
将紫山药洗涤后，切片冷冻干燥，研磨成粉末后过100目筛备用。取100 g紫山药粉于10 L提取罐中，加入7 L蒸馏水，60 ℃条件下浸提2.5 h，过滤去渣后将溶液浓缩至100 mL，加入400 mL无水乙醇，放入4 ℃冰箱内静置24 h后过滤除去絮状沉淀，收集滤液浓缩后，置于冷冻干燥机内干燥48 h，得到紫山药粗多酚备用。
1.3.2 大孔树脂的筛选
大孔树脂预处理和筛选参考杨希娟等[12]的方法略作修改，将一定量的大孔树脂预处理后风干备用，称取5种大孔树脂各1 g，置于5个250 mL的三角瓶中，分别加入200 mL、0.91 g/L的紫山药粗多酚溶液，在室温下于120 r/min振荡12 h后，测定多酚浓度，过滤取出吸附饱和的树脂，放入5个250 mL三角瓶中，分别加入50%的乙醇溶液200 mL，振荡解吸12 h后测定多酚浓度。根据公式(1)和公式(2)分别计算树脂的吸附率和解吸率[14]。
吸附率
(1)
解吸率
(2)
式中：C0，吸附前溶液中多酚质量浓度，g/L；C1，吸附平衡后溶液中剩余多酚的质量浓度，g/L；C2，解吸平衡后溶液中多酚的质量浓度，g/L。
1.3.3 AB-8树脂静态吸附-解吸试验
1.3.3.1 吸附时间确定
准确称取AB-8树脂1 g，放入5个250 mL的三角瓶中，分别加入200 mL、2.0 g/L的紫山药粗多酚溶液。在室温下于120 r/min下振荡，每隔1 h测定各三角瓶中溶液多酚浓度，计算吸附率。
1.3.3.2 多酚浓度对大孔树脂吸附率的影响
参考巫永华等[14]的方法略作修改，准确称取6份AB-8树脂各1 g，将其放入6个250 mL的三角瓶中，加入200 mL质量浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L 的紫山药粗多酚溶液，在室温下于120 r/min下振荡4 h，测定各三角瓶中溶液多酚浓度，计算吸附率。
1.3.3.3 pH值对吸附率的影响
准确称取7份AB-8树脂各1 g，分别放入7个250 mL的三角瓶中，分别加入200 mL、2.0 g/L的不同pH值的紫山药粗多酚溶液(pH= 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)，在室温下于120 r/min振荡4 h，测定各三角瓶中溶液多酚浓度，计算吸附率。
1.3.3.4 乙醇浓度对解吸率的影响
参考巫永华等[14]的方法略作修改，准确称取8份AB-8树脂各1 g，放入8个250 mL的三角瓶中，分别加入200 mL、2.0 g/L 的紫山药粗多酚溶液，在室温下于120 r/min下振荡4 h，测定各三角瓶中溶液多酚浓度，抽滤取出树脂后，再放入8个250 mL的三角瓶中，分别加入20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液200 mL，振荡解吸12 h后，测定各三角瓶中溶液多酚浓度，计算解吸率。
1.3.4 AB-8树脂动态吸附-解吸试验
1.3.4.1 上样流速对树脂吸附效果的影响
将适量的AB-8大孔树脂湿法填充入25 mm×300 mm的色谱柱中，用蒸馏水冲压至平衡无气泡。用质量浓度为2.0 g/L的紫山药粗多酚，分别以0.5、1.0、1.5 mL/min的流速进行上样，底部收集流出液，自动收集器设定每管5 mL，每管吸取0.1 mL溶液测定其多酚的浓度。
1.3.4.2 洗脱流速对解吸率的影响
大孔树脂吸附饱和后，以50%(体积分数)的乙醇为洗脱剂，分别以0.6、1.2、1.8 mL/min的流速洗脱，底部收集流出液，自动收集器设定每管5 mL，每管吸取0.1 mL溶液测定其多酚的浓度。
1.3.5 总酚含量的测定
参考LUENGO[15]的方法略作修改。配制质量浓度为0.10 g/L的没食子酸标准液，绘制标准曲线，其回归方程为y=0.792 6x+0.009 4，R2=0.999 4。测定样品中多酚含量时，按照作标准曲线的方法进行操作，根据回归方程计算样品中多酚浓度。
1.3.6 α-葡萄糖苷酶的抑制活性测定
参照GHANI等[16]的方法略作修改，具体如下：96微孔板反应体系中加入40 μL的α-葡萄糖苷酶溶液，然后加入不同待测样品40 μL，置于37 ℃的恒温水浴锅中反应10 min，再加入pNPG溶液40 μL，然后恒温孵育30 min，再加入120 μL 0.2 mol/L的碳酸钠溶液终止反应，于405 nm处检测吸光度值，计算其IC50。
酶活性抑制率
(3)
式中：A0，酶与底物反应后的吸光值；A1，加入样品后酶与底物反应的吸光值；A2，样品自身吸光值。
1.3.7 不同洗脱剂洗脱组分的α-葡萄糖苷酶的抑制活性
分别用50%的乙醇、三氯甲烷和乙酸乙酯作为洗脱剂，洗脱饱和吸附紫山药粗多酚的树脂柱，收集不同的洗脱组分，分别测定不同洗脱组分的α-葡萄糖苷酶活性抑制率，以阿卡波糖为阳性对照，以粗多酚作为阴性对照。
1.3.8 高效液相色谱法分析紫山药多酚单酚成分
准确称取一定量的儿茶素、山奈酚、槲皮素、芦丁、没食子酸、表儿茶素、阿魏酸、绿原酸、咖啡酸标准品，用甲醇配制成质量浓度为0.4 g/L的单一标准液，各取200 μL混合，再用0.22 μm滤膜过滤后用于HPLC检测。
分析条件：依利特 C18色谱柱(100 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：30 ℃，紫外检测波长280 nm，进样量：10 μL，流速：1.0 mL/min。流动相梯度洗脱程序：A:甲醇；B：0.1%冰乙酸；流动相梯度：0 min(85%B)，10 min(75%B)，25 min(65%B)，35 min(55%B)，60 min(5%B)。
1.4 数据处理
试验数据采用SPSS 21.0进行分析，采用Origin 2019b制图。做3次平行测定，结果以平均值±标准差(x±SD)表示。
2 结果与分析
2.1 最佳树脂的筛选
由图1可知，不同的树脂对紫山药多酚的吸附能力差异较大，NKA-9吸附率最高，为77.3%，而AB-8吸附率为72.2%，二者差异不明显(P>0.05)，D101吸附率最低，仅为52.2%。从解吸效果上看，D101解吸率最高，为89.6%，AB-8的解吸率为87.7%，二者差异不明显(P>0.05)，D4006解吸率最低，为69.3%。不同的大孔树脂由于其极性、比表面积和孔径等不同，对天然产物会表现出不同的吸附和解吸性能[14]。NKA-9具有较高的吸附率，但解吸率较低。D101解吸率高，但吸附率较低。综合比较考虑，AB-8树脂保持了较高的吸附率，同时又具有较高的解吸率。所以，选择AB-8树脂分离纯化紫山药多酚较为合适。
图1 五种大孔树脂的吸附-解吸效果比较
Fig.1 Comparison of adsorption and desorption properties of five resins
注：不同字母表示组间差异显著(P<0.05)(下同)
2.2 静态吸附、解吸试验结果
2.2.1 AB-8树脂的静态吸附曲线
由图2可知，在AB-8大孔树脂吸附紫山药多酚的过程中，吸附时间小于4 h时，吸附率与吸附时间呈明显的正相关性。但当吸附时间超过4 h，吸附率的增加放缓，这是由于树脂对于紫山药多酚的吸附接近饱和状态。因此，选定AB-8树脂对于紫山药多酚的静态吸附时间为4 h，此时吸附率为85.43%。
图2 AB-8树脂静态吸附曲线
Fig.2 Static adsorption curve of AB-8 resin
2.2.2 样品浓度对AB-8树脂吸附率的影响
由图3可知，在质量浓度低于2.0 g/L时，紫山药多酚质量浓度与吸附率呈正相关，质量浓度为2.0 g/L时吸附率最大，浓度继续增大，吸附率有所降低。在一定质量浓度范围内，浓度增加有利于酚类物质分子与树脂的接触，提高树脂的吸附率，但是浓度过高溶液黏度增加，流动性降低，且体系中相关杂质也会增加，不利于酚类物质与树脂的接触，从而降低了吸附率[17]。因此，选择多酚质量浓度为2.0 g/L作为分离纯化的上样浓度，此时吸附率为89.33%。
图3 样品浓度对AB-8树脂吸附率的影响
Fig.3 Effect of sample concentration on adsorption rate of AB-8 resin
2.2.3 样品溶液pH对AB-8树脂吸附率的影响
由图4可知，溶液的pH值为2～5时，AB-8树脂对紫山药多酚的吸附率与溶液的pH值呈正相关，样品液的pH值为5时吸附率最高，此时吸附率为91.97%。当pH继续升高时，吸附率反而降低。多酚是一类含有羟基的化合物，pH的大小直接影响酚类物质在溶液中的状态[18]。紫山药多酚溶液在弱酸性环境下较稳定，有利于AB-8树脂对酚类物质的吸附，当溶液酸性减弱时，更多的酚羟基电离，致使酚类物质与大孔树脂间的作用减弱，从而降低了大孔树脂对多酚的吸附能力，导致吸附率降低[19]。
图4 pH值对AB-8树脂吸附率的影响
Fig.4 Effects of pH value on absorption rate of AB-8 resin
2.2.4 乙醇浓度对解吸率的影响
由图5可知，乙醇体积分数为20%～90%时，解吸率呈现先增后降的趋势，当乙醇的体积分数为50%时，其对紫山药多酚的解吸率最大，为87.7%。乙醇水溶液对多酚的解吸率与其极性有关，随着乙醇浓度的增大，其极性降低，当乙醇体积分数为50%时，紫山药中酚类物质的极性可能与此时溶液的极性更相近，更多的酚类物质被解吸下来。因此，选择50%的乙醇作为解吸剂较为适宜。
图5 乙醇体积分数对AB-8树脂解吸率的影响
Fig.5 Effect of ethanol volume fraction on desorption rate of AB-8 resin
2.3 动态吸附-解吸试验结果
2.3.1 动态吸附曲线
由图6可知，上样流速对AB-8树脂吸附有较大影响，随着样品流速的增大，泄漏点出现的时间越早，树脂的吸附量越少，这个可能与流速过大会导致吸附的多酚重新被洗脱下来有关[20]。当样品流速分别为0.5、1.0、1.5 mL/min时，泄露点分别在110、80、40 mL时出现，此时的吸附量分别为198、144、72 mg。试验结果表明，上样流速越慢，树脂吸附的多酚越多，为了提高整个树脂吸附效率，缩短分离纯化时间，上样流速为1.0 mL/min较为适宜。
图6 上样流速对吸附效果的影响
Fig.6 Effect of loading velocity on adsorption
2.3.2 动态洗脱曲线
由图7可知，洗脱速度为0.6 mL/min时，洗脱液的浓度峰值出现在第4管，酚类物质主要集中在1～12管；而流速为1.2、1.8 mL/min时，洗脱液的浓度峰值均在第6管，但后者的洗脱液浓度峰值较低，酚类物质分别集中在1～14管与1～17管，由此可见，以流速为1.2 mL/min洗脱时，酚类物质洗脱的较为集中且耗时短。一般来说，洗脱液的流速慢有利于洗脱剂与树脂上的多酚接触从而充分解吸，但如果流速过慢，会导致解吸的时间过长，流动过程中一些被洗脱下来的多酚可能会被重新吸附[21]，而洗脱液的流速过快时，会导致洗脱剂与树脂接触时间过短，洗脱剂不能充分解吸多酚，拖尾现象严重，降低生产效率[21]。因此，选择1.2 mL/min的洗脱流速较为适宜，在此条件下，洗脱液体积为104 mL，多酚回收率为72.7%，多酚纯度由13.91%提升到59.06%，纯度提高了3.25倍。
图7 洗脱流速对解吸效果的影响
Fig.7 Effect of elution velocity on desorption
2.4 不同溶剂洗脱组分对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用
α-葡萄糖苷酶是一种重要的碳水化合物水解酶，抑制α-葡萄糖苷酶的活性能有效减少碳水化合物的水解，降低肠道对葡萄糖的吸收，从而降低血糖浓度，对于治疗和预防糖尿病具有重要的意义[22]。分别用50%乙醇、乙酸乙酯和三氯甲烷作为洗脱剂，获得了3种洗脱组分，测定了其对α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果。结果如图8所示，在一定的质量浓度范围内，样品浓度与α-葡萄糖苷酶的抑制率呈正相关，但不同洗脱溶剂洗下来的多酚组分对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用差异较大，由图8可知，乙酸乙酯洗脱组分>50%乙醇洗脱组分>三氯甲烷洗脱组分。由表1可知，乙酸乙酯洗脱组分对α-葡萄糖苷酶的抑制活性的IC50值最小，为0.126 g/L，50%乙醇的IC50值为0.216 g/L，而三氯甲烷的IC50值为14.69 g/L。由此可见，乙酸乙酯洗脱组分中含有较多的抑制α-葡萄糖苷酶活性的成分。
图8 不同溶剂洗脱物的α-葡萄糖苷酶的抑制能力
Fig.8 The α-glucosidase inhibition ability of eluted fractions with different solvents
表1 不同洗脱组分的α-葡萄糖苷酶活性抑制比较(IC50值)
Table 1 Comparison of α-glucosidase inhibition of eluted fractions with different solvents (IC50value)
样品阿卡波糖粗多酚50%乙醇洗脱组分乙酸乙酯洗脱组分三氯甲烷洗脱组分IC50值/(g·L-1)0.141±0.0051.68±0.1490.216±0.0230.126±0.01914.69±0.710
2.5 紫山药多酚不同洗脱组分分析
由图9可知，与标准品图谱对照，50%乙醇洗脱组分主要含有儿茶素、咖啡酸、表儿茶素、阿魏酸、芦丁和槲皮素；乙酸乙酯洗脱物中主要含有绿原酸、表儿茶素、阿魏酸、芦丁和槲皮素；三氯甲烷含有没食子酸，其他未知。有研究表明，绿原酸[23]、槲皮素[24]、芦丁等具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，且芦丁[25]对α-葡萄糖苷酶的抑制作用较强，这与实验得出的乙酸乙酯洗脱组分具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性相一致。
1-没食子酸；2-儿茶素；3-绿原酸；4-咖啡酸；5-表儿茶素；6-阿魏酸；7-芦丁；8-槲皮素；9-山奈酚
a-标准品；b-50%乙醇洗脱物；c-乙酸乙酯洗脱物；d-三氯甲烷洗脱物
图9 标准品和不同洗脱组分的高效液相色谱图
Fig.9 The HPLC results of polyphenols standard,and eluted fractions with different solvents
3 结论
(1)AB-8大孔树脂较适于紫山药多酚分离纯化，其分离纯化工艺为：静态吸附4 h，溶液pH为5.0，上样质量浓度为2.0 g/L，上样流速为1.0 mL/min；用50%(体积分数)的乙醇作为洗脱剂，在流速为1.2 mL/min时洗脱，收集洗脱液体积104 mL，此时多酚回收率为72.7%，多酚纯度由13.91%提升到了59.06%，纯度提高了3.25倍。
(2)比较了50%(体积分数)乙醇、乙酸乙酯和三氯甲烷洗脱组分的α-葡萄糖苷酶抑制活性，乙酸乙酯洗脱组分具有最强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其抑制率达到91.92%，经高效液相色谱分析其主要含有芦丁、绿原酸、表儿茶素、阿魏酸和槲皮素，试验结果为紫山药多酚降血糖的研究提供了基础数据，后续研究进一步分离单组分，采用质谱、核磁共振对其结构进行鉴定，明确其功能。
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